Prevención de Estrés Térmico efectos adversos en ratas<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

Resumen

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Resumen

Este estudio fue diseñado para evaluar el efecto protector de la cepa de Bacillus subtilis contra las complicaciones relacionadas con el estrés por calor. Treinta y dos ratas Sprague-Dawley se utilizaron en este estudio. Los animales se trataron por vía oral dos veces al día durante dos días con B. subtilis cepa BSB3 o PBS. El día siguiente después del último tratamiento, cada grupo se dividió y se colocaron dos grupos experimentales (uno tratado con PBS y uno tratado con B. subtilis) a 45 ^° C durante 25 min. Dos grupos de control permanecieron durante 25 min a temperatura ambiente. Todas las ratas se sacrificaron y los diferentes parámetros se analizaron en todos los grupos. Los efectos adversos del estrés por calor son registrados por la disminución de la altura de las vellosidades y el grosor total de la mucosa en el epitelio intestinal; translocación de bacterias desde el lumen; aumento de la vesiculación de los eritrocitos y la elevación de los lipopolisacáridos (LPS) el nivel en la sangre. La eficacia protectora de tratamiento se evaluó por prevención de estos efectos secundarios. El protocolo se creó para el tratamiento oral de ratas con bacterias para la prevención de complicaciones de estrés térmico, pero este protocolo puede ser modificado y utilizado para otras vías de administración y para el análisis de diferentes compuestos.

Introducción

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses¹. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases^2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation^4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions⁶. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders^7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models^11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis¹³ and have beneficial effects on the host¹⁴. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro^15,16 and in clinical trials^17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Auburn, Auburn, Alabama.

1. Preparación de medios de cultivo, platos y Cultura bacteriana

1. Inocular 10 ml de caldo nutritivo en un matraz con una sola colonia de la cultura BSB3 Bacillus subtilis, que se cultiva durante la noche en una placa de agar nutriente.
2. Hacer 500 ml de medio de esporulación ¹⁹ (por litro: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (w / v) de KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) _MgSO4 x 7H ₂ O, 10 ml; agar, 15 g) y autoclave a 121 ^° C durante 20 min. Dejar enfriar a 50 ^° C y añadir las siguientes soluciones estériles: 1 M de Ca _{(NO3) 2,} 1 ml; 0,01 M MnCl _2, 1 ml; 1 mM de FeSO _4, 1 ml.
3. Medio preparado Enfriar a 40 ^° C durante 20 min a temperatura ambiente y verter 25 ml en cada una de 20 placas de Petri estériles en el gabinete estéril. Deje que el medio solidifique durante la noche.
4. Difundir 0,5 ml de cultivo de una noche de Bacillus subtilis BSB3 sobre la superficie del medio en las placas de Petri. Incubar cultivo a 37 ^° C durante 5 días hasta el 90% de esporulación. Revelar esporas de fase brillante de alta resolución de la microscopía.
5. bacterias de la cosecha mediante la adición de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a la placa y el raspado bacterias de una superficie usando un esparcidor de células estériles. Guarde la suspensión en el refrigerador hasta que sea necesario.
6. Confirmar viabilidad de las bacterias en placas 0,1 ml de la dilución apropiada (10 ^{-5-10 -6)} de una suspensión bacteriana en placas de medio de esporulación seguido de incubación durante 18-24 horas a 37 ^° C
7. Recuento de las colonias bacterianas de las placas usando un contador de colonias y calcular el título de las bacterias en la suspensión de la prueba. Preparar suspensión bacteriana con la concentración final 1 x 10 ⁸ UFC / ml en PBS.

2. Animales

1. Utilice 32 ratas Sprague-Dawley macho (250 - 300 g,). Mantener los animales en condiciones libres de patógenos específicos con acceso libre a pienso estándar de pellets y agua. Establecer una temperatura media (21 ± 1 ^° C), humedad (50 ± 5%) y un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas.

