Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Resumo

O colágeno é um componente central da ECM, e fornece pistas essenciais para diversos processos celulares que vão desde a migração para diferenciação e proliferação. Fornecidas aqui é um protocolo para a incorporação de células dentro de hidrogéis de colágeno 3D, e uma técnica mais avançada para a geração de matrizes de colágeno randomizados ou alinhadas utilizando microcanais PDMS.

Resumo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis¹. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration^2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Introdução

Many cellular processes have been extensively studied in 2 dimensions, thereby forming a collective knowledge of basic cell signaling mechanisms. These studies, however, neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local cellular microenvironment and extracellular matrix (ECM). To better understand how cells interact within a physiological context, it is important to study them in 3-dimensional (3D) assays. The ECM for these 3D assays can either be cell-derived or reconstituted from purified proteins. Regardless of the source of the ECM, 3D matrix assays have proven to be invaluable for understanding how cells navigate and interact within the physiological world. For example, cells grown in 3D matrices display distinct modes of locomotion that depend on the mechanical nature of their surrounding ECM which are not observed in 2D experiments^4-6. Moreover, cells cultured in 3D also have fewer and less pronounced stress fibers and focal adhesions than their counterparts grown on hard surfaces such as glass or plastic⁷.

The importance of contextual 3D assays is not limited to cell migration, however. Some other cell signaling events can only be investigated through the use of 3D assays. During tissue and cell differentiation, the stiffness of the extracellular environment and ECM provides signals that can influence morphogenic events. For example, mammary epithelial tubulogenesis only occurs in low stiffness 3D matrices, but not in stiff matrices nor on 2D substrata^8,9. When cultured within stiff 3D matrices, these same epithelial cells take on an aberrant phenotype with increased proliferation and cell membrane protrusions driven through altered FAK and ERK signaling¹⁰. Many other signaling pathways and cellular processes are known to be similarly affected by the stiffness of the local cellular environment, and these signaling cascades highlight the importance of investigating signaling events and cellular phenotype in the context of appropriate local mechanical properties of a 3D ECM.

Collagen I is a particularly relevant protein to use for in vitro studies as it is the most abundant component of the ECM and is responsible for many of the mechanical properties of the cellular microenvironment. While it was originally thought of as merely a structural protein, its role is now known to be much more complex. Collagen fiber composition, architecture, orientation, density, and stiffness all provide a concentrated milieu of signaling information⁵. During the progression of certain diseases, such as chronic inflammation and tumorigenesis, the collagen network is dramatically remodeled^2,11. More specifically in breast cancers, increased collagen deposition and tissue stiffness accompany and likely contribute to tumor progression. In these early tumors, the stiffened collagen network appears strained and more aligned, such that most of the fibers encapsulate the growing tumor². As the tumor progresses, the collagen continues to reorganize, and regions of the fibrillar network become orientated perpendicular to the tumor boundary^2,12. Perpendicular alignment serves as a prognostic biomarker where these patients have a poorer disease free progression and overall survival¹. One explanation for this correlation is that the poor outcomes are a consequence of increased dissemination of tumor cells via persistent cell migration in aligned collagen networks³.

To understand how cells specifically respond to alignment and organization that is observed in tumor progression, it is necessary to generate both random and aligned 3D collagen matrices for experimentation. There are three basic methodologies to induce alignment within fibrillar networks. The first technique utilizes a strain-inducing device where the collagen between two points is contracted or stretched to generate alignment. Fibers parallel to the axis of force are pulled taut while fibers perpendicular to the axis are compressed and buckled. While strain-induced techniques typically offer superb alignment, this approach requires bulky equipment that is not easily adaptable to many platforms^3,13. Alternatively, cell-induced strain can be created by placing localized plugs of cells that subsequently contract and align the collagen¹³. This method has the problem of being variable, as many parameters may be subject to change. The second method utilizes magnetic beads and a magnetic field during polymerization to induce collagen alignment^13,14. Good results can be obtained from this method with unsophisticated equipment, but it does require the use of antibodies or some other method to magnetize the polymer. Therefore, it can be somewhat expensive to use, and the stiffness of the collagen gel is potentially modified by the increased connections in the network. Moreover, the magnetic beads used in this process are often autofluorescent, which is problematic for imaging experiments. Lastly, alignment can be generated by PDMS microfluidic channels^3,15,16. In this method, collagen alignment is achieved by flowing polymerizing collagen through small microfluidic channels. These microfluidic channels can be made in a multitude of designs, and are easily adaptable to many platforms. Moreover, they are very economical as very small quantities of collagen and other reagents are used due to their diminutive sizes.

Provided here is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. In addition, a more advanced technique, wherein PDMS microfluidic channels are used to control the organization and alignment of the collagen matrix is also provided. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a 3-dimensional, physiological microenvironment.

