3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

要約

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。

要約

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

概要

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

プロトコル

1.中和、希釈および3D調査と細胞収縮アッセイのためのコラーゲンソリューションの重合

1. 滅菌組織培養フード中で氷上で、コラーゲン（1：1）を中和2×PBS、pH7.4中の滅菌、氷冷100mMのHEPESで、15ミリリットルコニカルチューブ内を。溶液が均一でないと、混合渦巻きが見えなくなるまで、プラスチックピペットを用いて完全に混合します。混合プロセスの間に気泡を導入しないように注意してください。氷の上で簡単に保管してください。
2. 細胞培地を用いて適切な濃度（ など RPMI、DMEM、など）に中和されたコラーゲンを希釈します。
   1. Nが必要な中和コラーゲンの量であり、（S / 2）/所望のコラーゲン濃度を構成するために必要な中和されたコラーゲンの量を計算式N =（Dの*のV）を使用するには、Dは、所望のコラーゲン濃度で、Vは所望の最終コラーゲン濃度の量、及びSをt彼は株式コラーゲン濃度を開始します。
   2. 細胞と細胞培地溶液を添加することによってボリュームに中和したコラーゲンの量を起動します。完全に混合し、キャストする準備ができるまで氷上で保存します。
      1. 例：1ミリリットルゲルボリューム（6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュでゲルキャスト用の典型的な量）中の2mg / mlのゲルについて、最初の所望の最終体積で所望の濃度（2mg / ml）を掛けます（1 ml）を。この数（2 mg）を取り、ボトルに記載されているストック濃度（9.49 mg / mlで）の半分で割り。この場合には、中和​​されたコラーゲンを0.42 mlの培地/細胞混合物0.58 mlを希釈します。
3. ピペットは、非組織培養のいずれかに、氷冷コラーゲン/細胞/培地の混合物を、6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュを処理しました。溶液を均等に広げるためにピペットチップを使用してください。
   注：collagの外の細胞の付着又は成長を最小化するために、非組織培養処理したプレートを使用することが重要ですゲルエン。
4. 15分 - 約10のために室温で重合することを可能にします。ゲルは、重合時に不透明有効にしてください。
5. 重合を完了するために60分 - それが不透明になった後、追加の45を37℃にプレート又は皿を移動します。
6. 45後 - メディアの3ミリリットルとウェルまたは皿の周囲P200のピペットチップを実行することにより、ウェルの側面からゲルをリリース - 60分、2を追加します。渦巻料理は優しくゲルを解放します。コラーゲンゲルは、メディアに浮遊する必要があります。

2.ウェスタンブロッティング、細胞形態形成やジェルGontractilityアッセイ

1. タンパク質レベル、ECMの剛性に関連する形態や細胞の収縮性を評価するために、コラーゲンゲルを注ぐことにより開始し、1.1に従って - 10日間のアッセイ - 1.6、7用の細胞を播種。成長率や密集度に応じて経験的に各細胞株の播種量を決定します。 100,000細胞/ゲル - 10日間のアッセイについては、播種密度20,000の範囲であり得ます。
2. 測定する細胞収縮性は、24時間毎定規またはカメラを使用するか、または適切な時間間隔でゲルの直径を測定します。
   注：細胞株の形態学的特徴の特性は、ゲルに播種するために加え、顕微鏡から収集し、対応する画像は、腺房様構造、上皮尿細管、細胞突起、及びlameliapodiaとして、調べることができます。
3. ウォズニアックに記載されているように^17、ギャラガーら ら 、タンパク質レベルを評価するRIPA緩衝液でゲルを溶解し、目的のタンパク質のウエスタンブロット分析のために処理した^。18。
   1. 重要：細胞株との間の収縮性の比較で、 らルイで概説したようにゲルから抽出することができる総DNAへの収縮性を正常化^19、または西洋によって変化しない、ハウスキーピングタンパク質（ヒストン、GAPDH など ）。ブロット分析、ウォズニアックらに記載されているように^17、ギャラガーら ^。18。血球計数器を用いてゲル内の細胞を計数した場合、請負ゲルなど総ゲル面積に細胞数を正規化することを確認した細胞を集中します。
4. メディアの1ミリリットルを除去し、新鮮な培地の1ミリリットルでそれを置き換えることにより4日 - フィードゲルごとに3。測定は新鮮な培地/血清の添加とした後、ゲルを供給するようにしてください収縮にスパイクが発生します。