3. Diseño Experimental

1. Iniciar el tratamiento de los animales por sonda oral ^11, después de 2 días de aclimatación. Usar la jeringa con la aguja de gavage oral. El tratamiento de las ratas con 16 B. suspensión subtilis BSB3 (1 ml por rata) dos veces al día durante dos días (B. subtilis grupo). Tratar a 16 ratas con PBS (1 ml por rata) dos veces al día durante dos días (grupo PBS) (Figura 1).
2. Después del tratamiento, una subdivisión de cada grupo (8 ratas por grupo): Grupo 1- control (PBS / sin estrés), Grupo 2- B. subtilis (B. subtilis / sin estrés), Grupo 3- estrés (PBS / estrés por calor) y el Grupo B. 4- subtilis + estrés (B. subtilis estrés / calor).
3. Medir la temperatura rectal de cada rata usando un electronic termómetro digital. Mantener las ratas de los grupos 1 y 2 a temperatura ambiente durante 25 min. Coloque los animales de los grupos 3 y 4 en una cámara climática a 45 ^° C y una humedad relativa del 55% durante 25 min.
4. Después, medir la temperatura rectal de cada rata en todos los grupos utilizando un termómetro digital electrónico. Coloque todos los animales a temperatura ambiente durante 4 h.
5. Anestesiar las ratas con isoflurano (2-4%) en un frasco de anestesia sellable y observar hasta que las ratas se anestesiaron profundamente (ausencia de respuesta a pizca dedo del pie). La eutanasia a las ratas por decapitación rápida con una guillotina.
6. Recoger la sangre del tronco de cada rata ²⁰ (15 - 16 ml) con las pipetas apirógenas en tubos apirógenas para obtener suero e inmediatamente tomar muestras de sangre (7 l de cada rata) con una pipeta para el examen microscópico.
7. Poner los tubos con la sangre en un refrigerador durante al menos 30 minutos para permitir la coagulación. Tubos de centrifugación a 20 ^° C, 7.000 xg durante 10 minutos y rápidamenteeliminar el suero con una pipeta. Suero alícuota obtenida de cada rata en 50 volúmenes l y se almacena a -20 ^° C hasta el ensayo.

4. Procedimiento Quirúrgico

1. Cortar / recorte toda la piel del abdomen y el tórax de la parte inferior de la carcasa con unas tijeras eléctricas. Coloque la carcasa en un gabinete estéril y tratar la superficie afeitada de la carcasa con alcohol 70%.
2. Utilice un bisturí estéril para crear una incisión en la línea media del abdomen. Eliminar hígado, ganglios linfáticos mesentéricos, el bazo y el intestino delgado de cada rata utilizando pinzas estériles.

5. Análisis de la translocación bacteriana

1. Colocar cada muestra de hígado, ganglios linfáticos mesentéricos y el bazo en tubos estériles tarados y pesar. Calcular el peso de la muestra como una diferencia entre el peso de un tubo con una muestra y el peso de un tubo vacío.
2. Añadir PBS estéril al tubo para obtener una dilución 1:10 (w / v) de la muestra y homogeNiza cada muestra con un homogeneizador de tejidos de vidrio estéril para obtener una suspensión homogénea ^21.
3. Hacer diluciones seriadas (10 ^-1 a 10 ^-4) de cada muestra en PBS estéril. Plate 0,1 ml de todas las diluciones de cada tejido sobre la superficie de MacConkey y agar de sangre 5% y agar sangre Brucella con hemina (0,005 g / L) y vitamina K1 (0,01 g / L) placas.
4. Incubar MacConkey y de placas de agar sangre 5% aeróbicamente y placas de agar sangre Brucella en condiciones anaeróbicas a 37 ^° C ^22.
5. Recuento de las colonias de bacterias aerobias después de 24 hr, y las colonias de bacterias anaerobias después de 48 horas de incubación usando un contador de colonias. Expresar los resultados como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en un gramo de tejido.

6. Análisis histológico

1. Retire pequeñas muestras de intestino de cada rata por el procedimiento quirúrgico (pasos 4.1 a 4.2). Fijar las muestras en fijador de Bouin, incrustar en parafina,preparar 6 micras secciones y secciones de tinción con hematoxilina y eosina usando procedimientos estándar ^23.
2. Utilice un sistema de microscopio de alta resolución para medir la altura de las vellosidades intestinales y espesor total de la mucosa en cada muestra (aumento de 100X) ^24. Analizar 4 muestras de cada rata y hacer por lo menos veinte mediciones en cada muestra. Expresar los resultados en micrómetros.

7. Ensayo de citoquinas

1. Utilice kits comerciales de ELISA para rata IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ, y IL-10 para medir los niveles de citoquinas en el suero de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2. Generar curvas estándar para cada conjunto de muestras ensayadas usando estándares para el kit relevante. Definir el nivel de citocinas en cada muestra por comparación de los datos experimentales con la curva estándar apropiado.

8. Ensayo de lipopolisacárido

1. Analizar el nivel de LPS en el suero usando una rata kit de ELISA de acuerdo con LPSprotocolo del fabricante. Estimar la concentración de LPS en muestras por comparación de los valores obtenidos con los valores de la curva estándar.

9. Alta Resolución Microscopía de Sangre

1. Utilizar el sistema de microscopio descrito previamente ^25,26. Utilice una plataforma de aislamiento de vibración como una base para el sistema de microscopio y cámara de vídeo y el ordenador ²⁵ para grabar las imágenes en vivo. Calibrar las imágenes de prueba utilizando una diapositiva Richardson como se ha descrito previamente ^27.
2. Coloque 7 l de sangre recién extraída de cada rata en un portaobjetos de vidrio, cubreobjetos, fotografiar y grabar diez cuadros de imagen de 72 x 53,3 m ² en cada muestra (ampliación 1,700X).
3. Medir la concentración de vesículas utilizando software que proporciona una alta resolución de visión directa imágenes ópticas en tiempo real. Examinar un mínimo de 20 cuadros de imagen para cada condición experimental ^28.

10. Statistics

1. Expresar todos los valores como media y desviación estándar. Realizar el análisis estadístico y el trazado gráfico. Analizar los resultados con la prueba t de dos muestras, ajustar el nivel de significación de 0,05 para definir la significación estadística.

Resultados

La temperatura corporal media de los animales antes e inmediatamente después del estrés por calor fue de 36,7 ± 0,07 ^° C y 40,3 ± 0,17 ^° C, respectivamente (P <0,05). La exposición de ratas al calor (grupo 3) resultó en una inhibición significativa de la altura de las vellosidades y el grosor de la mucosa total de (Figuras 2, 3). La administración oral de la cepa BSB3 antes protegida estrés intestino de los efectos nocivos de calor.

Discusión

La exposición a altas temperaturas en condiciones graves de salud ^29. La prevención y la detección precoz de complicaciones relacionadas con el estrés por calor son de vital importancia ^30. El protocolo presentado se puede utilizar para evaluar la eficacia de los diversos enfoques para la prevención del estrés por calor efectos adversos.

Los pasos críticos dentro de este protocolo son: el procedimiento de tratamiento térmico (45 ^° ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
MacConkey agar plates	VWR	470180-742
5% blood agar plates	VWR	89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K	VWR	89405-032
Bouin’s Fixative	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Rat ELISA kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC4021
TNF-alpha Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Rat LPS ELISA Kit	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Environmental Chamber 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Centrifuge	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counter	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Freezer	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra microplate reader	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Classic C24
Rocking Shaker	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA	55
Petri dishes	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.	4001
Sony DXC-33 Video camera	Sony
Richardson test slide	Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA	80303
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, Dounce	VWR	71000-518