Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

Resumo

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Resumo

Este estudo foi desenhado para avaliar o efeito protetor da estirpe Bacillus subtilis contra as complicações relacionadas ao estresse térmico. Trinta e dois ratos Sprague-Dawley foram usadas neste estudo. Os animais foram tratados por via oral duas vezes por dia durante dois dias com B. subtilis estirpe BSB3 ou PBS. No dia seguinte, após o último tratamento, cada grupo foi dividido e dois grupos experimentais (tratados com um PBS e tratadas com um B. subtilis) foram colocados a 45 ^° C durante 25 min. Dois grupos de controlo permaneceu por 25 min à temperatura ambiente. Todos os ratos foram sacrificados e diferentes parâmetros foram analisados ​​em todos os grupos. Os efeitos adversos do estresse por calor são registrados pela diminuição da altura das vilosidades e espessura total da mucosa do epitélio intestinal; translocação de bactérias a partir do lúmen; vesiculação aumento de eritrócitos e elevação dos lipopolissacáridos (LPS) de nível no sangue. A eficácia protectora do tratamento é avaliada por prévenção destes efeitos secundários. O protocolo foi definido acima para o tratamento oral de ratos com bactérias para a prevenção de complicações de stress de calor, mas este protocolo pode ser modificado e utilizado para outras vias de administração e para a análise de compostos diferentes.

Introdução

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses¹. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases^2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation^4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions⁶. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders^7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models^11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis¹³ and have beneficial effects on the host¹⁴. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro^15,16 and in clinical trials^17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Auburn, Auburn, Alabama.

1. Preparação de Meios de Cultura, pratos e Cultura bacteriana

1. Inocular 10 ml de caldo nutriente num frasco com uma única colónia de cultura BSB3 Bacillus subtilis, cultivadas durante a noite numa placa de agar nutriente.
2. Adicione 500 ml de meio de esporulação ¹⁹ (por litro: Bacto Caldo Nutriente, 8 g; 10% (w / v) de KCl, 10 mL; 1,2% (w / v), MgSO ₄ x 7H ₂ O, 10 mL; agar, 15 g) e autoclave a 121 ^° C durante 20 min. Deixar arrefecer até 50 ^° C e adicione as seguintes soluções estéreis: 1 M Ca _{(NO3) 2,} 1 ml; 0,01 M _{de MnCl2,} 1 ml; 1 mM de _FeSO4, 1 ml.
3. Arrefecer meio preparado a 40 ^° C durante 20 min à temperatura ambiente e verter em 25 ml de cada uma das 20 placas de Petri estéreis no gabinete estéril. Deixe o meio solidificar durante a noite.
4. Espalhe 0,5 ml da cultura durante a noite de Bacillus subtilis BSB3 sobre a superfície do meio em placas de Petri. Incubar a cultura a 37 ^° C durante 5 dias até 90% a esporulação. Revelar esporos fase brilhante por microscopia de alta resolução.
5. bactérias colheita por adição de 1 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) para a placa de raspagem e bactérias a partir de uma superfície usando um espalhador de células estéril. Conserve a suspensão na geladeira até ser necessário.
6. Confirmar viabilidade das bactérias por plaqueamento de 0,1 ml de uma diluição adequada (10 ^-5 a 10 ^-6) de uma suspensão de bactérias em placas de meio de esporulação seguido de incubação durante 18 - 24 h a 37 ^o C.
7. Contagem das colónias bacterianas das placas utilizando um contador de colónias e calcular a título de bactérias na suspensão testado. Prepare suspensão bacteriana com a concentração final de 1 x 10 ⁸ UFC / ml em PBS.

2. Os animais

1. Usar 32 ratazanas macho Sprague-Dawley (250-300 g). Manter animais sob condições específicas isentos de agentes patogénicos com livre acesso a comida pellet padrão e água. Estabelecer uma temperatura média (21 ± 1 ^° C), humidade (50 ± 5%) e um ciclo de luz-escuro de 12 h.

3. Design Experimental

1. Iniciar o tratamento dos animais por sondagem oral ^{de 11,} após 2 dias de aclimatização. Use seringa com a agulha de gavagem oral. Trate 16 ratos com B. suspensão subtilis BSB3 (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo de B. subtilis). Tratar 16 ratos com PBS (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo PBS) (Figura 1).
2. Após o tratamento, subdivisão de cada grupo (8 ratos por grupo): Grupo 1- controle (PBS / sem estresse), Grupo 2- B. subtilis (B. subtilis / sem estresse), Grupo 3 tensão (PBS / estresse por calor) e Grupo B. 4- subtilis + estresse (B. subtilis estresse / calor).
3. Medir a temperatura rectal de cada rato usando um electronic termômetro digital. Manter os ratos dos grupos 1 e 2 à temperatura ambiente durante 25 min. Animais Local de grupos 3 e 4 em uma câmara climática a 45 ^o C e umidade relativa de 55% durante 25 min.
4. Em seguida, medir a temperatura rectal de cada rato em todos os grupos usando um termômetro digital eletrônico. Coloque todos os animais à temperatura ambiente durante 4 h.
5. Anestesiar ratos com isoflurano (2-4%) em um frasco selável anestesia e observar até os ratos são anestesiados profundamente (ausência de resposta ao aperto do dedo do pé). Euthanize ratos por decapitação rápida com uma guilhotina.
6. Recolha de sangue do tronco de cada rato ²⁰ (15 - 16 ml) com as pipetas apirogénica apirogénica em tubos para se obter soro imediatamente e recolher amostras de sangue (7 ul) de cada rato com uma pipeta para exame microscópico.
7. Colocar os tubos com o sangue no frigorífico durante pelo menos 30 min para permitir a coagulação. Tubos de centrifugação a 20 ^° C, 7,000 xg durante 10 min e rapidamenteremover o soro com uma pipeta. Soro alíquota obtidos a partir de cada rato em 50 volumes ul e armazenar a -20 ^° C até ao ensaio.