コラーゲン繊維の位置合わせのためのPDMSマイクロチャンネルの3世代

注：整列コラーゲンマトリックスを生成するには、PDMSマイクロチャネル（ 図 2A）のための金型は、ソフトリソグラフィー^15を介して作られたSU-8シリコンマスターが必要です。

1. PDMSチャネルを作成するには、クラフトスティックで使い捨てカップに徹底的にPDMSを混ぜます。 6インチのシリコンマスターのために、硬化剤を2 gのエラストマーベース20gを混合します。
2. 脱ガスの減圧下で真空チャンバ内で使い捨てカップを配置することによってPDMS液550ミリメートルHgの。 1.5時間 - 1のための脱ガス。
3. PDMSを脱ガス発生が、注ぐためのシリコーンマスターを準備します。シリコーンマスターに続いて、ホットプレート上に透明フィルムのクリーンシートを配置することによって準備します。マイクロチャネルモールドは上向きいることを確認してください。
   注：PDMS鋳造および硬化中に、シリコーンマスタは透明フィルムの2枚のシートの間に挟まれます。
4. 1の後 - 1.5時間、真空チャンバーから脱気PDMSを削除して、ゆっくりとシリコーンマスターの上に注ぎます。
   重要：気泡を避けてください。マスターの中心に注ぐと、重力が均等にそれを広めることができるように続けます。
   注：PDMS降下がマスターの端にすべての方法を拡張する必要はありません。
5. PDMSをマスター上に注がれた後、シリコンマスターとPDMSの上に透明フィルムの第二シートを適用します。慎重に気泡を回避するために、PDMS /シリコンマスターの上に第二の透明シートを転がり落ちます。急がないで。 PDMSは今均等にoを分散させる必要がありますマスター版。
6. 静か1/8 "アクリル板に続いて透明性の上にゴムシートを配置。
7. アクリル板の上に3 10ポンドの重みを追加します。当初は、重みは「フロート」になります。彼らはさらに進む前に解決して安定化することを可能にします。
8. 4時間、70℃および硬化PDMSにホットプレートの温度を設定します。乱す前にさらに1時間の最小値のために冷却してください。
9. 慎重にウエハから透明フィルムのトップシートを剥離し、鉗子でチャンネルを削除します。
10. 使用する準備ができるまで無塵の皿に保管してください。

使用4.プレッピングPDMSマイクロチャンネル

1. 逆さまに新しい、きれいな透明フィルムの上に置いてチャンネル。鋭いピンセットで円運動を使用して清掃し、すべてのポート（ 図2b）。 PDMSの任意のフラグメントを削除します。
2. タッククロスとしてガムテープの一部を使って、クリーンチャンネル。ベンチ（粘着面を上）の表面にテープを適用し、その後、チャネルOを設定n個のトップ。良好な接触を確実にするために鉗子の丸い端を有するチャネルを押し下げます。削除して、目に見える破片が除去されるまで両側に繰り返します。
3. 洗浄転送は、70％EtOHで50ミリリットルコニカルにPDMSチャネルを準備さ。 30秒間最大速度でボルテックス。エタノールを捨て、新鮮な70％EtOHで置き換えます。使用する直前まで70％エタノールで保管してください。
4. 組織培養フード内で無菌技術を使用して、清潔で無菌カバーガラスやガラスボトムディッシュにPDMSチャネルを転送します。エタノールが蒸発するまで、チャネル側のアップとUV御馳走を置きます。
5. チャンネルはカバーガラスに向かって下向きにされるように乾燥したら、PDMSを反転。良好なシールを作るためにガラス上にPDMSチャネルを押し下げます。中央のポート（ポートB、 図2b）を閉じる/カバーするために滅菌PDMSのパッチを追加します。先に進む前には、完全に乾燥できるようにします。
6. プレコート滅菌水で10 / mlのコラーゲンとチャネルの内部。コー​​トに、channの上に100μlの液滴を配置エル、真空とを通して描きます。 37℃で1時間後、冷蔵庫へのコラーゲンコーティング溶液で満たされた転送チャネル。 30分 - 約15のためのチル。
7. 吸引器またはピペットでコラーゲンコーティング溶液を除去し、コラーゲンの準備を始めます。

