הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Summary

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

Abstract

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Introduction

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protocol

1. נטרול, דילול פלמור של פתרונות קולגן לחקירת 3D מבחני התכווצות סלולארית

1. על הקרח ברדס רקמה סטרילית תרבות, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 HEPES מ"מ סטרילי, קר כקרח PBS 2x, pH 7.4, צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבבים היטב עם פיפטה פלסטיק עד הפתרון הוא הומוגני מערבולות ערבוב אינן גלויות. היזהר לא להכניס בועות אוויר במהלך תהליך הערבוב. אחסן בקצרה על קרח.
2. לדלל קולגן מנוטרל לריכוז המתאים עם התקשורת תא (כגון RPMI, DMEM, וכו ').
   1. כדי לחשב את כמות הקולגן לנטרל נדרש לפצות ריכוז הקולגן הרצוי, השתמש המשוואה N = (D * V) / (S / 2), כאשר N הוא כמות הקולגן לנטרל נדרש, D הוא ריכוז הקולגן הרצוי, V הוא הנפח הסופי של ריכוז הקולגן הרצוי, ו- S הוא tהוא החל ריכוז קולגן המניות.
   2. להעלות את כמות הקולגן לנטרל עד נפח על ידי התוספת של פתרון תקשורת תא ותא. מערבבים היטב ולאחסן על הקרח עד ומוכן להעברה.
      1. דוגמה: עבור ג'ל 2 מ"ג / מ"ל ​​בנפח ג'ל 1 מ"ל (נפח אופייני בגבס ג'ל בצלחת 6 היטב או 50 צלחת מ"מ זכוכית התחתונה), הראשון להכפיל את הריכוז הרצוי (2 מ"ג / מ"ל) על פי היקף הסופי הרצוי (1 מ"ל). קח את המספר הזה (2 מ"ג) ולחלק אותו בחצי של ריכוז המניות הרשומים על הבקבוק (9.49 מ"ג / מ"ל). במקרה זה, 0.42 מ"ל של קולגן לנטרל מדולל 0.58 מ"ל של תערובת מדיה / תא.
3. Pipet קולגן / תא קר כקרח / מדיה התערובת לתוך או תרבות שאינם רקמות שטופלו 6-גם צלחת או צלחת תחתית זכוכית 50 מ"מ. השתמש טיפ pipet להתפזר הפתרון באופן שווה.
   הערה: חשוב להשתמש לתרבות הלא-רקמות שטופלו צלחת כדי למזער את הקובץ המצורף או צמיחה של תאים מחוץ collagen ג'ל.
4. אפשר לפלמר בטמפרטורת החדר למשך כ 10 - 15 דקות. הג'לים צריכים לפנות אטומים על פילמור.
5. אחרי זה הפך אטום, להעביר צלחת או צלחת ל -37 צלזיוס למשך נוספות 45 - דקות 60 כדי לסיים פילמור.
6. אחרי 45 - 60 דקות, להוסיף 2 - 3 מ"ל של התקשורת ולשחרר ג'לים מן הצדדים של הבאר-ידי הפעלת טיפ p200 pipet סביב ההיקף של טוב או צלחת. צלחת מערבולת בעדינות כדי לשחרר את הג'ל. ג'ל קולגן צריך להיות צף בתקשורת.

2. המערבי סופג, תא המורפוגנזה וג'ל Gontractility Assay

1. כדי להעריך את רמות החלבון, מורפולוגיה או התכווצות הסלולר ביחס ECM נוקשות, להתחיל לשפוך ג'ל קולגן, על פי ל -1.1 - 1.6, זורעים עם תאים עבור 7 - assay יום 10. לקבוע כל שיעור זריעת תאי קו בהתאם אמפירי על שיעור צמיחה ואת confluency. עבור assay 10 יום, צפיפות הזריעה יכולה לנוע בין 20,000 - 100,000 תאים / ג'ל.
2. כדי למדודהתכווצות תא, למדוד את קוטר ג'ל באמצעות סרגל או מצלמה כל 24 שעות או על מרווח הזמן המתאים.
   הערה: בנוסף, תמונות מקבילות שנאספו מיקרוסקופ ניתן לבדוק עבור מאפיין תכונות מורפולוגיות של הקו הסלולרי זורע בתוך הג'ל, כגון מבני acini דמוי, tubules אפיתל, בליטות הסלולר, lameliapodia.
3. כדי להעריך את רמות החלבון, lyse הג'לים ב Ripa חיץ תהליך לניתוח כתם המערבי של חלבונים בעלי עניין כמתואר ווזניאק et al. ¹⁷ ו גלאגר et al. ^18.
   1. חשוב: השוואות של התכווצות בין שורות תאים, לנרמל contractility ל- DNA הכולל, אשר יכול להיות מופק הג'לים כפי שתואר על ידי לואי, et al ^19, או לחלבון משתנה, משק בית (היסטונים, GAPDH, וכו ') על ידי המערב. ניתוח כתם, כמתואר ווזניאק et al. ¹⁷ ו גלאגר et al. ¹⁸. אם תאים לספור בתוך הג'ל באמצעות hemocytometer, לוודא לנרמל מספר הסלולרי לאזור ג'ל ליום הג'ל קבלנות יתרכז תאים.
4. ג'לים Feed כל 3 - 4 ימים על ידי הסרת 1 מיליליטר של תקשורת והחלפתו 1 מיליליטר של תקשורת הטריה. הקפד להאכיל ג'לים אחרי המדידה נלקחת כמו תוספת של / סרום התקשורת טרי תגרום לעליה חדה במספר התכווצות.

דור 3. PDMS microchannels עבור יישור סיבי קולגן

הערה: כדי ליצור מטריצות קולגן מיושר, תבנית עבור microchannels PDMS (איור 2 א) דורש מאסטר סיליקון SU-8 עשה דרך-ליתוגרפיה רך ^15.

1. כדי להפוך ערוצי PDMS, לערבב PDMS ביסודיות בכוס חד פעמית עם מקל מלאכה. לקבלת מאסטר סיליקון 6 אינץ ', לערבב 20 גרם של בסיס אלסטומר עם 2 גרם של סוכן ריפוי.
2. דה-גז התערובת PDMS על ידי הנחת כוס חד פעמי בתא ואקום בלחץ ואקום של550 מ"מ כספית. דה-גז 1 - 1.5 שעות.
3. בעוד דה-בגז את PDMS, להכין את המאסטר סיליקון למילוי. הכן ידי הצבת סדין נקי של סרט שקיפות על פלטה חמה ואחריו אדון סיליקון. ודא כי עובש microchannel פונה כלפי מעלה.
   הערה: במהלך ליהוק PDMS וריפוי, המאסטר סיליקון יהיה דחוק בין שתי יריעות של סרט שקיפות.
4. לאחר ה -1 - 1.5 שעות, להסיר את PDMS בגז דה מהאולם ואקום, ולאט לאט ויוצקים מעל את המאסטר סיליקון.
   חשוב: הימנע בועות אוויר. ממשיכים לזרום במרכז הורים, ולאפשר את כוח המשיכה כדי להפיץ אותו באופן שווה.
   הערה: ירידת PDMS לא צריכה להאריך את כל הדרך עד לקצה של המאסטר.
5. לאחר PDMS כבר שפכו על המאסטר, להחיל גיליון שני של סרט שקיפות על גבי אדון סיליקון PDMS. בזהירות, לגלגל את גיליון שקיפות השני למטה על גבי האדון PDMS / סיליקון כדי למנוע בועות אוויר. אל תמהר. PDMS יש עכשיו להתפשט באופן שווה oמאסטר Ver.
6. בעדינות להניח סדין גומי על גבי שקיפות, ואחריו גיליון 1/8 "אקריליק.
7. מוסיפים שלוש 10 lb משקולות על גבי גיליון אקריליק. בתחילה, המשקולות תהיינה "לצוף". לאפשר להם להתיישב ולייצב לפני שתמשיך.
8. גדר טמפרטורת פלטה חשמלית ל -70 PDMS C ו- מרפא 4 שעות. אפשר להתקרר במשך מינימום של 1 hr נוסף לפני מטריד.
9. בזהירות לקלף גיליון העליון של שקף מן הרקיק, ולהסיר את הערוצים עם מלקחיים.
10. חנות בצלחת ללא אבק עד מוכן לשימוש.

4. הכנות PDMS microchannels לשימוש

1. ערוצי מקום במהופך על שקפים חדשים, נקיים. יציאות כל נקי (איור 2b) באמצעות תנועה מעגלית עם מלקחיים חדים. הסר את כל שברי PDMS.
2. ערוצים נקיים באמצעות פיסת אריזת קלטת כמו מטלית טקטיקה. החל קלטת השטח של הספסל (הצד הדביק כלפי מעלה), ולאחר מכן להגדיר o ערוץהעליון n. לחץ כלפי מטה על ערוצים עם קצה מעוגל של מלקחיים כדי להבטיח מגע טוב. סור וחזור משני הצדדים עד פסולת גלויה מוסר.
3. העברת ניקה, הכינו ערוצי PDMS לתוך חרוטי 50 מ"ל עם 70% EtOH. וורטקס במהירות מרבית למשך 30 שניות. בטל EtOH ולהחליף EtOH 70% טרי. חנות ב 70% EtOH עד מוכן לשימוש.
4. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות ספטית, להעביר את ערוצי PDMS לכוס או מכסה זכוכית נקי וסטרילי מנות תחתית. שים את הפינוק מעלה UV צד בערוץ עד EtOH התאדה.
5. לאחר יבש, להעיף את PDMS כך הערוצים הם פונים כלפי מטה לכיוון coverglass. לחץ על PDMS הערוץ כלפי מטה על הזכוכית כדי להפוך את חותם טוב. הוספת תיקון של PDMS סטרילי כדי לכסות / לסגור את הנמל למרכז (נמל B, איור 2b). ולאפשר לו להתייבש ביסודיות לפני שתמשיך.
6. טרום המעיל הפנימי של הערוץ עם קולגן 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים סטריליים. כדי מעיל, למקם טיפה 100 μl על החלק העליון של channאל, ולצייר דרך עם ואקום. אחרי השעה 1 ב 37 C, ערוצי העברה מלאים פתרון ציפוי קולגן כדי מקרר. צ'יל למשך כ 15 - 30 דקות.
7. הסר פתרון ציפוי קולגן עם aspirator או pipet, ולהתחיל הכנה קולגן.

