Isı Önlenmesi ile Sıçanlarda Olumsuz Etkileri Stres<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Gerilme

Özet

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Özet

Bu çalışma, sıcak stresine bağlı komplikasyonlar karşı Bacillus subtilis suşu koruyucu etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Otuz iki Sprague-Dawley fareleri, bu çalışmada kullanılmıştır. Hayvanlar oral B ile iki gün süreyle günde iki kez uygulandı subtilis BSB3 zorlanma veya PBS. Ertesi gün, son tedaviden sonra, her bir grup bölündü ve iki deney grubu (bir PBS ile muamele edilmiş ve bir B. subtilis ile muamele) 25 dakika süreyle 45 ^° C de yerleştirildi. İki kontrol grubu, oda sıcaklığında 25 dakika süreyle kaldı. Tüm sıçanlara ötenazi yapıldı ve farklı parametrelerin tüm gruplarda analiz edildi. Isı stresinin olumsuz etkileri villus yüksekliği ve bağırsak epiteli toplam mukozal kalınlığının azalması ile kayıtlı; lümenden bakteri translokasyonu; Kandaki (LPS) seviyesi lipopolisakkaridinin ait eritrositlerin vezikülasyon ve yükseklik arttı. tedavinin koruyucu etkinliği ön tarafından değerlendirilirBu yan etkilerin giriflim. Protokol ısı stresi komplikasyonların önlenmesi için bakterilerle sıçanların oral tedavi için ayarlanmış, ancak bu protokol değiştirilebilir ve diğer uygulama yolları için ve farklı bileşiklerin analizi için kullanılabilir.

Giriş

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses¹. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases^2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation^4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions⁶. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders^7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models^11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis¹³ and have beneficial effects on the host¹⁴. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro^15,16 and in clinical trials^17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

Protokol

Tüm deney prosedürleri Auburn Üniversitesi IACUC, Auburn, Alabama tarafından kabul edildi.

Kültür Medya, Yemekleri ve Bakteriyel Kültür 1. Hazırlık

1. Bir besleyici agar plakası üzerinde bir gece büyütüldü Bacillus subtilis BSB3 kültürünün tek bir koloni ile bir şişe içinde besleyici sıvı 10 ml inoküle.
2. Litre başına sporlaşma ortamının ¹⁹ (500 ml yapmak: Bacto besleyici Broth, 8 g,% 10 (ağ / hac) KCI, 10 mi,% 1.2 (h) ₄ x 7H _2, O, 10 mi MgSO / a; ağar, 15 g) ve 20 dakika boyunca 121 ^o C'de otoklav. Aşağıdaki steril çözümleri 50 ^o C soğumasına ve eklemek için izin: 1 M Ca (NO _{3) 2,} 1 ml; 0.01 M _MnCl2, 1 mi; 1 ila _{4 mm,} 1 ml FeSO.
3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 40 ^° C'nin soğutun hazırlanan orta ve steril bir kabine 20 steril Petri kapları her birine 25 ml dökün. orta gecede katılaşmaya edelim.
4. B gecelik kültürün 0.5 ml yayıldıacillus subtilis BSB3 Petri kutularına ortamın yüzeyi üzerine. % 90 Sporulationun kadar 5 gün boyunca 37 ^o C'de kültür inkübe. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile faz-parlak sporlar ortaya koymaktadır.
5. levhaya steril fosfat tamponlu salin (PBS) 1 ml ekleme ve steril bir hücre dağıtıcı ile bir yüzeyden bakteriler, kazınarak Hasat bakteri. ihtiyaç kadar buzdolabında süspansiyon saklayın.
6. 37 ^o C'de 24 saat - 18 kuluçkalandı sporlaşma ortamının plakaları üzerinde bakteri süspansiyonu uygun seyreltme (10 ^{-5 -6} ila 10), 0.1 ml kaplama bakterilerin canlılığı teyit
7. Bir koloni sayacı kullanılarak plakalar üzerinde bakteri kolonileri sayın ve test süspansiyon bakteri titresi hesaplamak. Nihai konsantrasyon 1 x 10 ⁸ CFU / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi bakteriyel süspansiyon hazırlayın.

2. Hayvanlar

1. 300 gr - 32 erkek Sprague-Dawley sıçanları (250 kullanın). standart pelet yemi ve su ücretsiz erişim ile spesifik patojen free şartlarda hayvanları korumak. Ortalama sıcaklığı (21 ± 1 ^° C), nem (% 50 ± 5) ve 12 saat ışık-karanlık döngüsü kurmak.

