JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Abstract

وقد صممت هذه الدراسة لتقييم تأثير وقائي من سلالة العصوية الرقيقة ضد مضاعفات للإجهاد الحراري. واستخدمت اثنان وثلاثون الفئران سبراغ داولي في هذه الدراسة. تم علاج الحيوانات شفويا مرتين في اليوم لمدة يومين مع B. الرقيقة BSB3 سلالة أو برنامج تلفزيوني. في اليوم التالي بعد العلاج الاخير، تم تقسيم كل مجموعة وضعت مجموعتين تجريبيتين (معاملة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومعاملة واحدة مع B. الرقيقة) في 45 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. بقيت مجموعات المراقبة اثنين لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الموت الرحيم كانت جميع الفئران وجرى تحليل العوامل المختلفة في جميع الفئات. يتم تسجيل الآثار الضارة للإجهاد الحراري من انخفاض ارتفاع الزوائد ومجموع سمك الغشاء المخاطي في ظهارة الأمعاء. النبات من البكتيريا من التجويف. زيادة تحوصل من كريات الدم الحمراء ورفع مستوى عديدات سكر شحمية (LPS) مستوى في الدم. يتم تقييم فعالية وقائية من العلاج قبلمداخلة تكلم فيها متكلم من هذه الآثار الجانبية. تم تعيين بروتوكول يصل لعلاج عن طريق الفم للجرذان مع البكتيريا للوقاية من مضاعفات الإجهاد الحراري، ولكن هذا البروتوكول يمكن تعديلها واستخدامها لطرق أخرى للإدارة وتحليل مركبات مختلفة.

Introduction

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses1. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions6. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis13 and have beneficial effects on the host14. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro15,16 and in clinical trials17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية التي IACUC جامعة أوبورن، صحراء، ولاية ألاباما.

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، صحون والبكتيرية الثقافة

  1. تطعيم 10 مل من المرق المغذي في قارورة مع مستعمرة واحدة من ثقافة BSB3 العصوية الرقيقة، ونمت بين عشية وضحاها على طبق من المغذيات أجار.
  2. جعل 500 مل من تبوغ المتوسطة 19 (لكل لتر: Bacto المغذيات مرق، 8 غرام؛ 10٪ (ث / ت) بوكل، 10 مل؛ 1.2٪ (ث / ت) MgSO 4 × 7H 2 O، 10 مل، أجار، 15 ز) والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. السماح لتبرد إلى 50 درجة مئوية وإضافة الحلول العقيمة التالية: 1 M الكالسيوم (NO 3) 2، 1 مل. 0.01 M MnCl 2، 1 مل. FeSO 1 ملم 4، 1 مل.
  3. متوسطة استعداد بارد إلى 40 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتصب 25 مل في كل من 20 أطباق بتري معقمة في الحكومة العقيمة. دع المتوسطة يصلب بين عشية وضحاها.
  4. انتشرت 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها من Bacillus الرقيقة BSB3 على سطح المتوسط ​​في أطباق بتري. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام حتى 90٪ تبوغ. الكشف عن الجراثيم المرحلة المشرقة التي كتبها عالية الدقة المجهر.
  5. البكتيريا الحصاد عن طريق إضافة 1 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) على لوحة وكشط البكتيريا من سطح باستخدام رش خلية العقيمة. تخزين تعليق في الثلاجة لحين الحاجة إليها.
  6. تأكيد بقاء البكتيريا عن طريق طلاء 0.1 مل من التخفيف المناسب (10 -5 إلى 10 -6) من تعليق البكتيرية على لوحات متوسطة تبوغ تليها الحضانة ل18 - 24 ساعة على 37 درجة مئوية.
  7. عدد المستعمرات البكتيرية على لوحات باستخدام عداد مستعمرة وحساب عيار البكتيريا في تعليق اختبارها. إعداد تعليق البكتيرية مع التركيز النهائي 1 × 10 8 كفو / مل في برنامج تلفزيوني.

2. الحيوانات

  1. استخدام 32 من ذكور فئران سبراغ داولي (250-300 ز). الحفاظ على الحيوانات في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض مع حرية الوصول إلى طعام بيليه القياسي والمياه. إنشاء متوسط ​​درجة حرارة (21 ± 1 درجة مئوية) والرطوبة (50 ± 5٪)، ودورة ضوء الظلام 12 ساعة.