5. הכנת קולגן לשימוש ב microchannels

1. על קרח, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 קר כקרח HEPES מ"מ ב 2x PBS, pH 7.4. מערבבים היטב עד הומוגנית (לפרטים נוספים, ראה סעיף 1.1).
2. לדלל קולגן מנוטרל על הריכוזים המתאימים עם תקשורת תא (לפרטים נוספים, ראה סעיף 1.2). דגירה במשך 15 דקות על קרח.
3. במקביל, צמרמורת רכוב ערוצים על קרח.
   הערה: המטרה היא לקבל את כל הרכיבים הדרושים לתהליך ערוץ ב 4 C או מתחת. הטמפרטורה וזמן קולגן התגרענות כמה פרמטרים עיקריים לתהליך פילמור, ועלולה להיות נקודת ההתחלה עבור אופטימיזציה נוספת, במידת הצורך.
4. counתאי T עם hemacytometer ו resuspend על צפיפות הזריעה המתאימה בשלב זה. על מנת להקל על חישובים, resuspend ל 3 - 1 מיליון תאים / מ"ל. (לפרטים נוספים, ראה גם סעיף 2.1).
5. לאחר תאים נספרו ו -15 דקות עברו, המשך קולגן לשפוך.

6. לשפוך בציר microchannels אקראי קולגן

1. לפני ציור קולגן בצינורות, להתאים ולהגדיר לחץ ואקום עם רגולטור ואקום מוטבע. לחץ אבק מספק כוח כדי לעודד ו לשלוט על קצב זרימת קולגן, אשר קובע את מידת יישור.
   1. עבור מטריצות אקראיות או unaligned, משתמש בערוץ רחב (x הרחב 3mm 200 מיקרומטר גבוה) עם לחץ ואקום של 10 מ"מימ כספיים או פחות.
   2. עבור מטריצות מיושרות, השתמש תעלה צר (1 מ"מ רחב x 200 מיקרומטר גבוה) עם לחץ ואקום של 60 מ"מ כספי או יותר.
2. הסר ערוץ רכוב מקרח ומניחים על משטח נקי, מחוטא של h זרימה למינריתood.
3. לעבוד במהירות לטעון 120 - 150 μl של קולגן לנטרל ליציאה (איור 2b).
4. צייר קולגן דרך הערוץ על ידי הצבת 25 מ"ל pipet המצורפת קו ואקום מעל ג הנמל (איור 2b). צייר קולגן באמצעות בתנועה אחידה. חשוב: לקבלת מטריצות אקראיות או unaligned, לצייר קולגן לאט ברחבי הערוץ (כ 0.5 - 1 מ"מ לשנייה), ולהפסיק ברגע שהוא מגיע בסופו של דבר. עבור מטריצות מיושרות, לצייר את הקולגן ברחבי במהירות רבה יותר, אך היזהר כדי למנוע בועות אוויר.
5. מוציאים בזהירות קולגן עודף מאזור הנמל עם pipetman או aspirator p200.
6. מניח טלאי PDMS סטרילית על שני יציאות A ו- C. כל היציאות צריכות להיות מכוסות כעת.
7. לאחר 2 - 3 דקות, להסיר תיקון מרכז PDMS (B port) ולהוסיף 3 - 2 μl של תאים (5 - 10 אלף תאים) ליציאת המרכז. אפשר לפלמר חלקית (להפוך אטום) בטמפרטורת החדר למשך עוד 10 - 15 דקות.
8. אחרי 10- 15 דק ', העברה ל -37 צלזיוס למשך 15 נוספות - 30 דקות כדי לסיים פילמור. סר מכסה PDMS ולהוסיף תקשורת לכסות את תרבות תאי ערוץ לחלוטין לפי צורך. תאים יכולים להיות מוזן על ידי הסרת מ"ל של המדיה הישנה, ​​והחלפתו עם מ"ל של המדיה החדשה.

תוצאות

בעוד מבחני 3D ניתן לעשות זאת בתוך אותה הנוקשות של ג'ל קולגן, שינוי הקשיח ג'ל ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד התאים יגיבו לשינויים מכאניים microenvironment הסלולר שלהם. הידרוג קולגן נוקשה מוגדר כג'ל שבו התאים המוטבעים אינם מסוגלים מקומית להתכווץ קולגן שמסבי?...

Discussion

ג'ל קולגן 3D הם תוספת רבת ערך בארגז הכלים שלנו כדי להבין כיצד תאים לפרש ולהגיב microenvironment המקומית שלהם. כתב יד זה ספק פרוטוקול בסיסי מאוד להטבעת תאים בתוך מטריצת קולגן 3D, וכדי ליצור מטריצות reproducibly עם סיבי קולגן אקראיים או מיושרים. פרוטוקולי שניהם עובדים פלטפורמות וישי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244