3. Deney Tasarımı

1. Iklimlendirme 2 gün sonra, oral gavaj ¹¹ hayvanların tedavisini başlatın. ağızdan sonda iğne ile şırınga kullanın. B. ile 16 sıçan tedavi subtilis BSB3 süspansiyonu (sıçan başına 1 mi), iki gün boyunca günde iki kez (B. subtilis grubu). PBS ile 16 sıçan (sıçan başına 1 mi), iki gün (PBS grubu) (Şekil 1) için günde iki kez tedavi edin.
2. Grup 1- kontrolü (PBS / hiçbir stres), Grup 2- B: Tedaviden sonra, her gruba (grup başına 8 sıçan) subdivide subtilis (B. subtilis / hiçbir stres), Grup 3- stres (PBS / ısı stresi) ve Grup 4- B. subtilis + stres (B. subtilis / ısı stresi).
3. Bir elec kullanarak her sıçanın rektal sıcaklığını ölçmekdijital termometre tronic. 25 dakika için oda sıcaklığında Grup 1 ve 2'nin sıçanları tutun. 45 ^o C'de iklim odasına gruplar 3 ve 4 ve bağıl nem 25 dakika boyunca% 55 yer hayvanları.
4. Daha sonra, bir elektronik dijital bir termometre kullanılarak tüm gruplarda, her sıçanın rektum sıcaklığının ölçülmesi. 4 saat oda sıcaklığında tüm hayvanlar koyun.
5. Bir yapışmalı anestezi kavanoza - (% 4 2) ve sıçanlar derinden (ayak tutam yanıt yokluğu) anestezi kadar dikkat izofluran ile sıçan anestezisi. Bir Giyotin ile hızlı dekapitasyon sıçan Euthanize.
6. Serum elde ve hemen mikroskobik inceleme için bir pipet ile kan örnekleri (her sıçan 7 ul) almak için apirojen tüpler içine apirojen pipetler ile - (16 ml 15) her sıçan ²⁰ gövde kan toplayın.
7. pıhtılaşmayı izin vermek için en az 30 dakika boyunca bir soğutucuda kan Tüpleri koyun. 20 ^o C santrifüj tüpleri, 7000 xg 10 dakika ve hızlı bir şekildeBir pipet ile serum kaldırın. Tahlil kadar -20 ^o C'de her 50 ul birimlere sıçan ve mağazadan alınan Kısım serumu.

4. Cerrahi Prosedür

1. Kes / elektrikli makas ile karkasın alt karın ve göğüs tüm kürk Döşeme. steril bir kabine karkas yerleştirin ve% 70 alkol ile karkas traş yüzeyi davranın.
2. karın ortasındaki bir yarık oluşturmak için Steril bir bisturi bıçağını kullanarak. Steril cımbız kullanarak her sıçandan karaciğer, mezenterik lenf düğümleri, dalak ve ince bağırsak çıkarın.

Bakteriyel Translokasyon 5. Analiz

1. önceden tartılmış steril tüplere karaciğer, mezenterik lenf düğümleri ve dalak her bir örnek yerleştirilir ve tartılır. Bir numune ile bir boru ve ağırlıkça boş borunun ağırlığı arasındaki fark olarak numunenin ağırlığı hesaplanır.
2. 1:10 seyreltme elde etmek üzere tüpe steril PBS ekleyin (ağırlık / hacim) numune ve homojen birHomojen bir süspansiyon elde etmek için ²¹ steril bir cam doku homojenleştirici ile her bir örnek çer-.
3. Steril PBS Her numunenin seri dilüsyonları (10 ^{-1 -4} 10) konur. Plaka hemin (0.005 g / L) ve Vitamin K1 (0.01 gr / lt) plakalı MacConkey en yüzeyi ve% 5, kan agar ve Brucella, kan agar üzerine her bir doku tüm seyreltileri, 0.1 mi.
4. 37 ^o C ^22, MacConkey en ve% 5 kanlı agar plakaları aerobik ve Brucella kan agar plakaları anaerobik koşullarda inkübe edin.
5. 24 saat sonra aerobik bakteri kolonileri sayın ve inkübasyon 48 saat, bir koloni sayacı kullandıktan sonra anaerobik bakteri kolonileri. bir doku gramı koloni oluşturan birim (CFU) sayısı sonuçlarını ifade eder.

