מניעת חום מתח תופעות לוואי בחולדות על ידי<em&gt; Subtilis Bacillus</em&gt; זנים

Summary

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Abstract

מחקר זה נועד להעריך את ההשפעה המגנה של זן subtilis Bacillus נגד סיבוכים הקשורים לחום מתח. שלושים ושתיים חולדות Sprague-Dawley שימשו במחקר זה. בעלי החיים טופלו דרך פה פעם ביום למשך ימים עם B. subtilis BSB3 זן או PBS. למחרת, לאחר הטיפול האחרון, כל קבוצה חולקה ושתי קבוצות ניסוי (אחד שטופל PBS ואחד שטופל ב subtilis) הוצבו 45 ^o צלזיוס למשך 25 דקות. שתי קבוצות בקרה נשאר במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. כל החולדות היו מורדמות ופרמטרים שונים נותחו בכל הקבוצות. השפעות שליליות של עומס חום רשומות על ידי הירידה של גובה villi ועובי רירי הכולל באפיתל המעי; טרנסלוקציה של חיידקים מן לומן; גדל vesiculation של אריתרוציטים והעלאה של lipopolysaccharides (LPS) רמה בדם. יעילות המגן של טיפול מוערכת על ידי מראשvention של תופעות לוואי אלה. הפרוטוקול הוקם לטיפול האוראלי של חולדות עם חיידקים למניעת סיבוכי עומס חום, אבל פרוטוקול זה יכול להיות משונה המשמש מסלולים אחרים של ממשל ועל ניתוח של תרכובות שונות.

Introduction

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses¹. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases^2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation^4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions⁶. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders^7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models^11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis¹³ and have beneficial effects on the host¹⁴. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro^15,16 and in clinical trials^17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

Protocol

כל הפרוצדורות אושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת אובורן, אובורן, אלבמה.

1. הכנת תרבות מדיה, צלחות תרבית חיידקים

1. לחסן 10 מ"ל של מרק מזין בבקבוק עם מושבה אחת של תרבות BSB3 subtilis Bacillus, גדל לילה על צלחת אגר מזין.
2. הפוך 500 מ"ל של נביגה בינוני ¹⁹ (לליטר: מרק מזין Bacto, 8 גרם; 10% (w / v) KCl, 10 מ"ל; 1.2% (w / v) MgSO ₄ x 7H ₂ O, 10 מ"ל; אגר, 15 ז) ו חיטוי ב 121 ^מעלות צלסיוס למשך 20 דקות. אפשר לקרר 50 ^o C ולהוסיף הפתרונות סטרילי הבאים: 1 M Ca (NO _{3) 2,} 1 מ"ל; 0.01 M MnCl _2, 1 מ"ל; 1 מ"מ FeSO _4, 1 מ"ל.
3. בינוני מוכן מצנן 40 ^o צלזיוס למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר ויוצק 25 מיליליטר לתוך כל אחת 20 מנות סטרילי פטרי בקבינט סטרילי. בואו המדיום לחזק הלילה.
4. מורחים 0.5 מ"ל של תרבות הלילה של Bacillus subtilis BSB3 על פני השטח של המדיום צלחות פטרי. דגירת התרבות ב 37 ^מעלות צלסיוס במשך 5 ימים עד נביגה 90%. לחשוף נבגים שלב בהיר על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.
5. חיידקים קציר על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר פוספט סטרילית (PBS) לצלחת וחורקים חיידקים ממשטח באמצעות מפזר תא סטרילי. אחסן את ההשעיה במקרר עד הצורך.
6. אשר הכדאיות של חיידקים על ידי ציפוי 0.1 מ"ל של דילול המתאים (10 ^-5 עד 10 ^-6) של השעיה חיידקים על צלחות בינוני נביגה ואחריו הדגירה של 18 - 24 שעות ב 37 ^מעלות צלסיוס
7. הרוזן מושב חיידקים על הצלחות באמצעות מונה מושבה ולחשב את כייל של חיידקים בתרחיף הנבדק. כן השעיה חיידקי עם הריכוז הסופי 1 x 10 ⁸ CFU / ml ב- PBS.

2. בעלי חיים

1. השתמש 32 חולדות זכרים ספראג-Dawley (250 - 300 גרם). לשמור על חיות בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים עם גישה חופשית צ'או ומים גלולים סטנדרטיות. להקים טמפרטורה ממוצע (21 ± 1 ^o C), לחות (50 ± 5%) ו מחזור אור כהה 12 שעות.