3. تصميم تجريبي

  1. بدء العلاج من الحيوانات عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم 11، 2 بعد أيام من التأقلم. استخدام المحاقن مع إبرة أنبوب تغذية عن طريق الفم. علاج 16 الفئران مع B. الرقيقة تعليق BSB3 (1 مل ​​لكل فأر) مرتين في اليوم لمدة يومين (B. مجموعة الرقيقة). علاج 16 الفئران مع برنامج تلفزيوني (1 مل ​​لكل فأر) مرتين في اليوم لمدة يومين (مجموعة PBS) (الشكل 1).
  2. بعد العلاج، تقسيم كل مجموعة (8 الفئران في كل مجموعة) المجموعة: 1- التحكم (PBS / لا الإجهاد)، المجموعة 2- B. الرقيقة (B. الرقيقة / لا الإجهاد)، المجموعة 3- الإجهاد (PBS / الإجهاد الحراري) والمجموعة 4- B. الرقيقة + الإجهاد (B. الإجهاد الرقيقة / الحرارة).
  3. قياس درجة حرارة الجسم من كل فأر باستخدام كهربائيترونيك ميزان الحرارة الرقمي. حافظ على الفئران المجموعات 1 و 2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. مكان الحيوانات في المجموعات 3 و 4 في غرفة المناخ في 45 درجة مئوية والرطوبة النسبية 55٪ لمدة 25 دقيقة.
  4. بعد ذلك، وقياس درجة حرارة الجسم من كل فأر في جميع الفئات باستخدام ميزان الحرارة الرقمي الالكتروني. إخضاع جميع الحيوانات في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعة.
  5. تخدير الفئران مع isoflurane (2-4٪) في جرة التخدير قابل للغلق ومراقبة حتى يتم تخدير الفئران عميقا (غياب استجابة لقرصة أخمص القدمين). الموت ببطء الفئران عن طريق قطع الرأس السريع مع المقصلة.
  6. جمع الدم جذع من كل فأر 20 (15-16 مل) مع ماصات apyrogenic في أنابيب apyrogenic للحصول على المصل وعلى الفور أخذ عينات من الدم (7 ميكرولتر من كل فأر) مع ماصة للفحص المجهري.
  7. وضع أنابيب مع الدم في الثلاجة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للتخثر. أنابيب الطرد المركزي في 20 درجة مئوية، 7000 x ج لمدة 10 دقيقة وبسرعةإزالة المصل مع ماصة. قسامة المصل تم الحصول عليها من كل فأر في 50 مجلدا ميكرولتر ومخزن في -20 درجة مئوية حتى الفحص.

4. إجراء العمليات الجراحية

  1. قص / تقليم جميع الفراء من البطن والصدر من الجانب السفلي من الذبيحة مع المقصات الكهربائية. وضع الجثة في خزانة معقمة وعلاج سطح حلق الذبيحة مع 70٪ من الكحول.
  2. استخدام مشرط معقم لخلق شق خط الوسط من البطن. إزالة الكبد والغدد الليمفاوية المساريقي والطحال والأمعاء الدقيقة من كل فأر باستخدام الملقط معقمة.

5. تحليل إزفاء الجرثومي

  1. وضع كل عينة من الكبد والغدد الليمفاوية والطحال المساريقي في أنابيب معقمة قبل وزنه ووزن. حساب وزن العينة أن هناك فرق بين وزن أنبوب مع عينة والوزن من أنبوب فارغ.
  2. إضافة برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب للحصول على تخفيف 01:10 (ث / ت) لعينة وhomogenize كل عينة مع الخالط الأنسجة زجاجي معقم للحصول على تعليق متجانسة 21.
  3. جعل التخفيفات المتسلسلة (10 -1 إلى 10 -4) من كل عينة في برنامج تلفزيوني العقيمة. لوحة 0.1 مل من جميع التخفيفات من كل الأنسجة على سطح لماكونكي و 5٪ أجار الدم والبروسيلا أجار الدم مع هيمن (0.005 غرام / لتر) وفيتامين K1 (0.01 جم / لتر) لوحات.
  4. احتضان لماكونكي و 5٪ لوحات أجار الدم هوائيا والبروسيلا لوحات أجار الدم تحت الظروف اللاهوائية عند 37 درجة C 22.
  5. عدد مستعمرات البكتيريا الهوائية بعد 24 ساعة، ومستعمرات البكتيريا اللاهوائية بعد 48 ساعة من الحضانة باستخدام عداد مستعمرة. التعبير عن النتائج على النحو عدد الوحدات المكونة للمستعمرة (كفو) في غرام من الأنسجة.

6. تحليل النسيجي

  1. إزالة عينات الأمعاء الصغيرة من كل الفئران من قبل الإجراء الجراحي (الخطوات 4،1-4،2). إصلاح العينات في تثبيتي بوان، تضمينها في البارافين،إعداد 6 ميكرون الأقسام والفروع وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام الإجراءات القياسية 23.
  2. استخدام نظام المجهر عالية الدقة لقياس ارتفاع الزغابات المعوية ومجموع سمك الغشاء المخاطي في كل عينة (التكبير 100X) 24. تحليل 4 عينات من كل الفئران وجعل لا يقل عن عشرين القياسات في كل عينة. التعبير عن النتائج في ميكرومتر.