4. Procedimento Cirúrgico

1. Cut / aparar todas as peles do abdômen e tórax do lado de baixo da carcaça com tesouras elétricas. Coloque a carcaça em um armário estéril e tratar a superfície raspada da carcaça com álcool a 70%.
2. Use um bisturi estéril para criar uma incisão na linha média do abdome. Remover fígado, nódulos linfáticos mesentéricos, baço e intestino delgado de cada rato usando uma pinça estéreis.

5. Análise de translocação bacteriana

1. Coloque cada amostra de fígado, linfonodos mesentéricos e baço em tubos estéreis pré-pesado e pesar. Calcule o peso da amostra, tal como uma diferença entre o peso de um tubo com uma amostra e o peso de um tubo vazio.
2. Adicionar PBS estéril ao tubo para se obter uma diluição de 1:10 (w / v) da amostra e homogenhecer cada amostra com um homogeneizador de tecidos de vidro estéril para se obter uma suspensão homogénea ^{de 21.}
3. Fazer diluições em série (10 ^-1 a 10 ^-4) de cada amostra em PBS estéril. Placa de 0,1 ml de todas as diluições de todos os tecidos sobre a superfície de MacConkey e de 5% de agar de sangue e de agar de sangue de Brucella com hemina (0,005 g / L) e vitamina K1 (0,01 g / L) placas.
4. Incubar MacConkey de e 5% ágar sangue aerobicamente e Brucella placas de agar de sangue em condições anaeróbias a 37 ^o C ^22.
5. Contagem das colónias de bactérias aeróbias, após 24 horas, e as colónias de bactérias anaeróbicas após 48 horas de incubação utilizando um contador de colónias. Expressar os resultados como o número de unidades formadoras de colónias (CFU) em um grama de tecido.

6. Análise histológica

1. Retirar amostras do intestino delgado de cada rato pelo procedimento cirúrgico (passos 4,1-4,2). Fix amostras em fixador de Bouin, incorporar em parafina,preparar 6 mm seções e seções mancha com hematoxilina e eosina utilizando procedimentos padrão ^23.
2. Use um sistema de microscópio de alta resolução para medição da altura das vilosidades intestinais e espessura total da mucosa em cada amostra (ampliação 100X) ^24. Analise 4 amostras de cada rato e fazer pelo menos vinte medições em cada amostra. Expressar os resultados em micrômetros.

7. citocinas Assay

1. Use kits de rato comerciais ELISA para IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ, e IL-10 para medir os níveis de citocinas no soro de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Gerar curvas padrão para cada conjunto de amostras testadas usando padrões para o kit relevante. Definir o nível de citocinas em cada amostra por comparação dos dados experimentais com a curva padrão apropriada.

8. Lipopolissacarídeo Assay

1. Analisar nível de LPS no soro utilizando um kit de rato de LPS de acordo com ELISAo protocolo do fabricante. Estimar a concentração de LPS em amostras por comparação dos valores obtidos com os valores da curva padrão.

9. alta resolução Microscopia de Luz de Sangue

1. Usar o sistema de microscópio descrito anteriormente ^25,26. Use uma plataforma de isolamento de vibração como uma base para o sistema de microscópio e câmera de vídeo e de computador ²⁵ para gravar as imagens ao vivo. Calibrar imagens de teste usando uma lâmina de Richardson como descrito anteriormente ^27.
2. Coloque 7 l de sangue recentemente retirada de cada rato em uma lâmina de vidro, lamela, fotografar e gravar dez quadros de imagem de 72 × 53,3 mm ² em cada amostra (ampliação 1,700X).
3. Medir a concentração de vesículas usando software que fornece imagens ópticas com vista directa de alta resolução em tempo real. Examine um mínimo de 20 quadros de imagem para cada condição experimental ^28.

10. Statistiques

1. Expresso de todos os valores como média e desvio padrão. Realizar a análise estatística e plotagem gráfico. Analisar os resultados obtidos com o teste t de duas amostras, definir o nível de significância de 0,05 para definir significância estatística.

Resultados

A temperatura corporal médio dos animais antes e imediatamente após o estresse térmico foi de 36,7 ± 0,07 ^o C e 40,3 ± 0,17 ^o C, respectivamente (P <0,05). A exposição de ratos a calor (grupo 3), resultou na inibição significativa da altura das vilosidades da mucosa e espessura total (Figuras 2, 3). A administração oral de tensão BSB3 antes protegidos estresse intestino do efeito nocivo do calor.

Discussão

A exposição a resultados de alta temperatura em condições graves de saúde ^29. Prevenção e detecção precoce de complicações relacionadas ao estresse por calor são de importância vital ^30. O protocolo apresentado pode ser usado para avaliar a eficácia de várias abordagens para a prevenção do stress térmico efeitos adversos.

Passos críticos dentro deste protocolo incluem: o processo de tratamento de calor (45 ^° C, 25 min); ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
MacConkey agar plates	VWR	470180-742
5% blood agar plates	VWR	89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K	VWR	89405-032
Bouin’s Fixative	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Rat ELISA kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC4021
TNF-alpha Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Rat LPS ELISA Kit	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Environmental Chamber 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Centrifuge	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counter	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Freezer	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra microplate reader	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Classic C24
Rocking Shaker	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA	55
Petri dishes	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.	4001
Sony DXC-33 Video camera	Sony
Richardson test slide	Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA	80303
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, Dounce	VWR	71000-518