3. עיצוב ניסיוני

1. התחל יחס לבעלי החיים על ידי gavage פי ^11, אחרי 2 ימים של התאקלמות. השתמש מזרק עם מחט gavage הפה. פנקו 16 חולדות עם B. subtilis ההשעיה BSB3 (1 מ"ל לכל חולדה) פעמיים ביום למשך יומיים (קבוצת 'subtilis). פנקו 16 חולדות עם PBS (1 מ"ל לכל חולדה) פעמיים ביום למשך יומיים (קבוצת PBS) (איור 1).
2. לאחר הטיפול, חלוקה משנית בכל קבוצה (8 חולדות לכל קבוצה): קבוצה 1- מלאה (PBS / לא מתח), קבוצה 2 ב ' subtilis (ב subtilis / לא מתח), מתח קבוצה 3- (מתח PBS / חום) וקבוצת 4- ב subtilis + מתח (סטרס B. subtilis / חום).
3. מדדו את חום רקטלי של כל עכברוש באמצעות ELECTRONIC מדחום דיגיטלי. שמור חולדות של קבוצות 1 ו -2 בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. חיות של קבוצות מקום 3 ו -4 בתא האקלים ב 45 ^מעלות צלסיוס ולחות יחסית של 55% במשך 25 דקות.
4. לאחר מכן, למדוד את החום רקטלי של כל עכברוש בכל הקבוצות באמצעות מדחום דיגיטלי אלקטרוני. מניחים את כל חיות בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות.
5. להרדים חולדות עם isoflurane (2 - 4%) בצנצנת הרדמה סגר ולבחון את החולדות עד מורדמים עמוק (בהעדר בתגובה קמצוץ הבוהן). להרדים חולדות על ידי עריפת ראש מהירה עם גיליוטינה.
6. איסוף דם גזע מכל עכברוש ²⁰ (15 - 16 מ"ל) עם טפטפות apyrogenic לתוך צינורות apyrogenic להשיג סרום ומיד לקחת דגימות דם (7 μl מכל עכברוש) עם טפטפת לבדיקה מיקרוסקופית.
7. שים צינורות עם הדם במקרר לפחות 30 דקות כדי לאפשר קרישה. צינורות צנטריפוגה ב 20 ^מעלות צלסיוס, 7,000 XG במשך 10 דקות ובמהירותלהסיר בסרום עם טפטפת. סרום Aliquot המתקבל בכל עכברוש לתוך 50 כרכים μl ולאחסן ב -20 ^מעלות צלסיוס עד assay.

4. הליך כירורגי

1. גזור / לקצץ את כל הפרווה מן הבטן ואת בית החזה של החלק התחתון של הפגר עם מספריים חשמליים. מניח את הפגר בתוך ארון סטרילי ולטפל השטח המגולח של הפגר עם אלכוהול 70%.
2. השתמש אזמל סטרילי כדי ליצור חתך קו האמצע של הבטן. סר כבד, בלוטות לימפה mesenteric, טחול ומעי דק מכל עכברוש באמצעות פינצטה סטרילית.

5. ניתוח של טרנסלוקציה בקטריאלי

1. מניחים כל דגימה של הכבד, בלוטות לימפה mesenteric והטחול לתוך צינורות סטרילי-שקל מראש ולשקול. חשב את המשקל של המדגם כהבדל בין המשקל של צינור עם מדגם והמשקל של שפופרת ריקה.
2. הוסף PBS סטרילי כדי צינור להשיג דילול 1:10 (w / v) של המדגם homogenize כל דגימה עם homogenizer רקמות זכוכית סטרילית לקבל השעיה הומוגנית ^21.
3. הפוך את דילולים סדרתי (10 ^-1 עד 10 ^-4) של כל דגימה ב PBS סטרילית. פלייט 0.1 מ"ל של כל דילולים של כל רקמות על פני MacConkey ו -5% אגר דם Brucella דם אגר עם hemin (0.005 g / L) K1 ויטמין (0.01 גר '/ ל') צלחות.
4. דגירת MacConkey של וצלחות אגרו דם 5% אירוביים ו צלחות אגרו דם Brucella בתנאים אנאירוביים ב 37 ^o C ^22.
5. רוזן מושבות של חיידקים אירוביים לאחר 24 שעות, ומושבות של חיידקים אנאירוביים לאחר 48 שעות של דגירה בעזרת מונה מושבה. לבטא את התוצאות על פי מספר יחידות-מושבה להרכיב (CFU) בתוך גרם של רקמה.

6. ניתוח היסטולוגית

1. הסירו דגימות מעי דקות מכל עכברוש ידי ההליך כירורגי (צעדים 4.1 - 4.2). תקן דגימות של קבע Bouin, להטביע פרפין,להכין 6 מיקרומטר חלקים וחתכים הכתם עם באמצעות hematoxylin ו eosin נהלים קבועים ^23.
2. השתמש במערכת מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה למדידת גובה של villi מעי ועובי רירי סך כל דגימה (100X הגדלה) ^24. לנתח 4 דגימות מכל עכברים ויגרמו לפחות עשרים מדידות במדגם אחד. אין מהיר תוצאות מיקרומטר.

7. Assay ציטוקין

1. השתמש ערכות ELISA העכברוש מסחריות-1β IL; IL-6; TNF-α; INF-γ, ו- IL-10 כדי למדוד רמות ציטוקינים בסרום על פי פרוטוקול של היצרן.
2. צור עקומות סטנדרטיות עבור כל קבוצה של דגימות assayed באמצעות סטנדרטים עבור הערכה הרלוונטית. הגדר את רמת ציטוקינים כל דגימה על ידי השוואה של נתוני ניסוי עם עקומת התקן המתאימה.

8. Assay lipopolysaccharide

1. לנתח ברמה של LPS בסרום באמצעות ערכת עכברוש LPS ELISA פיהפרוטוקול של היצרן. הערכת ריכוז LPS בדגימות על ידי השוואה של הערכים שהתקבלו עם הערכים של עקומת סטנדרט.

9. מיקרוסקופי אור רזולוציה הגבוהה של דם

1. השתמש במערכת מיקרוסקופ שתואר לעיל ^25,26. השתמש פלטפורמת בידוד רעידות כבסיס למערכת מיקרוסקופ ומצלמת וידאו ומחשב ²⁵ להקליט את התמונות בשידור החיות. לכייל תמונות בדיקה באמצעות שקופיות ריצ'רדסון כפי שתוארו לעיל ^27.
2. מניח 7 μl של דם טרי שנשאב בכל עכברוש בשקופית זכוכית, coverslip, לצלם ולהקליט עשר מסגרות תמונה של 72 × 53.3 מיקרומטר ² בכל מדגם (הגדלה 1,700X).
3. למדוד את ריכוז של שלפוחית ​​באמצעות תוכנה המספקת תמונות אופטיות-נוף ישיר ברזולוציה גבוהה בזמן אמת. בדוק מינימום של 20 מסגרות תמונה עבור כל תנאי הניסוי ^28.

10. Statisטיקים

1. אין מהיר כל הערכים כמו תוחלת וסטיית תקן. בביצוע ניתוחים סטטיסטיים והתוויית גרף. לנתח את התוצאות עם מבחן t שני מדגם, להגדיר את הרמה המובהקת 0.05 להגדיר מובהקות סטטיסטיות.

תוצאות

טמפרטורת הגוף הממוצעת של בעלי חיים לפני ומיד אחרי עומס החום היה 36.7 ± 0.07 ^מעלות צלסיוס ו -40.3 ± 0.17 ^מעלות צלסיוס, בהתאמה (P <0.05). חשיפה של חולדות לחום (קבוצה 3) הביאה עיכוב משמעותי של גובה villi ועובי רירי כולל (איורים 2, 3). אוראלי של זן BSB3 ל?...

Discussion

חשיפת תוצאות בטמפרטורה גבוהה בתנאים בריאותיים חמורים ^29. מניעה וגילוי מוקדם של סיבוכים הקשורים עומס החום הם בעלי חשיבות חיונית ^30. הפרוטוקול המובא יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של גישות שונות למניעת תופעות לוואי עומס חום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
MacConkey agar plates	VWR	470180-742
5% blood agar plates	VWR	89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K	VWR	89405-032
Bouin’s Fixative	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Rat ELISA kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC4021
TNF-alpha Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Rat LPS ELISA Kit	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Environmental Chamber 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Centrifuge	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counter	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Freezer	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra microplate reader	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Classic C24
Rocking Shaker	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA	55
Petri dishes	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.	4001
Sony DXC-33 Video camera	Sony
Richardson test slide	Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA	80303
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, Dounce	VWR	71000-518