6. Histolojik analiz

1. Cerrahi işlem her sıçan ince bağırsak örnekleri çıkarın (- 4.2 4.1 adımlar). , Parafin gömmek Bouin Sabitleme örnekleri, Fixhematoksilen ve eozin standart prosedürler ²³ kullanılarak 6 mikron bölümleri ve leke kesitler hazırlamak.
2. Her bir örnek (büyütme 100X) ²⁴ intestinal villus ve toplam mukozal kalınlığı yüksekliğini ölçmek için yüksek çözünürlüklü mikroskop sistemi kullanın. Her bir sıçandan 4 örnekleri analiz eder ve her bir örnek, en az yirmi ölçümler yapmak. mikrometre sonuçları ifade edin.

7. Sitokin Deneyi

1. IL-1 p ticari sıçan ELISA kitleri kullanın; IL-6; TNF-α, γ INF-, ve IL-10, üreticinin protokolüne uygun olarak, serum sitokin düzeylerinin ölçülmesi için.
2. İlgili kiti için standartlar kullanılarak test numunelerin her set için standart eğrileri oluşturmak. uygun standart eğri ile deneysel verilerle karşılaştırılması ile her numunedeki sitokinlerin düzeyini tanımlayın.

8. Lipopolisakkarit Deneyi

1. uygun bir sıçan LPS ELISA kiti kullanılarak serumda LPS seviyesini analizÜreticinin protokolü. Standart eğri değerleri ile elde edilen değerlerin karşılaştırılması ile örnekleri LPS konsantrasyonunun tahmin edilmesi.

Kan 9. Yüksek Çözünürlüklü Işık Mikroskopi

1. Daha önce ^25,26 açıklanan mikroskop sistemi kullanın. Canlı görüntüleri kaydetmek için bir mikroskop sistemi için taban ve video kamera ve bilgisayar ²⁵ gibi titreşim izolasyonu platformu kullanın. Daha önce ²⁷ açıklandığı gibi bir Richardson slayt kullanarak test görüntüleri kalibre edin.
2. Bir cam slayt, lamel, fotoğrafta Her bir sıçanın taze çekilmiş kan 7 ul yerleştirin ve her bir örnek (büyütme 1,700X) 72 × 53,3 mm ² on resim çerçeveleri kaydedin.
3. gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü direkt görüş optik görüntü sağlar yazılımı kullanarak veziküllerin konsantrasyonunu ölçün. Her deneysel koşul ²⁸ 20 görüntü kareleri minimum inceleyin.

10. İstatistikitikler

1. ortalama ve standart sapma gibi tüm değerleri ifade eder. istatistiksel analiz ve grafik komplo gerçekleştirin. , Iki örnek t-testi ile analiz sonuçları istatistiksel anlamlılık tanımlamak için 0.05 anlamlılık düzeyini ayarlamak.

Sonuçlar

Isı stresi önce ve hemen sonrasında hayvanların ortalama vücut ısısı sırasıyla 36.7 ± 0.07 ^o C ve 40.3 ± 0.17 ^o C, (p <0.05). Isı (Grup 3), maruziyeti villi yüksekliği önemli ölçüde inhibe toplam mukozal kalınlığı ile sonuçlanmıştır (Şekil 2, 3). ısı zararlı etkisinden stres korumalı bağırsak önce BSB3 suşu Oral uygulama.

bağırsaktan bakteri transl...

Tartışmalar

Ciddi sağlık koşullarında ²⁹ yüksek sıcaklık sonuçlarına maruz kalmak. Önleme ve ısı stresi ile ilgili komplikasyonların erken teşhis hayati önem ³⁰ taşımaktadır. sunulan protokol ısı stresi olumsuz etkilerin önlenmesi için çeşitli yaklaşımların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu protokol kapsamında kritik adımlar şunlardır: ısıl işlem prosedürü (45 ^o C, 25 dakika); toplama ve enteroto...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
MacConkey agar plates	VWR	470180-742
5% blood agar plates	VWR	89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K	VWR	89405-032
Bouin’s Fixative	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Rat ELISA kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC4021
TNF-alpha Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Rat LPS ELISA Kit	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Environmental Chamber 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Centrifuge	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counter	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Freezer	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra microplate reader	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Classic C24
Rocking Shaker	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA	55
Petri dishes	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.	4001
Sony DXC-33 Video camera	Sony
Richardson test slide	Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA	80303
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, Dounce	VWR	71000-518