Protocolo

1. A neutralização, diluição e Polimerização de colágeno Soluções de Investigação 3D e celulares contração Ensaios

1. No gelo no exaustor de cultura de tecidos estéreis, neutralizar colagénio (1: 1) com estéril, 100 mM de HEPES arrefecido com gelo em 2X PBS, pH 7,4, num tubo de 15 ml. Misture bem com uma pipeta de plástico até que a solução é homogénea e redemoinhos de mistura não são mais visíveis. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar durante o processo de mistura. Armazenar brevemente em gelo.
2. Diluir colagénio neutralizado para a concentração adequada com meio celular (tal como meio RPMI, DMEM, etc).
   1. Para calcular a quantidade de colagénio neutralizado necessária para compensar a concentração de colagénio desejado, utilizar a equação N = (D * V) / (S / 2), em que N é quantidade de colagénio neutralizado necessário, D é a concentração de colagénio desejado, V seja o volume final da concentração de colagénio desejado, e S é tele a partir da concentração de colágeno estoque.
   2. Levar-se a quantidade de colagénio neutralizado para o volume através da adição de uma solução de meio celular de células e. Misture bem e guarde em gelo até estar pronto para lançar.
      1. Exemplo: Para a 2 mg / ml de gel num volume de gel de 1 ml (volume típico para um molde de gel em 6 de placa bem ou 50 milímetros prato de vidro de fundo), em primeiro lugar multiplicar a concentração desejada (2 mg / ml) pelo volume final desejado (1 ml). Tome este número (2 mg) e dividi-lo pela metade da concentração de ações listadas na garrafa (9,49 mg / ml). Neste caso, a 0,42 ml de colagénio neutralizado são diluídas com 0,58 ml de mistura / célula meios.
3. Pipete o colagénio / célula / mistura meios gelada em qualquer uma cultura não-tecido tratado placa de 6 poços de 50 mm ou prato de vidro de fundo. Use ponta da pipeta para espalhar uniformemente a solução.
   NOTA: É importante a utilização de uma cultura não-tecido placa tratada para minimizar a fixação ou o crescimento das células fora do collagen gel.
4. Deixa-se polimerizar à temperatura ambiente durante cerca de 10 - 15 min. Os géis deve virar opaco após polimerização.
5. Depois ele se transformou opaco, mover prato ou prato para 37 ° C durante mais 45 - 60 min para terminar a polimerização.
6. Após 45 - 60 min, adicionar 2 - 3 ml de meio e solte géis de paredes do poço, executando uma dica p200 pipeta em torno do perímetro de bem ou prato. prato redemoinho delicadamente para soltar o gel. O gel de colágeno deve estar flutuando na mídia.

2. Western Blot, Cell Morfogênese e Gel Gontractility Assay

1. Para avaliar os níveis de proteína, morfologia ou contratilidade celular em relação ao ECM rigidez, começar por despejando géis de colagénio, de acordo com 1,1-1,6, semeado com células para a 7 - ensaio de 10 dias. Determine cada taxa de semeadura linha celular empiricamente dependendo da taxa de crescimento e de confluência. Para um ensaio de 10 dias, a densidade de sementeira pode variar de 20.000 - 100.000 células / gel.
2. Medircontractilidade celular, medir o diâmetro gel usando uma régua ou de uma câmara a cada 24 h ou no intervalo de tempo apropriado.
   Nota: Para além disso, as imagens correspondentes recolhidos a partir de um microscópio pode ser analisada para características morfológicas características da linha de células semeadas no gel, tal como estruturas do tipo acini, túbulos epiteliais, saliências celulares, e lameliapodia.
3. Para avaliar os níveis de proteína, lisar os géis em tampão RIPA, e processo para a análise Western blot de proteínas de interesse, como descrito em Wozniak et al. ¹⁷ e Gallagher et ai. ^18.
   1. IMPORTANTE: Em comparações de contractilidade entre as linhas celulares, para normalizar a contractilidade do ADN total, o que pode ser extraída a partir dos géis, conforme descrito por Lui, et al, ^19, ou para um imutáveis, proteínas (histonas arrumação, GAPDH, etc.) por Ocidental. análise de mancha, tal como descrito em Wozniak et al. ¹⁷ e Gallagher et ai. ¹⁸. Se a contagem de células dentro do gel usando um hemocitômetro, certifique-se para normalizar o número de células de área total gel como o gel de contratação vai se concentrar células.
4. géis alimentar a cada 3 - 4 dias, removendo 1 ml de meio e substitui-lo com 1 ml de meio fresco. Certifique-se de alimentar géis após a medição é tida como a adição de nova media / soro vai causar um aumento da contratilidade.

3. Geração de PDMS microcanais para o alinhamento de fibra de colagénio

Nota: Para gerar matrizes de colagénio alinhados, um molde para PDMS microcanais (Figura 2A) requer um mestre de silício SU-8 feita através de litografia ^suave-15.

1. Para tornar canais PDMS, misture PDMS completamente em um copo descartável com um palito de sorvete. Para um mestre de silicone 6 polegadas, misturar 20 g de base de elastómero com 2 g de agente de cura.
2. De gás-se a mistura de PDMS, colocando o copo descartável numa câmara de vácuo sob uma pressão de vácuo de550 milímetros de Hg. De-gás para o 1 - 1,5 h.
3. Enquanto de-gasificação do PDMS, prepare o mestre de silicone para derramar. Prepare colocando uma folha de filme de transparência sobre uma placa de aquecimento seguido pelo mestre silicone. Certifique-se de que o molde de microcanais voltado para cima.
   NOTA: Durante a fundição PDMS e cura, o mestre de silicone será imprensado entre duas folhas de filme de transparência.
4. Após 1-1,5 horas, remover os PDMS desgaseificado a partir da câmara de vácuo, e, lentamente, despeje sobre o mestre silicone.
   IMPORTANTE: Evite bolhas de ar. Continuam a despejar no centro de mestre, e permitir que a gravidade espalhe uniformemente.
   NOTA: A queda de PDMS não precisa de estender-se até a borda do mestre.
5. Depois de PDMS foi vertida para o mestre, aplicar uma segunda folha de película de transparência no topo do mestre de silicone e PDMS. Cuidadosamente, rolar a segunda folha de transparência para baixo na parte superior do mestre PDMS / silicone para evitar bolhas de ar. Não se apresse. PDMS devem ser agora espalhar uniformemente omestre ver.
6. Com cuidado, colocar uma folha de borracha no topo da transparência, seguido de uma "folha de acrílico 1/8.
7. Adicionar três 10 lb pesos no topo da folha de acrílico. Inicialmente, os pesos serão "flutuar". Permita-lhes para resolver e estabilizar antes de prosseguir.
8. Ajuste a temperatura placa de 70 C e cura PDMS durante 4 h. Deixe esfriar por mínimo de 1 hora adicional antes de perturbar.
9. Retire cuidadosamente folha superior de filme de transparência do wafer, e remover os canais com uma pinça.
10. Loja no prato livre de poeira até que esteja pronto para uso.

4. PDMS microcanais preparando para Uso

1. Coloque canais de cabeça para baixo em filme de transparência novo, limpo. Limpe todas as portas (Figura 2b), utilizando movimentos circulares com uma pinça afiada. Remova todos os fragmentos de PDMS.
2. canais limpo, usando um pedaço de fita adesiva como um pano de aderência. Aplique a fita para a superfície da bancada (lado adesivo para cima), e em seguida, definir o canaln superior. Pressione para baixo em canais com fim rodada de pinça para garantir um bom contacto. Retire e repetir em ambos os lados até que os restos visíveis é removido.
3. Transferência limpo, preparado canais PDMS em uma cónico de 50 ml com 70% de EtOH. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos. Descarte EtOH e substituir com frescos EtOH 70%. Loja em 70% EtOH até estar pronto para usar.
4. No tecido capa de cultura e usando técnicas assépticas, transferir os canais de PDMS para uma tampa de vidro limpo e estéril ou pratos com fundo de vidro. Coloque o canal lateral para cima e UV deleite até EtOH tenha evaporado.
5. Depois de seco, vire as PDMS para que os canais estão virados para baixo em direção a lamela. Pressione o canal de PDMS para baixo no vidro para fazer uma boa vedação. Adicionar um pedaço de PDMS estéreis para cobrir / fechar a porta do Center (porta B, Figura 2b). Deixe secar completamente antes de prosseguir.
6. Pré-revestimento no interior do canal com 10 ug de colagénio / ml em água esterilizada. Para revestimento, colocar uma gota 100 uL no topo de um eláel, e desenhar através de vácuo. Após 1 h a 37 ° C, encheram-se com os canais de transferência de solução de revestimento de colagénio a um frigorífico. Frio durante cerca de 15 - 30 min.
7. Remover solução de revestimento de colágeno com aspirador ou pipeta, e começar a preparação de colágeno.

