Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Résumé

Le collagène est une composante essentielle de l'ECM, et fournit des indices essentiels pour plusieurs processus cellulaires allant de la migration vers la différenciation et la prolifération. Pourvu ici est un protocole pour l'intégration des cellules dans les hydrogels de collagène 3D, et une technique plus avancée pour générer des matrices de collagène randomisées ou alignées à l'aide de microcanaux PDMS.

Résumé

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Introduction

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protocole

1. Neutralisation, Dilution et Polymérisation de collagène Solutions pour la 3D Investigation et cellulaires Contraction Assays

1. Sur la glace dans stérile culture de tissus capuche, neutraliser le collagène (1: 1) avec stérile glacée 100 mM HEPES dans 2x PBS, pH 7,4, dans un tube de 15 ml conique. Bien mélanger avec une pipette en plastique jusqu'à ce que la solution est homogène et des tourbillons de mélange ne sont plus visibles. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air pendant le processus de mélange. Stockez brièvement sur la glace.
2. Diluer le collagène neutralisé à la concentration appropriée avec des milieux cellulaires (tels que le milieu RPMI, DMEM, etc.).
   1. Pour calculer la quantité de collagène neutralisé nécessaire pour compenser la concentration de collagène désirée, utiliser l'équation N = (D * V) / (S / 2), où N est quantité de collagène neutralisé nécessaire, D est la concentration de collagène souhaitée, V est le volume final de la concentration désirée de collagène, et S est un groupe til concentration de départ stock collagène.
   2. Afficher la quantité de collagène neutralisée au volume par addition d'une solution de cellules et des milieux cellulaires. Bien mélanger et stocker sur la glace jusqu'à ce que prêt à lancer.
      1. Exemple: pour un gel à 2 mg / ml dans un volume de gel de 1 ml (volume typique d'un moulage en gel dans 6 puits de plaque ou de 50 mm de verre plat en bas), d'abord multiplier la concentration désirée (2 mg / ml) par le volume final désiré (1 ml). Prenez ce nombre (2 mg) et le diviser par la moitié de la concentration en actions cotées sur la bouteille (9,49 mg / ml). Dans ce cas, 0,42 ml de collagène neutralisé sont dilués avec 0,58 ml de mélange / support de cellules.
3. Pipet le collagène / cellule / mélange des médias de la glace soit dans une culture non-tissu traité plaque à 6 puits ou un verre plat en bas de 50 mm. Utilisez la pointe de la pipette pour répartir uniformément la solution.
   Remarque: il est important d'utiliser une culture non tissulaire plaque traitée pour réduire au minimum la fixation ou la croissance des cellules en dehors de la collagen gel.
4. Permettre de polymériser à la température ambiante pendant environ 10 - 15 min. Les gels doivent devenir opaque lors de la polymérisation.
5. Après qu'il a tourné opaque, déplacer assiette ou un plat à 37 ° C pendant encore 45 - 60 min pour terminer la polymérisation.
6. Après 45 - 60 min, ajouter 2 - 3 ml de milieu et de libérer les gels des parois du puits en exécutant une pointe p200 de pipette autour du périmètre du bien ou un plat. Antenne Agiter doucement pour libérer le gel. Le gel de collagène doit être flottant dans un milieu.

2. Western blot, Cell morphogenèse et Gel Gontractility Assay

1. Pour évaluer les niveaux de protéines, la morphologie ou la contractilité cellulaire par rapport à la rigidité ECM, commencer par coulage des gels de collagène, selon 01.01 à 01.06, ensemencé avec des cellules pour une 7 - essai de 10 jours. Déterminer chaque taux d'ensemencement de la lignée cellulaire empiriquement en fonction de taux de croissance et la confluence. Pour un essai de 10 jours, la densité d'ensemencement peut varier de 20.000 - 100.000 cellules / gel.
2. Mesurerla contractilité cellulaire, mesurer le diamètre de gel à l'aide d'une règle ou d'une caméra toutes les 24 h ou à l'intervalle de temps approprié.
   Remarque: En outre, les images correspondantes collectées à partir d'un microscope peuvent être examinés pour rechercher des caractéristiques morphologiques caractéristiques de la lignée cellulaire ensemencée dans le gel, telles que les structures en forme acini, tubules épithéliaux, des saillies cellulaires et lameliapodia.
3. Pour évaluer les niveaux de protéines, lyser les gels dans RIPA tampon et le processus d'analyse par Western blot de protéines d'intérêt , comme décrit dans Wozniak et al. ¹⁷ et Gallagher et al. ^18.
   1. IMPORTANT: Dans les comparaisons de la contractilité entre les lignées cellulaires, de normaliser la contractilité à l' ADN total, qui peut être extrait à partir des gels tel que décrit par Lui, et al ^19, ou à une invariables, protéine de ménage (histones, GAPDH, etc.) par Western. Une analyse par transfert, comme décrit dans Wozniak et al. , ¹⁷ et Gallagher et al. ¹⁸. Si le comptage des cellules dans le gel en utilisant un hémocytomètre, assurez-vous de normaliser le nombre de cellules à la surface totale de gel que le gel contractant se concentrera cellules.
4. gels d'alimentation tous les 3 - 4 jours en enlevant 1 ml de milieu et de le remplacer par 1 ml de milieu frais. Assurez-vous de nourrir gels après la mesure est considérée comme l'ajout de milieu frais / sérum provoque un pic dans la contractilité.

3. Génération de PDMS microcanaux pour l'alignement de collagène fibre

Remarque: Pour générer des matrices de collagène alignées, un moule pour PDMS microcanaux (figure 2A) nécessite un maître de silicium SU-8 réalisé par lithographie douce ^15.

1. Pour les canaux de PDMS, mélanger soigneusement PDMS dans une tasse jetable avec un bâtonnet. Pour un maître de silicone de 6 pouces, mélanger 20 g de base d'élastomère avec 2 g d'agent de durcissement.
2. Dégazer le mélange PDMS en plaçant le gobelet jetable dans une chambre à vide sous une pression de vide550 mm de Hg. De gaz pour les 1 - 1,5 h.
3. Alors que de dégazage les PDMS, préparer le maître de silicone pour la coulée. Préparer en plaçant une feuille de film transparent sur une plaque suivie par le maître de silicone. Assurez-vous que le moule de microcanaux vers le haut.
   REMARQUE: Pendant PDMS coulée et le durcissement, le maître de silicone sera prise en sandwich entre deux feuilles de film transparent.
4. Après 1 à 1,5 h, retirer les PDMS de-gazés de la chambre à vide, et verser lentement sur le maître de silicone.
   IMPORTANT: Éviter les bulles d'air. Continuer à verser dans le centre de maître, et permettre à la gravité de l'étaler uniformément.
   NOTE: La baisse PDMS n'a pas besoin de prolonger tout le chemin vers le bord du maître.
5. Après PDMS a été versé sur le maître, appliquer une deuxième feuille de film transparent au-dessus du maître de silicone et PDMS. Soigneusement, rouler la seconde feuille de transparence sur le dessus du maître PDMS / silicone pour éviter les bulles d'air. Ne vous précipitez pas. PDMS doivent maintenant être réparties uniformément omaître ver.
6. Placez délicatement une feuille de caoutchouc sur le dessus de la transparence, suivie d'une "feuille acrylique 1/8.
7. Ajouter trois 10 lb poids sur le dessus de la feuille acrylique. Dans un premier temps, les poids seront "flotter". Leur permettre de régler et de stabiliser avant d'aller plus loin.
8. Réglez la température de la plaque chauffante à 70 ° C et la guérison PDMS pendant 4 heures. Laisser refroidir pendant au moins 1 heure supplémentaire avant de déranger.
9. Retirer délicatement la feuille supérieure de film transparent de la plaquette, et enlever les canaux avec une pince.
10. Magasin dans un plat sans poussière avant d'être prêt à utiliser.

4. Prepping PDMS microcanaux d'emploi

1. La place des canaux à l'envers sur le nouveau film de transparence propre,. Nettoyez tous les ports (Figure 2b) en utilisant un mouvement circulaire avec une forte pince. Retirez tous les fragments de PDMS.
2. canaux propres à l'aide d'un morceau de ruban adhésif d'emballage comme un chiffon collant. Appliquer du ruban à la surface du banc (côté collant vers le haut), puis régler le canal on top. Appuyez sur les canaux avec bout rond de pince pour assurer un bon contact. Retirez et répéter sur les deux côtés jusqu'à ce que les débris visibles est enlevé.
3. Transfert nettoyée, préparée canaux PDMS dans un cône de 50 ml avec 70% EtOH. Vortex à la vitesse maximale pendant 30 secondes. Jeter EtOH et remplacer avec des produits frais 70% EtOH. Conserver dans 70% EtOH jusqu'à utilisation.
4. Dans le tissu hotte de culture et en utilisant des techniques d'asepsie, transférer les canaux de PDMS à un couvercle en verre propre et stérile ou en verre plats de fond. Mettez le canal vers le haut et UV traitement jusqu'à ce que EtOH a évaporé.
5. Une fois sec, retournez les PDMS afin que les canaux sont orientés vers le bas vers la lamelle. Appuyez sur le canal PDMS vers le bas sur le verre pour faire une bonne étanchéité. Ajouter un patch de PDMS stériles pour couvrir / fermer le centre port (port B, Figure 2b). Laisser sécher complètement avant de poursuivre.
6. Précouche à l'intérieur du canal avec 10 pg / ml de collagène dans de l'eau stérile. Pour revêtir, placer une gouttelette de 100 pi sur le sommet d'une channel, et tirer au travers avec le vide. Au bout de 1 h à 37 ° C, les canaux de transfert remplis de solution de revêtement de collagène pour un réfrigérateur. Réfrigérer pendant environ 15 - 30 min.
7. Éliminer la solution de revêtement de collagène avec aspiration ou d'une pipette, et pour commencer la préparation de collagène.

5. Collagène Préparation à l'utilisation dans des microcanaux

1. Sur la glace, neutraliser le collagène (1: 1) avec de la glace à froid 100 mM HEPES dans 2x PBS, pH 7,4. Bien mélanger jusqu'à homogénéité (Pour plus de détails, voir la section 1.1).
2. Diluer collagène neutralisé aux concentrations appropriées avec les médias de la cellule (Pour plus de détails, voir la section 1.2). Incuber pendant 15 min sur la glace.
3. Dans le même temps, froid canaux sur la glace monté.
   NOTE: Le but est d'avoir tous les composants pour le processus de canal à 4 ° C ou moins. Collagène température et le temps nucléation sont des paramètres clés du processus de polymérisation, et peut être le point de départ pour une optimisation plus poussée, si nécessaire.
4. Count cellules avec un hémocytomètre et resuspendre à la densité de semis appropriée à ce moment. Pour la facilité de calcul, la remise en suspension à 1 - 3 millions de cellules / ml. (Pour plus de détails, voir également la section 2.1).
5. Une fois que les cellules ont été comptées et 15 min ont passé, procéder au collagène de coulée.

6. Verser alignés et Random collagène microcanaux

1. Avant de dessiner le collagène à travers des canaux, ajuster et régler la pression à vide avec un régulateur de vide en ligne. la pression de vide fournit la force pour induire et contrôler le débit d'écoulement du collagène, qui détermine le degré d'alignement.
   1. Pour les matrices aléatoires ou non alignés, utilisant un large canal (3 mm de large x 200 um de hauteur) avec une pression de vide de 10 mm Hg ou moins.
   2. Pour les matrices alignées, utiliser le canal étroit (1 mm de largeur x 200 um de hauteur) avec une pression de vide de 60 mm Hg ou plus.
2. Supprimer la chaîne montée de la glace et placer sur surface propre, aseptisée de flux laminaire hood.
3. Travaillez rapidement et charger 120 - 150 pi de collagène neutralisé dans le port A (Figure 2b).
4. Tirer le collagène dans le canal en plaçant un 25 ml de pipette attaché à la canalisation à vide au- dessus de l' orifice C (figure 2b). Dessinez le collagène par le biais d'un seul mouvement uniforme. IMPORTANT: Pour les matrices aléatoires ou non alignés, dessiner collagène lentement à travers le canal (environ 0,5 à 1 mm par seconde), et arrêter une fois qu'il atteint la fin. Pour les matrices alignées, dessiner le collagène dans plus rapidement, mais prendre soin d'éviter les bulles d'air.
5. Retirez soigneusement l'excès de collagène de la région portuaire avec Pipetman P200 ou aspirateur.
6. Placez PDMS patchs stériles sur les deux ports A et C. Tous les ports doivent maintenant être couverts.
7. Après 2 - 3 minutes, retirez centre correctif PDMS (port B) et ajouter 2 - 3 pi de cellules (5 - 10 000 cellules) dans le port central. Laisser polymériser partiellement (tourner opaque) à la température ambiante pendant 10 - 15 min.
8. Au bout de 10- 15 min, transfert à 37 ° C pendant plus de 15 - 30 minutes pour terminer la polymérisation. Oter les couvercles PDMS et ajouter des médias pour couvrir complètement les cellules de canal et de la culture au besoin. Les cellules peuvent être alimentées par la suppression d'un ml d'anciens supports, et en le remplaçant par un ml de nouveaux supports.

Résultats

Alors que les tests 3D peuvent être faits dans la même rigidité de gel de collagène, de faire varier la rigidité du gel peut être utilisée pour déterminer comment les cellules répondent à des changements mécaniques dans leur microenvironnement cellulaire. Un hydrogel de collagène rigide est défini comme un gel dans lequel les cellules incorporées ne sont pas capables de contracter localement le collagène environnant. La contractilité intrinsèque des différents types de ...

Discussion

gels de collagène 3D sont un ajout précieux à notre boîte à outils pour comprendre comment les cellules interprètent et répondre à leur microenvironnement local. Ce manuscrit a fourni un protocole très simple pour l'intégration des cellules dans une matrice de collagène 3D et pour générer de manière reproductible des matrices de fibres de collagène ou aléatoires alignées. Les deux protocoles fonctionnent comme des plates-formes adaptables où les différentes isoformes de collagène, des agents de r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244