熱の予防によりラットに悪影響をストレス<em&gt;枯草菌</em&gt;ひずみ

要約

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

要約

この研究は、熱ストレスに関連する合併症に対するバチルス・ズブチリス株の保護効果を評価するために設計しました。 32個のSprague-Dawleyラットをこの研究で使用しました。動物は、経口Bとの 2日間、1日2回処理しました。 サブチリス BSB3株またはPBS。最後の処置後の翌日、各グループを分割し、2つの実験群（PBS及び枯草菌で処理したものと処理したもの）25分間^、45°Cのに置きました。 2つの対照群は、室温で25分間滞在しました。全てのラットを安楽死させ、別のパラメータは、すべての群で分析しました。熱ストレスの悪影響が絨毛の高さと腸上皮における総粘膜の厚さの減少により登録されています。内腔からの細菌の転。赤血球および血液中のリポ多糖（LPS）レベルの上昇の小胞形成を増加させました。治療の予防効果は、事前によって評価されますこれらの副作用の発明。プロトコルは、熱ストレスの合併症の予防のための細菌とラットの経口治療のために設立されたが、このプロトコルは、他の投与経路のために、異なる化合物の分析のために修正して使用することができます。

概要

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses¹. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases^2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation^4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions⁶. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects.

Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders^7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models^11,12.

Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis¹³ and have beneficial effects on the host¹⁴. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro^15,16 and in clinical trials^17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

プロトコル

全ての実験手順は、オーバーン大学のIACUC、オーバーン、アラバマ州によって承認されました。

文化メディア、食器や細菌培養の作製

1. 栄養寒天プレート上で一晩増殖させた枯草菌 BSB3文化の単一コロニー、フラスコに栄養培地の10ミリリットルを接種します。
2. バクト栄養ブロス、8グラム1.2％（v）の硫酸マグネシウム_{4×7H 2} O、10ミリリットル/ワット;寒天、15;（v）の塩化カリウム、10ミリリットル/ wの10％：リットル当たり^（19培地胞子形成の500ミリリットルを作りますg）を、20分間^121°Cのオートクレーブ。 ^50°Cのに冷却し、以下の滅菌溶液を追加することを許可する：1 MのCa（NO _3）2、1ミリリットルを、 0.01 MのMnCl _2、1ミリリットル。 1 mMのは_4、1ミリリットルをのFeSO。
3. 室温で20分間^40°Cのに準備された培地を冷却し、滅菌キャビネットに20の滅菌ペトリ皿のそれぞれに25ミリリットルを注ぎます。媒体は一晩固化してみましょう。
4. Bの一晩培養物0.5ミリリットルを広めますacillusサブチリスBSB3ペトリ皿中の培地の表面上に。 90％の胞子形成するまで、5日間^37°Cの時に文化をインキュベートします。高解像度の顕微鏡による位相明るい胞子を明らかにしました。
5. プレートに無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1ml添加​​し、無菌細胞スプレッダーを用いて表面から細菌を掻き取ることによって収穫細菌。必要になるまで冷蔵庫にサスペンションを保管してください。
6. 37 ^O℃で24時間- 18のためのインキュベーションに続いて胞子形成培地プレート上の細菌懸濁液の適切な希釈（10 ^{-5〜10 -6）}の0.1ミリリットルをメッキすることにより細菌の生存能力を確認
7. コロニーカウンターを用いて、プレート上の細菌コロニーをカウントし、テストした懸濁液中の細菌の力価を計算します。最終濃度が1×10 ⁸ CFU / PBS中のmlの細菌懸濁液を準備します。

2.動物

1. 300グラム - 32オスのSprague-Dawleyラット（250を使用します）。標準のペレット餌と水に自由にアクセスできる特定の病原体を含まない条件下で動物を維持します。平均温度（21±1 ^O℃）、湿度（50±5％）と12時間の明暗サイクルを確立します。

3.実験計画

1. 順化の2日後、強制経口投与¹¹により、動物の治療を開始します。強制経口投与針で注射器を使用してください。 Bで16匹のラットを扱いますズブチリス BSB3懸濁液（ラット当たり1ミリリットル）2日間一日二回（ 枯草菌群 ）。 PBSで16匹のラットの治療（ラット当たり1ミリリットル）一日二回2日間（PBS群）（図1）。
2. グループ1-コントロール（PBS /ストレス無し）、グループ2位B.：処理後、各グループ（グループ当たり8匹のラット）を細分化枯草菌 （ 枯草菌 /ストレスなし）、グループ、3-ストレス（PBS /熱ストレス）とグループの4- B.枯草菌 +ストレス（ 枯草菌 /熱ストレス）。
3. ELECを使用して、各ラットの直腸温度を測定デジタル温度計をTRONIC。 25分間室温でグループ1と2のラットを保管してください。 25分間、45 ^{O C}と相対湿度55％での人工気象室に入れグループ3と4の動物を。
4. その後、電子デジタル体温計を使用して、すべてのグループ内の各ラットの直腸温度を測定します。 4時間室温ですべての動物を配置します。
5. 密閉可能な麻酔ジャー中 - （4％2）とラットを深く（つま先のピンチへの応答の欠如）を麻酔されるまで観察イソフルランでラットを麻酔。ギロチンで迅速な断頭によりラットを安楽死させます。
6. 血清を取得し、すぐに顕微鏡検査のためのピペットを用いて血液のサンプル（各ラットから7μl）を取るために非発熱性のチューブに非発熱性ピペットで- （16ミリリットル15）各ラット²⁰からトランク血液を採取します。
7. 凝固を可能にするために、少なくとも30分間、冷蔵庫で血液を試験管に入れてください。 ^20°Cの時の遠心分離管、7,000×gで10分間、迅速にピペットで血清を除去。一定分量の血清をアッセイまで-20 ^{O C}で50μlのボリュームとストアに各ラットから得られました。

4.手術手順

1. カット/電気ハサミでカーカスの下の腹部と胸部からすべての毛皮をトリミング。滅菌キャビネットにカーカスを配置し、70％アルコールでカーカスの毛を剃っ表面を処理。
2. 腹部の正中切開を作成するために、滅菌メスを使用してください。滅菌ピンセットを用いて、各ラットから肝臓、腸間膜リンパ節、脾臓、および小腸を削除します。

細菌転移の5分析

1. 予め秤量した滅菌チューブに肝臓、腸間膜リンパ節および脾臓の各サンプルを置き、重量を量ります。サンプルとチューブの重量と空のチューブの重量の差として試料の重量を計算します。
2. 1:10希釈液を得るためにチューブに無菌PBSを加える（w / v）のサンプルとhomoge均一な懸濁液^21を得るために^、滅菌ガラス組織ホモジナイザーで各サンプルをnize。
3. 滅菌PBSで各サンプルの連続希釈（10 ^{-1〜10 -4）}を作成します。プレートヘミン（0.005グラム/ L）とビタミンK1（0.01グラム/ L）プレートとマッコンキーの表面および5％血液寒天とブルセラ血液寒天上に各組織のすべての希釈の0.1ミリリットル。
4. ^{37°Cの 22}で嫌気性条件下マッコンキー、5％血液寒天プレート好気的およびブルセラ血液寒天プレートをインキュベートします。
5. 24時間後に好気性細菌のコロニー、およびコロニーカウンターを用いて、インキュベーションの48時間後の嫌気性細菌のコロニーを数えます。組織のグラムでのコロニー形成単位（CFU）の数として結果を表しています。

6.組織学的解析

1. （ - 4.2 4.1ステップ）、外科的処置によって、各ラットから小腸サンプルを削除します。ブアン固定液、パラフィン中に埋め込み、内のサンプルを修正しました。標準的な手順^23を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシンで6μmのセクションおよび染色切片を作製。
2. 各サンプル（倍率^100X）24で腸絨毛と総粘膜の厚さの高さを測定するための高解像度の顕微鏡システムを使用してください。各ラットからの4つのサンプルを分析し、各試料中の少なくとも20の測定を行います。マイクロメートルで結果を表現します。

7.サイトカインアッセイ

1. IL-1βのための商業用ラットのELISAキットを使用します。 IL-6。 TNF-α;製造業者のプロトコールに従って血清中のサイトカインのレベルを測定するためのINF-γ、およびIL-10。
2. 関連するキットの標準を使用してアッセイしたサンプルの各セットのための標準曲線を生成します。適切な標準曲線と実験データを比較することにより、各サンプル中のサイトカインのレベルを定義します。

8.リポ多糖アッセイ

1. に従ってラットLPS ELISAキットを用いて血清中のLPSのレベルを分析製造業者のプロトコル。標準曲線の値で得られた値と比較することにより試料中のLPSの濃度を推定します。

血液の9高解像度光学顕微鏡

1. 以前に^25,26説明した顕微鏡システムを使用してください。ライブ画像を記録する顕微鏡システムの基本とビデオカメラとコンピュータ²⁵として防振プラットフォームを使用します。以前に^27を説明したようにリチャードソンのスライドを使用してテスト画像を調整します。
2. スライドガラス、カバーガラス、写真上の各ラットから新たに採取した血液の7μLを置 ​​き、各サンプル（倍率1,700X）で72×53.3ミクロン²の10の画像フレームを記録します。
3. リアルタイムで高解像度の直視光学像を提供するソフトウェアを使用して、小胞の濃度を測定します。各実験条件²⁸のための20の画像フレームの最小値を調べます。

10. STATISチック

1. 平均と標準偏差としてすべての値を表現します。統計分析とグラフ描画を実行します。 2標本t検定を用いた結果を分析し、統計的有意性を定義するために0.05で有意水準を設定します。

結果

熱ストレス前後とすぐに動物の平均体温は、それぞれ36.7±0.07 ^{O C}と^{40.3±0.17°Cの} 、（P <0.05）でした。熱への暴露ラット（群3）は、絨毛の高さおよび全粘膜の厚さ（図2、図3）の有意な阻害をもたらしました。ストレス前BSB3株の経口投与は、熱の有害な影響から腸を保護しました。

腸からの?...

ディスカッション

深刻な健康状態²⁹内の高温の結果への暴露。予防と熱ストレスに関連する合併症の早期発見は極めて重要³⁰です。 提示されたプロトコルは、熱ストレスの有害作用の防止のための様々なアプローチの有効性を評価するために使用することができます。

このプロトコル内の重要なステップは次のとおり熱処理手順^（45°Cの 、25分）。エ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
MacConkey agar plates	VWR	470180-742
5% blood agar plates	VWR	89405-024
Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K	VWR	89405-032
Bouin’s Fixative	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Rat ELISA kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC4021
TNF-alpha Rat ELISA Kit	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Rat LPS ELISA Kit	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Environmental Chamber 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Centrifuge	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony counter	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Freezer	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra microplate reader	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Classic C24
Rocking Shaker	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA	55
Petri dishes	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.	4001
Sony DXC-33 Video camera	Sony
Richardson test slide	Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA	80303
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Tissue Homogenizer, Dounce	VWR	71000-518