マイクロチャンネルにおける使用のため5.コラーゲンの準備

1. 2×PBS、pH7.4中の氷冷100mMのHEPESで：氷上で、コラーゲン（1 1）を中和します。均一になるまで完全に混合（詳細については、1.1節を参照してください）​​。
2. 細胞培地を用いて適切な濃度に中和されたコラーゲンを希釈する（詳細については、1.2節を参照してください）​​。氷上で15分間インキュベートします。
3. 同時に、寒さは氷の上のチャネルを搭載しています。
   注：目標は4℃以下でのチャネル処理のためのすべてのコンポーネントを持つことです。コラーゲンの核形成温度及び時間は、重合プロセスに重要なパラメータであり、そして必要に応じて、さらなる最適化のための出発点であってもよいです。
4. COUNこの時に適切な播種密度で血球計および再懸濁を有するT細胞。 3百万個の細胞/ mlの - 計算を容易にするために、1に再懸濁します。 （詳細については、また、2.1節を参照してください）​​。
5. 細胞がカウントされ、15分が経過したら、注ぐコラーゲンに進みます。

6.注ぐ同盟とランダムコラーゲンマイクロチャンネル

1. チャネルを介してコラーゲンを描画する前に、調整し、インライン真空レギュレータと真空圧力を設定します。真空圧は、誘導し、アライメントの程度を決定するコラーゲンの流量を制御するための力を提供します。
   1. ランダムまたは非整列行列の場合、10ミリメートルHgの以下の真空圧と広いチャネル（3ミリメートル幅×身長200μm）を使用します。
   2. 整列行列に対して、60ミリメートルHgの以上の真空圧力で狭チャネル（1ミリメートル幅×200μmの背の高い）を使用します。
2. 氷からマウントされたチャネルを削除し、層流hのクリーン、消毒表面上に置きますOOD。
3. （ 図2b）、ポートAに中和されたコラーゲン150μlの-すぐに働くと120をロードします。
4. ポートc（ 図2b）を介して真空ラインに取り付けられた25ミリリットルピペットを配置することによって、チャネルを介してコラーゲンを描画します。単一、均一な動きで通ってコラーゲンを描画します。重要：ランダムまたはアラインされていない行列の場合、チャネルにわたってゆっくりとコラーゲンを描く（約0.5から1秒当たりミリメートル）、およびそれが最後に到達すると停止します。整列行列に対して、より迅速に渡ってコラーゲンを描くが、気泡を避けるように注意してください。
5. 慎重P200ピペットマンやアスピレーターでポート領域から過剰なコラーゲンを削除します。
6. AとCのすべてのポートが今カバーされるべきである両方のポートを介して滅菌PDMSパッチを配置します。
7. 2後 - 3分、中央PDMSパッチ（ポートB）を除去し、2を追加 - 中央ポートに - （1万細胞5）細胞の3μLを。 15分 - 部分的に別の10室温で（不透明ターン）重合させました。
8. 10後- 15分、さらに15、37℃への転送 - 重合を終了する30分。 PDMSのカバーを外し、必要に応じて完全にチャネルと文化のセルをカバーするためにメディアを追加。細胞は、古いメディアのミリリットルを除去し、新しいメディアのミリリットルでそれを置き換えることによって供給することができます。

結果

3Dアッセイは、コラーゲンゲルの同じ剛性内で行うことができるが、ゲルの剛性を変化させることは、細胞がそれらの細胞の微小環境における機械的な変化に応答する方法を決定するために使用することができます。堅いコラーゲンハイドロゲルは、埋め込まれた細胞が局所的に周囲のコラーゲンを収縮することができないゲルとして定義されています。異なる細胞?...

ディスカッション

3Dコラーゲンゲルは、細胞がどのように解釈するかを理解し、それらの局所微小環境に対応するため、当社のツールボックスに貴重な追加されています。この原稿は、3Dコラーゲンマトリックス内に細胞を埋め込むための非常に基本的なプロトコルを提供している、かつ再現ランダムまたは整列したコラーゲン繊維とマトリクスを生成します。両方のプロトコルは、異なるコラーゲンアイソ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244