JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Аннотация

Данное исследование было разработано для оценки защитного эффекта штамма Bacillus Сенная против осложнений , связанных с тепловому стрессу. Тридцать два крыс Sprague-Dawley были использованы в этом исследовании. Животных перорально два раза в день в течение двух дней с Б. Сенная штамм BSB3 или PBS. На следующий день после последней обработки, каждая группа была разделена и две экспериментальные группы (один обрабатывали PBS и один обрабатывали B. Сенная) помещали при 45 ° С в течение 25 мин. Две контрольные группы остались в течение 25 мин при комнатной температуре. Все крысы были умерщвлены, и различные параметры были проанализированы во всех группах. Побочные эффекты теплового стресса регистрируются уменьшением ворсинок высоты и общей толщины слизистой оболочки в кишечном эпителии; транслокации бактерий из просвета; увеличилась везикул эритроцитов и возвышение липополисахаридов (ЛПС), уровень в крови. Защитная эффективность лечения оценивали путем предварительнойщению этих побочных эффектов. Протокол был создан для перорального лечения крыс с бактериями для предотвращения теплового стресса осложнений, но этот протокол может быть модифицирован и использован для других путей введения и для анализа различных соединений.

Введение

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses1. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions6. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis13 and have beneficial effects on the host14. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro15,16 and in clinical trials17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены IACUC из Auburn University, Auburn, Алабама.

1. Подготовка медиа-культуры, посуда и бактериальная культура

  1. Инокулируйте 10 мл питательного бульона в колбе с одной колонии Сенная палочка BSB3 культуры, выращенной в течение ночи на питательным агаром.
  2. Сделать 500 мл спорообразования среды 19 (на литр: Бакто питательном бульоне, 8 г; 10% (вес / объем) KCl, 10 мл; 1,2% (вес / объем) MgSO 4 х 7H 2 O, 10 мл, агар, 15 г) и автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин. Дать остыть до 50 ° С и добавить следующие стерильные растворы: 1 М Са (NO 3) 2, 1 мл; 0,01 М MnCl 2, 1 мл; 1 мМ FeSO 4, 1 мл.
  3. Холодный Готовую среду до 40 ° С в течение 20 мин при комнатной температуре и заливают 25 мл в каждую из 20 стерильные чашки Петри в стерильной камере. Пусть среда затвердеть в течение ночи.
  4. Распространение 0,5 мл ночной культуры Bacillus зиЫШз BSB3 на поверхности среды в чашках Петри. Инкубируйте культуру при 37 ° С в течение 5 дней , пока 90% спорообразования. Reveal поэтапному яркие споры высокой разрешающей микроскопии.
  5. Урожай бактерии путем добавления 1 мл стерильного физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) к пластине и соскоб бактерий с поверхности, используя стерильный клеточный распределителю. Храните подвеску в холодильнике, пока не понадобится.
  6. Confirm жизнеспособность бактерий при посеве 0,1 мл соответствующего разведения (10 -5 до 10 -6) бактериальной суспензии на спорообразования средних пластин с последующей инкубацией в течение 18 - 24 ч при 37 о С.
  7. Количество бактериальных колоний на пластинах с использованием счетчика колоний и расчета титра бактерий в исследуемом суспензию. Готовят бактериальную суспензию с конечной концентрацией 1 × 10 8 КОЕ / мл в PBS.

2. Животные

  1. Используйте 32 самцов крыс Sprague-Dawley (250 - 300 г). Поддерживать животных под конкретного патогена условиях со свободным доступом к стандартному окатышей корму и воде. Установить среднюю температуру (21 ± 1 ° С), влажность (50 ± 5%) и 12 ч свет-темнота циклом.

3. Экспериментальный дизайн

  1. Начать лечение животных перорально через зонд 11, после 2 дней акклиматизации. Используйте шприц с иглой через желудочный зонд. Относитесь 16 крыс с B. Сенная BSB3 суспензии (1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (B. Сенная группа). Относитесь 16 крыс с PBS (1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (группа PBS) (рисунок 1).
  2. После обработки подразделяют каждую группу (8 крыс в каждой группе): Группа 1 контроля (PBS / без стресса), Группа 2 B. Сенная (B. Сенная / без стресса), группа 3 - стресс (PBS / тепловой стресс) и Группа B. 4- Сенная + стресс (B. Сенная / тепловой стресс).
  3. Измерьте ректальную температуру каждой крысы с использованием ElecTronic цифровой термометр. Хранить крыс групп 1 и 2 при комнатной температуре в течение 25 мин. Место животных групп 3 и 4 в климатической камере при 45 ° С и относительной влажности 55% в течение 25 мин.
  4. Затем измеряют ректальную температуру каждой крысы во всех группах с использованием электронно-цифровой термометр. Поместите всех животных при комнатной температуре в течение 4 часов.
  5. Обезболить крыс с изофлуран (2 - 4%) в герметичную банку анестезии и наблюдать, пока крысы не глубоко анестезию (отсутствие ответа на носок щепотку). Эвтаназии крыс быстрым обезглавливание с гильотиной.
  6. Сбор туловища кровь от каждой крысы 20 (15 - 16 мл) с апирогенной пипеток Into апирогенной пробирки , чтобы получить сыворотку , и сразу же берут образцы крови (7 мкл от каждой крысы) с пипеткой для микроскопического исследования.
  7. Помещенный пробирки с кровью в холодильнике в течение не менее 30 мин, чтобы позволить свертывание. Центрифуга трубки при температуре 20 ° С, 7000 мкг в течение 10 мин и быстроудалить сыворотку с помощью пипетки. Алиготе сыворотки , полученной от каждой крысы в 50 мкл объемы и хранить при температуре -20 ° С до анализа.

4. Хирургические процедуры

  1. Вырезать / обрезать весь мех от брюшной полости и грудной клетки нижней стороны каркаса с электрическими ножницами. Поместите тушку в стерильной камере и лечить бритую поверхность тушки с 70% -ным спиртом.
  2. Используйте стерильный скальпель, чтобы создать срединный разрез брюшной полости. Удалить печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка и тонкой кишки у каждой крысы с использованием стерильного пинцета.

5. Анализ бактериальная транслокация

  1. Поместите каждую пробу печени, брыжеечных лимфатических узлов и селезенки, в предварительно взвешенную стерильные пробирки и взвешивают. Рассчитывают вес образца как разницу между весом трубки с пробой и весом пустой трубы.
  2. Добавить стерильной PBS к трубе, чтобы получить разведение 1:10 (вес / объем) образца и homogeределить каждого образца с помощью стерильной гомогенизатора стеклотканью для получения гомогенной суспензии 21.
  3. Сделать серийные разведения (10 -1 до 10 -4) каждого образца в стерильной PBS. Тарелка 0,1 мл всех разведений каждой ткани на поверхности МакКонки и в 5% кровяной агар и Brucella кровяной агар с гемина (0,005 г / л) и витамин К1 (0,01 г / л) пластин.
  4. Выдержите МакКонки и в 5% кровяном агаре аэробно и пластины бруцеллы чашках с кровяным агаром в анаэробных условиях при 37 ° С 22.
  5. Количество колоний аэробных бактерий после 24 часов, и колонии анаэробных бактерий после 48 ч инкубации с использованием счетчика колоний. Экспресс результаты в виде числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамм ткани.

6. Гистологический анализ

  1. Удалите небольшие образцы кишечника у каждой крысы с помощью хирургической процедуры (шаги 4.1 - 4.2). Фикс образцы в Fixative Буэна, встраивать в парафин,подготовить 6 мкм секции и секции окрашиваются гематоксилином и эозином с использованием стандартных процедур 23.
  2. Используйте систему микроскопа высокого разрешения для измерения высоты ворсинок кишечника и общей толщины слизистой оболочки в каждом образце (увеличение 100X) 24. Анализ 4 образцов от каждой крысы и сделать по крайней мере двадцать измерений в каждом образце. Экспресс результаты в микронах.

7. Анализ цитокина

  1. Использование коммерческих наборов крысы ELISA для IL-1; IL-6; TNF-α; INF-γ и IL-10 для измерения уровней цитокинов в сыворотке крови в соответствии с протоколом производителя.
  2. Генерировать стандартные кривые для каждого набора проб, проанализированных с использованием стандартов для соответствующего комплекта. Определить уровень цитокинов в каждом образце путем сравнения экспериментальных данных с соответствующей стандартной кривой.

8. Анализ липополисахарида

  1. Анализ уровня LPS в сыворотке с помощью крысы LPS ELISA набор поПротокол производителя. Расчетный концентрацию LPS в образцах путем сравнения полученных значений со значениями стандартной кривой.

9. Высокое разрешение световой микроскопии крови

  1. Используйте систему микроскопа , описанного ранее 25,26. Используйте платформу виброизоляции в качестве основы для системы микроскопа и видеокамеры и компьютера 25 для записи изображения в реальном времени . Калибровка тестовых изображений с помощью слайд Ричардсон , как описано выше 27.
  2. Поместите 7 мкл свеженарисованного крови из каждой крысы на предметное стекло, покровное, фотографии и записывать десять кадры изображений 72 × 53,3 мкм 2 в каждом образце (увеличение 1,700X).
  3. Измерение концентрации везикул с использованием программного обеспечения, которое обеспечивает с высокой разрешающей способностью прямого просмотра оптических изображений в реальном масштабе времени. Проверьте как минимум 20 кадров изображения для каждого условия эксперимента 28.

10. Statisтики

  1. Экспресс все значения как среднее и стандартное отклонение. Провести статистический анализ и график зависимости. Анализ результатов с Т-тест два образца, установите уровень значимости 0,05 для определения статистической значимости.

Результаты

Средняя температура тела животных до и сразу после теплового стресса был 36,7 ± 0,07 ° С и 40,3 ± 0,17 ° С, соответственно (р <0,05). Экспонирование крыс тепла (группа 3) привела к значительному ингибированию роста ворсинок и общей толщины слизистой оболочки (фиг.2,...

Обсуждение

Воздействие высоких температур приводит к серьезным состоянием здоровья 29. Профилактика и раннее выявление осложнений , связанных с тепловым стрессом имеют жизненно важное значение 30. Представленный протокол может быть использован для оценки эффективности раз?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

This work was supported by the Auburn University fund FOP 101002-139294-2050.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOP4417
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA 64-17-5
AgarVWR97064-334
MacConkey agar platesVWR470180-742
5% blood agar platesVWR89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin KVWR89405-032
Bouin’s FixativeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA15990
IL-10 Rat ELISA kitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0101
IL-1beta Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0011
IL-6 Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0061
INF-gamma Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC4021
TNF-alpha Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC3011
Rat LPS ELISA KitNeoBioLab, MA, USARL0275
Environmental Chamber 6020-1Caron, Marietta, OH, USA6020-1
Centrifuge Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USAOptima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical systemCitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counterFisher Scientific , Pittsburgh, PA, USARE-3325
FreezerHaier, Brooklyn, NY, USAHCMO50LA
Ultra microplate readerBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx 808
Auto Strip WasherBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx50
PipettesGilson, Pipetman, FranceP100, P200, P1000
C24 Incubator ShakerNew Brunswick Scientific, Enfield, CT, USAClassic C24
Rocking Shaker Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA55
Petri dishesFisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA875713100 mm x 15 mm
SterilGard III AdvanceThe Baker Company, Sanford, ME, USASG403
Culture Growing FlasksCorning Incorporated, Corning, NY, USA4995PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.4001
Sony DXC-33 Video cameraSony
Richardson test slideElectron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA80303
Millipore water purification systemMilliporeDirect-Q
Image-Pro Plus softwareMedia Cybernetics, MD, USA
Triple Beam BalanceOHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, DounceVWR71000-518

Ссылки

  1. Crandall, C. G., Gonzalez-Alonso, J. Cardiovascular function in the heat-stressed human. Acta Physiol. 199, 407-423 (2010).
  2. Lambert, G. P. Role of gastrointestinal permeability in exertional heatstroke. Exerc. Sport Sci. Rev. 32, 185-190 (2004).
  3. Yu, J., et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study. Comp. Biochem. Physiol. A-Mol. Integr. Physiol. 156, 119-128 (2010).
  4. Moseley, P. L., Gisolfi, C. V. New Frontiers in Thermoregulation and Exercise. Sports Med. 16, 163-167 (1993).
  5. Lambert, G. P. Stress-induced gastrointestinal barrier dysfunction and its inflammatory effects. J. Anim. Sci. 87, 101-108 (2009).
  6. Berg, A., Muller, H. M., Rathmann, S., Deibert, P. The gastrointestinal system - An essential target organ of the athlete's health and physical performance. Exerc. Immunol. Rev. 5, 78-95 (1999).
  7. Khan, M. W., et al. Microbes, intestinal inflammation and probiotics. Expert Rev Gastroent. 6, 81-94 (2012).
  8. Quigley, E. M. M. Prebiotics and Probiotics: Their Role in the Management of Gastrointestinal Disorders in Adults. Nutr Clin Pract. 27, 195-200 (2012).
  9. Gore, C., et al. Treatment and secondary prevention effects of the probiotics Lactobacillus paracasei or Bifidobacterium lactis on early infant eczema: randomized controlled trial with follow-up until age 3 years. Clin Exp Allergy. 42, 112-122 (2012).
  10. Gomes, A. C., Bueno, A. A., de Souza, R. G. M., Mota, J. F. Gut microbiota, probiotics and diabetes. Nutr. J. 13, (2014).
  11. Eutamene, H., et al. Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress-induced gut permeability and sensitivity increase in rats. J. Nutr. 137, 1901-1907 (2007).
  12. Ait-Belgnaoui, A., et al. Lactobacillus farciminis treatment attenuates stress-induced overexpression of Fos protein in spinal and supraspinal sites after colorectal distension in rats. Neurogastroenterol. Motil. 21, 585-593 (2009).
  13. Fujiya, M., et al. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal Homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter. Cell Host Microbe. 1, 299-308 (2007).
  14. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiol. 28, 214-220 (2011).
  15. Pinchuk, I. V., et al. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. Antimicrob Agents Ch. 45, 3156-3161 (2001).
  16. Sorokulova, I. B., Kirik, D. L., Pinchuk, I. V. Probiotics against Campylobacter pathogens. J. Travel Med. 4, 167-170 (1997).
  17. Gracheva, N. M., et al. The efficacy of the new bacterial preparation biosporin in treating acute intestinal infections. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. , 75-77 (1996).
  18. Horosheva, T. V., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic-associated diarrhoea: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. JMM Case Report. 1, (2014).
  19. Sorokulova, I. B., Krumnow, A. A., Pathirana, S., Mandell, A. J., Vodyanoy, V. Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores. Biotechnol. Prog. 24, 1147-1153 (2008).
  20. Vogel, H. G., Vogel, W. H., Vogel, H. G., Vogel, W. H. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. eds H.G. Vogel & W.H. Vogel. , 658-659 (1997).
  21. Bailey, M. T., Engler, H., Sheridan, J. F. Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice. J. Neuroimmunol. 171, 29-37 (2006).
  22. Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118, 229-241 (2004).
  23. Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. J. Appl. Physiol. 100, 1400-1409 (2006).
  24. Ribeiro, S. R., et al. Weight loss and morphometric study of intestinal mucosa in rats after massive intestinal resection. Influence of a glutamine-enriched diet. Rev. Hosp. Clìn. Fac. Med. S. Paulo. 59, 349-356 (2004).
  25. Vainrub, A., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Resolution of 90 nm (lambda/5) in an optical transmission microscope with an annular condenser. Opt Lett. 31, 2855-2857 (2006).
  26. Moore, T., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Oral administration of Bacillus subtilis strain BSB3 can prevent heat stress-related adverse effects in rats. J Appl Microbiol. 117, 1463-1471 (2014).
  27. Richardson, T. M. Test slides: Diatoms to divisions-What are you looking at. Proc Roy Microsc Soc. 22, 3-9 (1988).
  28. Moore, T., Sorokulova, I., Pustovyy, O., Globa, L., Vodyanoy, V. Microscopic evaluation of vesicles shed by rat erythrocytes at elevated temperatures. J Therm Biol. 38, 487-492 (2013).
  29. Leon, L. R., Helwig, B. G. Heat stroke: Role of the systemic inflammatory response. J. Appl. Physiol. 109, 1980-1988 (2010).
  30. Kumar, Y., Chawla, A., Tatu, U. Heat Shock Protein 70 as a Biomarker of Heat Stress in a Simulated Hot Cockpit. Aviat Space Env Med. 74 (7), 711-716 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Immunology113

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены