Prévention de stress thermique Effets indésirables chez les rats par<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

Résumé

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Résumé

Cette étude a été conçue pour évaluer l'effet protecteur de la souche de Bacillus subtilis contre les complications liées au stress thermique. Trente-deux rats Sprague-Dawley ont été utilisés dans cette étude. Les animaux ont été traités par voie orale deux fois par jour pendant deux jours avec B. subtilis souche BSB3 ou PBS. Le lendemain , après le dernier traitement, chaque groupe a été divisé et les deux groupes expérimentaux (une traités avec du PBS et traitées avec un B. subtilis) ont été placés à 45 ^° C pendant 25 min. Deux groupes témoins sont restés pendant 25 min à température ambiante. Tous les rats ont été euthanasiés et différents paramètres ont été analysés dans tous les groupes. Les effets néfastes du stress thermique sont enregistrées par la diminution de la hauteur des villosités et de l'épaisseur totale de la muqueuse dans l'épithélium intestinal; la translocation des bactéries à partir de la lumière; (LPS) niveau dans le sang augmenté vesiculation des érythrocytes et de l'élévation des lipopolysaccharides. L'efficacité protectrice du traitement est évaluée par un prévention de ces effets secondaires. Le protocole a été mis en place pour le traitement oral de rats avec des bactéries pour la prévention des complications de stress de chaleur, mais ce protocole peut être modifié et utilisé pour d'autres voies d'administration et pour l'analyse de différents composés.

Introduction

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses¹. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases^2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation^4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions⁶. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders^7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models^11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis¹³ and have beneficial effects on the host¹⁴. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro^15,16 and in clinical trials^17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par IACUC de l'Université d'Auburn, Auburn, Alabama.

1. Préparation de la Culture Media, Vaisselle et culture bactérienne

1. Inoculer 10 ml de bouillon nutritif dans un flacon avec une colonie unique de la culture BSB3 Bacillus subtilis cultivées pendant une nuit sur ​​une plaque de gélose nutritive.
2. Faire 500 ml de milieu de sporulation ¹⁹ (par litre: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (p / v) de KCl, 10 ml; 1,2% (p / v) de MgSO ₄ x 7H ₂ O, 10 ml; agar, 15 g) et de l' autoclave à 121 ^° C pendant 20 min. Laisser refroidir à 50 ^° C et d' ajouter les solutions stériles suivantes: 1 M de Ca (NO _{3) 2,} 1 ml; 0,01 M _MnCl2, 1 ml; 1 mM FeSO _4, 1 ml.
3. Laisser refroidir le milieu préparé à 40 ^° C pendant 20 min à température ambiante et verser dans 25 ml de chacune des 20 boîtes de Pétri stériles dans l'enceinte stérile. Que le milieu se solidifier pendant la nuit.
4. Étaler 0,5 ml de culture de nuit de Bacillus subtilis BSB3 sur la surface du milieu dans les boîtes de Petri. Incuber la culture à 37 ^° C pendant 5 jours jusqu'à 90% sporulation. Révéler phase lumineuse spores par microscopie à haute résolution.
5. Récolte des bactéries par addition de 1 ml de phosphate de solution saline stérile tamponnée (PBS) à la plaque de raclage et les bactéries à partir d'une surface à l'aide d'un épandeur cellulaire stérile. Conserver la suspension dans le réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire.
6. Confirmer la viabilité des bactéries par placage de 0,1 ml de la dilution appropriée (10 ^-5 à 10 ^-6) d'une suspension bactérienne sur des plaques de milieu de sporulation , suivie d' une incubation pendant 18-24 heures à 37 ^° C.
7. Compter les colonies bactériennes sur des plaques en utilisant un compteur de colonies et calculer le titre de bactéries dans la suspension de test. Préparer une suspension bactérienne à la concentration finale de 1 x 10 ⁸ UFC / ml dans du PBS.

2. Animaux

1. Utiliser 32 des rats mâles Sprague-Dawley (250-300 g). Maintenir les animaux dans des conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques avec un accès gratuit à chow à granulés standard et l'eau. Établir une température moyenne (21 ± 1 ^° C), l' humidité (50 ± 5%) et un cycle de lumière-obscurité de 12 h.

3. Conception expérimentale

1. Démarrer le traitement des animaux par gavage oral ^11, après 2 jours d'acclimatation. Utiliser la seringue avec l'aiguille de gavage oral. Traiter 16 rats avec B. subtilis BSB3 suspension (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe B. subtilis). Traiter les 16 rats avec du PBS (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe PBS) (figure 1).
2. Après le traitement, subdiviser chaque groupe (8 rats par groupe): Groupe 1- contrôle (PBS / pas de stress), Groupe 2- B. subtilis (B. subtilis / pas de stress), Groupe 3- contrainte (PBS / stress thermique) et le groupe 4- B. subtilis + le stress (B. subtilis stress / chaleur).
3. Mesurer la température rectale de chaque rat en utilisant un electronic thermomètre numérique. Gardez les rats des groupes 1 et 2 à la température ambiante pendant 25 min. Placer les animaux des groupes 3 et 4 dans une chambre climatique à 45 ^° C et une humidité relative de 55% pendant 25 min.
4. Ensuite, mesurer la température rectale de chaque rat dans tous les groupes à l'aide d'un thermomètre numérique électronique. Placez tous les animaux à la température ambiante pendant 4 heures.
5. Anesthetize rats avec isoflurane (2-4%) dans un bocal d'anesthésie refermable et observer jusqu'à ce que les rats sont profondément anesthésiés (absence de réponse à pincement de l'orteil). Euthanasier rats par décapitation rapide avec une guillotine.
6. Recueillir le sang du tronc de chaque rat ²⁰ (15 - 16 ml) avec les pipettes apyrogènes dans des tubes apyrogènes pour obtenir le sérum et immédiatement prélever des échantillons de sang (7 pi de chaque rat) avec une pipette pour l' examen microscopique.
7. Placer les tubes avec le sang dans un réfrigérateur pendant au moins 30 minutes pour permettre la coagulation. Tubes à centrifuger à 20 ^o C, 7000 xg pendant 10 min et rapidementretirer le sérum avec une pipette. Sérum aliquote obtenu à partir de chaque rat dans des volumes de 50 et conserver à -20 ^° C jusqu'au dosage.

4. Procédure chirurgicale

1. Couper / garniture tout fourrure de l'abdomen et du thorax de la face inférieure de la carcasse avec des cisailles électriques. Placer la carcasse dans une enceinte stérile et de traiter la surface rasée de la carcasse avec 70% d'alcool.
2. Utilisation d'un scalpel stérile pour créer une incision médiane de l'abdomen. Enlever le foie, les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate et l'intestin grêle de chaque rat en utilisant des pinces stériles.

5. Analyse de la translocation bactérienne

1. Placer chaque échantillon de foie, des ganglions lymphatiques mésentériques et la rate dans des tubes stériles pré-pesées et peser. Calculer le poids de l'échantillon en tant que différence entre le poids d'un tube à échantillon et le poids d'un tube vide.
2. Ajouter du PBS stérile dans le tube pour obtenir une dilution de 1:10 (p / v) de l'échantillon et homonize chaque échantillon avec un homogénéiseur de tissu de verre stérile pour obtenir une suspension ²¹ homogène.
3. Faire des dilutions en série (10 ^-1 à 10 ^-4) de chaque échantillon dans du PBS stérile. Plaque 0,1 ml de toutes les dilutions de chaque soie sur la surface de MacConkey et de la gélose au sang à 5% et la gélose au sang avec Brucella hémine (0,005 g / L) et de la vitamine K1 (0,01 g / L) des plaques.
4. Incuber MacConkey et de 5% des plaques de gélose au sang en milieu aérobie et Brucella plaques de gélose au sang en anaérobiose à 37 ^° C ^22.
5. Nombre de colonies de bactéries aérobies après 24 h, et les colonies de bactéries anaérobies, après 48 heures d'incubation en utilisant un compteur de colonies. Exprimer les résultats, le nombre d'unités formant des colonies (UFC) dans un gramme de tissu.

6. Analyse histologique

1. Retirer de petits échantillons d'intestin de chaque rat par l'intervention chirurgicale (étapes 4/1 à 4/2). Fixer des échantillons dans le fixateur de Bouin, incorporer dans de la paraffine,préparer 6 um sections et des sections de tache avec de l' hématoxyline et de l' éosine en utilisant des procédures standard ^23.
2. Utiliser un système de microscope à haute résolution pour mesurer la hauteur des villosités intestinales et de l' épaisseur totale de la muqueuse dans chaque échantillon (grossissement 100X) ^24. Analyser 4 échantillons de chaque rat et de faire au moins vingt mesures dans chaque échantillon. Exprimez les résultats en micromètres.

7. Cytokine Assay

1. Utilisez des kits commerciaux rat ELISA pour IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ et l'IL-10 pour mesurer les niveaux de cytokines dans le sérum selon le protocole du fabricant.
2. Générer des courbes standard pour chaque ensemble d'échantillons analysés en utilisant des normes pour le kit pertinent. Définir le niveau de cytokines dans chaque échantillon par comparaison des données expérimentales avec la courbe standard appropriée.

8. lipopolysaccharide Assay

1. Analyser le niveau de LPS dans le sérum en utilisant un kit de LPS chez le rat selon la méthode ELISAle protocole du fabricant. Estimer la concentration de LPS dans des échantillons par comparaison des valeurs obtenues avec les valeurs de la courbe standard.

9. Haute Résolution Lumière Microscopie du sang

1. Utilisez le système de microscope décrit précédemment ^25,26. Utiliser une plate - forme d'isolation de vibration en tant que base pour le système de microscope et une caméra vidéo et un ordinateur ²⁵ pour enregistrer les images en temps réel. Calibrer images de test en utilisant une diapositive Richardson comme décrit précédemment ^27.
2. Placez 7 pi de sang fraîchement prélevé sur chaque rat sur ​​une lame de verre, lamelle, photographier et enregistrer dix trames d' image de 72 × 53,3 um ² dans chaque échantillon (grossissement 1,700X).
3. Mesurer la concentration de vésicules en utilisant un logiciel qui fournit à haute résolution à vision directe des images optiques en temps réel. Examiner un minimum de 20 trames d' image pour chaque condition expérimentale ^28.

10. Statistics

1. Exprimez toutes les valeurs que la moyenne et l'écart type. Effectuer une analyse statistique et graphique tracé. Analyser les résultats obtenus avec le test t de deux échantillons, réglez le niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique.

Résultats

La température corporelle moyenne des animaux avant et immédiatement après le stress thermique était de 36,7 ± 0,07 ^o C et 40,3 ± 0,17 ^° C, respectivement (P <0,05). L' exposition des rats à la chaleur (groupe 3) a entraîné une inhibition significative de la hauteur de villosités et de l' épaisseur totale de la muqueuse (figures 2, 3). L'administration orale de la souche BSB3 avant le stress protégé intestin de l'eff...

Discussion

L' exposition à haute température dans des conditions de santé graves ^29. Prévention et détection précoce des complications liées au stress thermique sont d' une importance vitale ^30. Le protocole présenté peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de diverses approches pour la prévention des effets nocifs de stress thermique.

Les étapes critiques au sein de ce protocole comprennent: la procédure de traitement thermique (4...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
MacConkey agar plates	VWR	470180-742
5% blood agar plates	VWR	89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K	VWR	89405-032
Bouin’s Fixative	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Rat ELISA kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC4021
TNF-alpha Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Rat LPS ELISA Kit	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Environmental Chamber 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Centrifuge	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counter	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Freezer	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra microplate reader	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Classic C24
Rocking Shaker	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA	55
Petri dishes	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.	4001
Sony DXC-33 Video camera	Sony
Richardson test slide	Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA	80303
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, Dounce	VWR	71000-518