5. Preparação de colágeno para uso em microcanais

1. Em gelo, neutralizar o colagénio (1: 1) com mM de HEPES arrefecido com gelo 100 em 2X PBS, pH 7,4. Misture bem até ficar homogénea (Para mais detalhes, consulte a secção 1.1).
2. Diluir colágeno neutralizado com as concentrações adequadas com a mídia celular (Para mais detalhes, consulte a secção 1.2). Incubar durante 15 min em gelo.
3. Ao mesmo tempo, frio canais em gelo montado.
   NOTA: O objetivo é ter todos os componentes para o processo de canal a 4 ° C ou abaixo. O colagénio temperatura e tempo de nucleação são parâmetros importantes para o processo de polimerização, e pode ser o ponto de partida para a optimização adicional, se necessário.
4. CounAs células T com um hemacitómetro e ressuspender na densidade de sementeira adequado neste momento. Para facilidade de cálculo, ressuspender, 1 - 3 milhões de células / ml. (Para mais detalhes, veja também a secção 2.1).
5. Uma vez que as células foram contadas e 15 min passaram, proceda ao colágeno vazamento.

6. Verter alinhados e aleatória de colágeno microcanais

1. Antes de desenhar colágeno através de canais, ajustar e definir a pressão de vácuo com um regulador de vácuo em linha. A pressão de vácuo fornece a força para induzir e controlar a taxa de fluxo de colagénio, que determina o grau de alinhamento.
   1. Para matrizes aleatórias ou não alinhadas, usar um canal de largura (3 mm de largura x 200 um de altura) com uma pressão de vácuo de 10 mm Hg ou menos.
   2. Para matrizes alinhadas, utilizar o canal estreito (1 mm de largura x 200 um de altura) com uma pressão de vácuo de 60 mm Hg ou superior.
2. Remover canal montado a partir de gelo e coloque em superfície limpa e higienizada de fluxo laminar hood.
3. Trabalhe rapidamente e carregar 120 - 150 l de colágeno neutralizado na porta A (Figura 2b).
4. Desenhar colagénio através do canal, colocando uma pipeta de 25 ml ligado à linha de vácuo através da porta c (Figura 2b). Desenhe colágeno através de um único movimento, uniforme. IMPORTANTE: Para matrizes aleatórias ou não alinhados, desenhar colágeno lentamente através do canal (cerca de 0,5-1 mm por segundo), e parar uma vez que atinge o fim. Para matrizes alinhados, desenhe o colágeno em mais rapidamente, mas tome cuidado para evitar bolhas de ar.
5. Retirar cuidadosamente o excesso de colágeno da região do porto com Pipetman p200 ou aspirador.
6. Coloque PDMS manchas estéreis sobre ambos os portos A e C. Todas as portas devem agora ser cobertas.
7. Após 2 - 3 minutos, retire o centro remendo PDMS (porta B) e adicione 2 - 3 mL de células (5 - 10 mil células) na porta de centro. Permitir que a polimerizar parcialmente (girar opaco) à temperatura ambiente durante mais 10 - 15 min.
8. após 10- 15 min, a transferência para 37 ° C durante mais 15 - 30 minutos para terminar a polimerização. Remover as tampas de PDMS e adicionar mídia para cobrir completamente as células de canal e de cultura, conforme necessário. As células podem ser alimentados através da remoção de um ml da velha mídia, e substituí-lo com um ml de novas mídias.

Resultados

Embora ensaios 3D pode ser feito no interior da mesma rigidez do gel de colagénio, variando a rigidez de gel pode ser utilizado para determinar como as células respondem a alterações mecânicas no seu microambiente celular. Um hidrogel colagénio duro é definido como um gel em que as células são incapazes de embutidos localmente contrair o colagénio circundante. A contractilidade intrínseca de diferentes tipos de células é único, e portanto, é melhor começar com uma curva d...

Discussão

géis de colágeno 3D são uma adição valiosa para a nossa caixa de ferramentas para compreender como as células interpretam e respondem ao seu microambiente local. Este manuscrito proporcionou um protocolo muito básico para a incorporação de células dentro de uma matriz de colagénio 3D, e reprodutível para gerar matrizes de fibras de colagénio aleatórios ou alinhadas. Ambos os protocolos funcionar como plataformas adaptáveis ​​em que diferentes isoformas de colagénio, agentes de ligação cruzada, ou d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Concentration Rat Tail Collagen	Corning	354249
SylGard184 elastomer kit	Corning	NC9285739	Elastomer for PDMS channels
HEPES	Fisher	BP310	For HEPES neutralization buffer
KCl	Fisher	BP366	For HEPES neutralization buffer
KH2PO4	Fisher	BP362	For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4	Fisher	S374	For HEPES neutralization buffer
NaCl	Fisher	BP358	For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	Corning	351146
50 mm glass bottom dish	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator	Bel-Art	F4200-2021	Degassing chamber for PDMS
transparency film	3M	pp2950	Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator	Precision Medical	PM3100	Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet	Amazon	Plexiglass sheets	for pouring PDMS microchannels
10 lb weights	Amazon	CAP Barbell	for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes	Fisher	352097
50 ml Conical tubes	Fisher	352098
Plastic pipets	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH	Fisher	NC9663244