7. خلوى الفحص

  1. استخدام مجموعات تجارية الفئران ELISA لIL-1β. IL-6؛ TNF-α؛ INF-جاما، وIL-10 لقياس مستويات السيتوكينات في المصل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. توليد المنحنيات القياسية لكل مجموعة من عينات يعاير باستخدام معايير لعدة ذات الصلة. تحديد مستوى السيتوكينات في كل عينة بمقارنة البيانات التجريبية مع المنحنى القياسي المناسب.

8. lipopolysaccharide في الفحص

  1. تحليل مستوى LPS في مصل الدم باستخدام الفئران عدة LPS ELISA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تقدير تركيز LPS في عينات من خلال المقارنة بين القيم التي تم الحصول عليها مع قيم المنحنى القياسي.

9. عالية الدقة المجهر الضوئي من الدم

  1. استخدام نظام المجهر هو موضح سابقا 25،26. استخدام منصة عزل الاهتزاز كقاعدة لنظام المجهر والكاميرا والفيديو والكمبيوتر 25 لتسجيل الصور الحية. معايرة الصور اختبار باستخدام شريحة ريتشاردسون كما هو موضح سابقا (27).
  2. ضع 7 ميكرولتر من الدم المسحوبة الطازجة من كل فأر على شريحة زجاجية، ساترة، صورة وتسجيل عشرة إطارات صورة 72 × 53.3 ميكرون 2 في كل عينة (التكبير 1،700X).
  3. قياس تركيز الحويصلات باستخدام البرمجيات التي توفر عالية الدقة، عرض مباشر الصور الضوئية في الوقت الحقيقي. دراسة ما لا يقل عن 20 لقطة صورة لكل حالة تجريبية 28.

10. Statisالعرات

  1. التعبير عن كل القيم كما المتوسط ​​والانحراف المعياري. إجراء تحليل إحصائي والتآمر الرسم البياني. تحليل النتائج مع اثنين من عينة اختبار t، تعيين مستوى أهمية في 0.05 لتحديد الدلالة الإحصائية.

النتائج

وكانت درجة حرارة الجسم يعني من الحيوانات قبل ومباشرة بعد الإجهاد الحراري 36.7 ± 0.07 درجة مئوية و40.3 ± 0.17 درجة مئوية على التوالي (P <0.05). أدى تعرض الفئران للحرارة (المجموعة 3) في إعاقة واضحة في ارتفاع الزغب ومجموع سمك الغشاء المخاطي (الشكلا...

Discussion

يؤدي التعرض إلى ارتفاع درجة الحرارة في ظروف صحية خطيرة 29. الوقاية والكشف المبكر عن المضاعفات المتصلة بالإجهاد الحراري هي ذات أهمية حيوية 30. بروتوكول المعروضة يمكن استخدامها لتقييم فعالية من الطرق المختلفة للوقاية من الإجهاد الحراري الآثار الس...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

This work was supported by the Auburn University fund FOP 101002-139294-2050.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOP4417
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA 64-17-5
AgarVWR97064-334
MacConkey agar platesVWR470180-742
5% blood agar platesVWR89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin KVWR89405-032
Bouin’s FixativeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA15990
IL-10 Rat ELISA kitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0101
IL-1beta Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0011
IL-6 Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0061
INF-gamma Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC4021
TNF-alpha Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC3011
Rat LPS ELISA KitNeoBioLab, MA, USARL0275
Environmental Chamber 6020-1Caron, Marietta, OH, USA6020-1
Centrifuge Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USAOptima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical systemCitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counterFisher Scientific , Pittsburgh, PA, USARE-3325
FreezerHaier, Brooklyn, NY, USAHCMO50LA
Ultra microplate readerBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx 808
Auto Strip WasherBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx50
PipettesGilson, Pipetman, FranceP100, P200, P1000
C24 Incubator ShakerNew Brunswick Scientific, Enfield, CT, USAClassic C24
Rocking Shaker Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA55
Petri dishesFisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA875713100 mm x 15 mm
SterilGard III AdvanceThe Baker Company, Sanford, ME, USASG403
Culture Growing FlasksCorning Incorporated, Corning, NY, USA4995PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.4001
Sony DXC-33 Video cameraSony
Richardson test slideElectron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA80303
Millipore water purification systemMilliporeDirect-Q
Image-Pro Plus softwareMedia Cybernetics, MD, USA
Triple Beam BalanceOHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, DounceVWR71000-518

References

  1. Crandall, C. G., Gonzalez-Alonso, J. Cardiovascular function in the heat-stressed human. Acta Physiol. 199, 407-423 (2010).
  2. Lambert, G. P. Role of gastrointestinal permeability in exertional heatstroke. Exerc. Sport Sci. Rev. 32, 185-190 (2004).
  3. Yu, J., et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study. Comp. Biochem. Physiol. A-Mol. Integr. Physiol. 156, 119-128 (2010).
  4. Moseley, P. L., Gisolfi, C. V. New Frontiers in Thermoregulation and Exercise. Sports Med. 16, 163-167 (1993).
  5. Lambert, G. P. Stress-induced gastrointestinal barrier dysfunction and its inflammatory effects. J. Anim. Sci. 87, 101-108 (2009).
  6. Berg, A., Muller, H. M., Rathmann, S., Deibert, P. The gastrointestinal system - An essential target organ of the athlete's health and physical performance. Exerc. Immunol. Rev. 5, 78-95 (1999).
  7. Khan, M. W., et al. Microbes, intestinal inflammation and probiotics. Expert Rev Gastroent. 6, 81-94 (2012).
  8. Quigley, E. M. M. Prebiotics and Probiotics: Their Role in the Management of Gastrointestinal Disorders in Adults. Nutr Clin Pract. 27, 195-200 (2012).
  9. Gore, C., et al. Treatment and secondary prevention effects of the probiotics Lactobacillus paracasei or Bifidobacterium lactis on early infant eczema: randomized controlled trial with follow-up until age 3 years. Clin Exp Allergy. 42, 112-122 (2012).
  10. Gomes, A. C., Bueno, A. A., de Souza, R. G. M., Mota, J. F. Gut microbiota, probiotics and diabetes. Nutr. J. 13, (2014).
  11. Eutamene, H., et al. Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress-induced gut permeability and sensitivity increase in rats. J. Nutr. 137, 1901-1907 (2007).
  12. Ait-Belgnaoui, A., et al. Lactobacillus farciminis treatment attenuates stress-induced overexpression of Fos protein in spinal and supraspinal sites after colorectal distension in rats. Neurogastroenterol. Motil. 21, 585-593 (2009).
  13. Fujiya, M., et al. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal Homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter. Cell Host Microbe. 1, 299-308 (2007).
  14. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiol. 28, 214-220 (2011).
  15. Pinchuk, I. V., et al. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. Antimicrob Agents Ch. 45, 3156-3161 (2001).
  16. Sorokulova, I. B., Kirik, D. L., Pinchuk, I. V. Probiotics against Campylobacter pathogens. J. Travel Med. 4, 167-170 (1997).
  17. Gracheva, N. M., et al. The efficacy of the new bacterial preparation biosporin in treating acute intestinal infections. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. , 75-77 (1996).
  18. Horosheva, T. V., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic-associated diarrhoea: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. JMM Case Report. 1, (2014).
  19. Sorokulova, I. B., Krumnow, A. A., Pathirana, S., Mandell, A. J., Vodyanoy, V. Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores. Biotechnol. Prog. 24, 1147-1153 (2008).
  20. Vogel, H. G., Vogel, W. H., Vogel, H. G., Vogel, W. H. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. eds H.G. Vogel & W.H. Vogel. , 658-659 (1997).
  21. Bailey, M. T., Engler, H., Sheridan, J. F. Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice. J. Neuroimmunol. 171, 29-37 (2006).
  22. Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118, 229-241 (2004).
  23. Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. J. Appl. Physiol. 100, 1400-1409 (2006).
  24. Ribeiro, S. R., et al. Weight loss and morphometric study of intestinal mucosa in rats after massive intestinal resection. Influence of a glutamine-enriched diet. Rev. Hosp. Clìn. Fac. Med. S. Paulo. 59, 349-356 (2004).
  25. Vainrub, A., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Resolution of 90 nm (lambda/5) in an optical transmission microscope with an annular condenser. Opt Lett. 31, 2855-2857 (2006).
  26. Moore, T., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Oral administration of Bacillus subtilis strain BSB3 can prevent heat stress-related adverse effects in rats. J Appl Microbiol. 117, 1463-1471 (2014).
  27. Richardson, T. M. Test slides: Diatoms to divisions-What are you looking at. Proc Roy Microsc Soc. 22, 3-9 (1988).
  28. Moore, T., Sorokulova, I., Pustovyy, O., Globa, L., Vodyanoy, V. Microscopic evaluation of vesicles shed by rat erythrocytes at elevated temperatures. J Therm Biol. 38, 487-492 (2013).
  29. Leon, L. R., Helwig, B. G. Heat stroke: Role of the systemic inflammatory response. J. Appl. Physiol. 109, 1980-1988 (2010).
  30. Kumar, Y., Chawla, A., Tatu, U. Heat Shock Protein 70 as a Biomarker of Heat Stress in a Simulated Hot Cockpit. Aviat Space Env Med. 74 (7), 711-716 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved