تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

Summary

تفاصيل هذا البروتوكول الخطوات الهامة اللازمة لbioconjugation من السيستين التي تحتوي على البروتين لmaleimide، بما في ذلك تنقية الكاشف، ظروف التفاعل، وتنقية bioconjugate وتوصيف bioconjugate.

Abstract

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Introduction

Bioconjugation ينطوي على ربط تساهمي جزيء حيوي واحد مع آخر أو مع جزيء اصطناعي مثل صبغة، المخدرات أو البوليمر. وتستخدم أساليب bioconjugation البروتين الآن على نطاق واسع في العديد من المجموعات البحثية والكيمياء، والبيولوجيا، وتكنولوجيا النانو مع تطبيقات تتراوح بين الفلورسنت صبغ العلامات ^1،2، مما يجعل من البروتين (الضد) -prodrugs ³ (تقارن الأجسام المضادة المخدرات - ADCS) توليف البروتين dimers ^4،5 ، وصولا إلى السيارات الهجينة البروتين البوليمر الذاتي تجميع ^6،7 المستخدمة في النانوي ⁸ و أنظمة الكيمياء ^9.

خصوصية الكيمياء المستخدمة لbioconjugation، في حين لا تنتقد دائما، هو من أهمية قصوى بالنسبة bioconjugates البروتين الأكثر وظيفية، حتى لا تتداخل مع موقع نشط من البروتين الهدف. يحتاج رد فعل bioconjugation المثالي لتحقيق عدة معايير، بما في ذلك: أ) استهداف مواقع نادرة أو فريدة من نوعها على البروتين من الفائدة،ب) أن يكون انتقائيا نحو تحقيق هذا الهدف، ج) المضي قدما في ظل ظروف غير تغيير طبيعة لتجنب البروتين تتكشف والرابع) تكون ذات العائد المرتفع مثل البروتين المستهدف عادة ما يتوافر فقط في تركيز شبه millimolar. وmaleimide - السيستين مايكل بالإضافة يقترب من تحقيق كل هذه المعايير، ولديها لهذا السبب ادعى طويلة وضعا خاصا في مجال bioconjugate الكيمياء ^10. هذا هو لأنني) العديد من البروتينات التي تحتوي على السيستين واحد فقط بقايا على سطحها يمكن راثيا هناك، ثانيا) في الرقم الهيدروجيني الصحيحة رد فعل انتقائي للغاية نحو السيستين، ج) وهي تنطلق بسلاسة في المخازن المائية والرابع) فهي سريعة جدا مع معدل ثابت الدرجة الثانية من maleimides للبروتينات التي تحتوي على السيستين ذكرت أن تتجاوز 5000 م ^-1 ثانية ^-1 في بعض الحالات ^11. قدمت البروتين من الفائدة يمكن أن يتسامح مع كمية صغيرة (≈ 5-10٪) من عضوية المشارك المذيبات ^12، أي ما يقرب صبغ functionalized maleimide، صlymer، السطح أو بروتين آخر يمكن ربط البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، maleimides هم أكثر تحديدا لcysteines على البروتينات من iodoacetamides، والتي هي أكثر عرضة للتفاعل مع محب للنواة أخرى في درجة الحموضة المرتفعة. وأكثر استقرارا من الإقتران القائم على ثاني كبريتيد التي تحتاج إلى أن تبقى في درجة الحموضة الحمضية لمنع الصرف ثاني كبريتيد ^13.

نحن هنا نورد بروتوكول عام لتصريف جزيئات functionalized maleimide إلى البروتين تحتوي على بقايا السيستين واحدة باستخدام تفاعل بين رو (II) حامل اللون المستندة إلى والبروتين الأكسدة السيتوكروم ج كمثال على ذلك. هذا البروتوكول هو ينطبق أيضا على معظم البروتينات الأخرى التي تحتوي على الوصول بقايا السيستين السطحية والمستهدفة functionalized maleimide المقابلة، سواء كان بروتين آخر، صبغة الفلورسنت، وحامل اللون أو البوليمر الاصطناعية.

Protocol

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لتركيب وbioconjugate البروتين صبغ كما هو مبين في الشكل رقم 1 وهو بروتوكول عام للتفاعل من maleimide مع السيستين سطح مجانية تحتوي على البروتينات، مع ملاحظات إدراج حيثما ينطبق ذلك للمساعدة في بروتين الغشاء. bioconjugates، bioconjugates البروتين البوليمر، وديمر البروتين المركب (البروتين البروتين) bioconjugates. في هذه الحالة بالذات، البروتين ISO-1 السيتوكروم لديها واحد سطح السيستين بقايا المتاحة للرد الذي يسمح لوضع العلامات محددة للغاية للتحدث. إذا كان البروتين من الفائدة لديها بقايا السيستين متعددة، وينطبق نفس البروتوكول، وإن كان ذلك مع فقدان للخصوصية وتجانس المنتج. الكيمياء تستهدف بقايا يسين السطح، وذلك باستخدام N -hydroxysuccinimidyl استرات أو ايزوثيوسيانيتس، قد يكون نهجا أكثر بساطة إذا لم يتم تتطلب التحديد.

الشكل مخطط رد الفعل 1. Bioconjugation. وحالة سبيل المثال، حصاد الضوء، وسوف تعلق على أساس الروتينيوم جزيء هوائي لالسيتوكروم عبر مايكل إضافة maleimide قلادة على جزيء هوائي القائم على الروثينيوم وبقايا السيستين يتعرض (CYS102) على البروتين. المنطقة الحمراء لسطح CYT ج يشير إلى مجموعة الهيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تنقية السيتوكروم ج

ملاحظة: هذه الخطوة لا تنطبق على جميع البروتينات. ومع ذلك، فمن المهم أن نعرف أن البروتين الحصول عليها من المورد التجاري يمكن أن تحتوي على أخرى، الإسوية بروتين غير مرغوب فيها والتي قد تحتاج إلى إزالتها عن طريق مزيد من تنقية ^13.

1. حل 2.4 غرام من فوسفات هيدروجين الصوديوم (M _ث = 120 غرام مول ^-1) في 1 لتر من الماء عالى النقاء إلى العلاقات العامةepare حل العازلة التي تحتوي على 20 ملي ناه ₂ ص _4. ضبط درجة الحموضة مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 7.
   ملاحظة: مخازن الفوسفات المستخدمة في هذا البروتوكول يجب الطازجة بشكل يومي، وتصفيتها من خلال 0.2 ميكرون السليلوز غشاء فلتر قبل استخدامها.
2. حل 29.22 غرام من كلوريد الصوديوم (M _ث = 58.44 غرام مول ^-1) في 500 مل من ناه ₂ عازلة 20 ملي ص ₄ لجعل 20 ملي ناه ₂ ص ₄ و 1 عازلة M كلوريد الصوديوم. هذا هو شطف العازلة للتنقية في الخطوة 1.6).
3. حل 12.0 ملغ من مجفف بالتجميد السيتوكروم ج (CYT ج) في 6 مل من درجة الحموضة 7 20 ملي العازلة الفوسفات.
4. بشكل منفصل بحل 14.7 ملغ من dithiothreitol (DTT، M _ث = 154.25 جم / مول) في 95.3 ميكرولتر من الماء عالى النقاء لإعداد محلول المخزون 1 م.
   ملاحظة: الحل الأسهم DTT يجب الطازجة، وهذا كاشف هو عرضة للتعطيل التأكسدي في محلول مائي.
5. بذرةETTE 60 ميكرولتر من محلول 1 M DTT في حل البروتين للحد من CYT ج. وهذا اللون من الحل تتغير من الأحمر الداكن إلى اللون الأحمر الفاتح على الاختلاط.
6. تصفية خفض حل البروتين من خلال 0.22 ميكرون منخفض البروتين PVDF ملزمة فلتر حقنة قبل الحقن على أي وسيلة إعلامية الكروماتوغرافي.
7. إرفاق عمود تبادل الأيونات الموجبة 3.3 مل قوية بين حلقة الحقن وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس لاللوني السائل (FPLC) أداة البروتين سريع.
8. تتوازن العمود مع 3 مجلدات عمود من الماء عالى النقاء، تليها 3 مجلدات عمود 20 ملي درجة الحموضة 7 عازلة الفوسفات، وذلك باستخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة.
9. تحميل 1 مل من انخفاض CYT الخام ج في حلقة الحقن، وبدء أسلوب التدرج 328-450 مم كلوريد الصوديوم، وأكثر من 5 مجلدات العمود. رصد 280 نانومتر و 410 نانومتر قنوات كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس، وجمع أكبر الذروة.
10. زيادة تركيز الملح إلى 1 M ل2 مجلدات العمود إلى أزل ISO-2 سيتوكرومه ج، وبعد أن تم مسح العمود، وإعادة تتوازن العمود مع 2 مجلدات عمود 20 ملي العازلة الفوسفات قبل حقن قسامة الخام القادمة.
11. كرر الخطوات من 1،9-1،10 حتى يتم تنقية جميع البروتين الخام.
12. تجميع ISO-1 تحتوي على كسور والتركيز عليها باستخدام 3.5 كيلو دالتون الوزن الجزيئي القطع (MWCO) مرشح تدور والطرد المركزي في 3000 ز س.
13. تحميل البروتين تتركز في 3.5 أشرطة غسيل الكلى كيلو دالتون MWCO وdialyze ضد عالى النقاء الماء طوال الليل، مع 2 التغييرات من الماء.
14. تحديد تركيز المحلول البروتين النقي، مركزة عن طريق أخذ 10 ميكرولتر، تمييع إلى 100 ميكرولتر مع الماء عالى النقاء، وأخذ الطيف الامتصاصية. استخدام حجم منخفض، و 100 ميكرولتر كوفيت الكوارتز للحصول على البروتين الامتصاصية الأطياف. عادة، وتركيز البروتين مخفف هو بناء على أمر من 50-100 ميكرون.
    1. استخدام مميزة ذروة 410 نيوتن متر من CYT ج لتحديد concentratioن استخدام قانون بير لامبرت مع قيمة الامتصاصية المولية من 97.6 سم ^-1 ملي ^-1:
       A = ε × ج × ι
       حيث A هو الامتصاصية، ε هو الامتصاصية المولية، ج هي تركيز في ملي، وι هو طول مسار كفيت في سم ^13.
15. عند هذه النقطة، تقسيم البروتين في 1 مل قسامات والحفاظ المجمدة في -20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها. CYT ج يمكن تجميد وإذابة دون فقدان للهيكل أو وظيفة، ولكن سوف تبدأ دورات تكرار لتفسد البروتين.
    ملاحظة: والبروتينات تتسامح تجميد بدرجات مختلفة. على سبيل المثال، البروتينات الفلورية الخضراء ^5،9 لا ينبغي تجميدها، بدلا من تخزينها في الثلاجة.

2. تجميع السيتوكروم ج Bioconjugates

1. حل 0.9 ملغ من الروثينيوم (II) bisterpyridine maleimبيئة تطوير متكاملة (رو (II) (طن سنويا) ₂ -maleimide، 0.975 مكرومول، 6 يعادله) في 600 ميكرولتر من الأسيتونتريل.
   ملاحظة: إذا كان maleimide المستخدمة قابلة للذوبان في الماء، وإعداد محلول المخزون في الماء بدلا من الأسيتونتريل. ومن المهم للmaleimide لتكون قابلة للذوبان في المخزن المؤقت رد فعل. ثنائي ميثيل سلفوكسيد، وتستخدم N، N -dimethylformamide، والأسيتونتريل كل عادة المواد المساعدة للمساعدة في حل منخفضة الوزن الجزيئي ^12، في كثير من الأحيان الكواشف maleimide مسعور.
2. يعد حل العازلة التي تحتوي على 100 ​​ملي العازلة الفوسفات، و 100 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA، M _ث = 292.24 جم / مول)، والتي عندما المخفف إلى 20 ملي هو في درجة الحموضة 7. اضافة هيدروكسيد الصوديوم الصلبة حتى يذوب EDTA (عدة جرامات عادة ) وضبط درجة الحموضة إلى 7.
3. حل 2.87 ملغ من تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP ^15، م _ث = 286.65 جم / مول) في 1 مل من الماء عالى النقاء لإعداد ملي حل الأوراق المالية 10. هذه الخطوة هي استيرادنملة لضمان أن السيستين على البروتين يخفض بشكل كامل قبل maleimide اقتران ^15.
   ملاحظة: ينبغي إعداد محلول المخزون TCEP حديثا لكل رد فعل، وهذا كاشف هو عرضة للتعطيل التأكسدي في محلول مائي.
4. الجمع بين 11.4 مل من الماء عالى النقاء مع 3 مل من 100 ملي حل الأسهم الفوسفات / EDTA في 50 مل أنبوب بلاستيكي. عندما تضعف أكثر مع حلول البروتين والأسهم maleimide تركيز عازلة ستكون 20 ملم.
   ملاحظة: إذا كان البروتين وصمها هو بروتين الغشاء، وضمان أن تتم إضافة المنظفات مناسبة إلى المخزن المؤقت لإذابة البروتين. إذا لم يتم استخدام المنظفات البروتين الغشاء قد يعجل ببطء، مما سيؤثر سلبا على عائدات رد فعل. استخدام المنظفات في كل خطوات تنقية اللاحقة.
5. إضافة 0.15 مكرومول (3 مل من حل 50 ميكرومتر، 1 ما يعادلها) من تنقية CYT ج إلى المخزن المؤقت الفوسفات EDTA.
6. إضافة 7.5 ميكرولتر من solut الأسهم TCEPأيون (0.075 مكرومول، و 0.5 في حكمه) إلى حل البروتين وترك التحريك لمدة 5 دقائق للحد من أي البروتين الذي قد dimerized بسبب الأكسدة السيستين.
   ملاحظة: لا تقم بإضافة TCEP إذا كان البروتين من الفائدة لا dimerize بسهولة. التحقق من ذلك عن طريق تشغيل هلام بروتين في ظل ظروف غير الحد.
7. إضافة 600 ميكرولتر من محلول الأسيتونتريل رو (II) (طن سنويا) ₂ -maleimide إلى انخفاض الحل، مخزنة من CYT ج، وترك التحريك خليط التفاعل، في الظلام، في RT، لمدة 24 ساعة.
8. تركيز خليط التفاعل باستخدام 3.5 كيلو دالتون MWCO مرشحات تدور، الطرد المركزي في 3000 x ج، تكرار 2-3 مرات مع الطازجة 20 ملي العازلة الفوسفات حتى ينتهي الترشيح واضح. إزالة أكبر قدر من maleimide غير المتفاعل من خليط التفاعل ممكن قبل المرحلة التالية من التنقية.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، وخليط bioconjugation الخام يمكن تخزينها في الثلاجة، في الظلام. ومن المهم لإزالة الصبغة maleimide غير المتفاعل من قبل الطرد المركزيifuge غسيل الكلى قبل التخزين كما maleimide يمكن ببطء وnonspecifically تتفاعل مع بقايا يسين على سطح البروتين.

3. تنقية Bioconjugates ج السيتوكروم

1. حل 2.4 غرام من الصوديوم هيدروجين فوسفات و29.22 غرام من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء عالى النقاء لإعداد محلول العازلة التي تحتوي على 20 ملي ناه ₂ ص ₄ و 0.5 M كلوريد الصوديوم. هذا هو المخزن المؤقت الترشح لتنقية يجمد المعادن تقارب اللوني (ايماك).
2. حل 17 غرام من ايميدازول (M _ث = 68.077 ز مول ^-1) في 500 مل من 20 ملي ناه ₂ ص ₄ و 0.5 عازلة M كلوريد الصوديوم. هذا هو شطف العازلة لتنقية ايماك.
3. ضبط درجة الحموضة من كلا مخازن لدرجة الحموضة 7 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك، وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرون أغشية السليلوز مجدد قبل استخدامها في FPLC.
4. كما يتم شحنها الأعمدة ايماك شراؤها دون أي ايونات المعادن تحميلها على عمودUMN، وإعداد عمود لني ²⁺ تنقية المستندة عن طريق غسل العمود مع 3 مل من الماء عالى النقاء، 3 مل من 100 ملي حل النيكل خلات، و 6 مل من الماء عالى النقاء. إذا كان ليس لاستخدامها العمود على الفور غسل خلال 3 مل من 20٪ من الإيثانول وتخزين العمود في الثلاجة لمنع نمو البكتيريا.
5. إرفاق ني ²⁺ -loaded 1 مل العمود ايماك للFPLC بين حلقة الحقن وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس.
6. تتوازن العمود مع 3 مجلدات عمود 20 ملي فوسفات، 0.5 عازلة M كلوريد الصوديوم باستخدام معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.
7. تحميل 100 ميكرولتر من خليط التفاعل الخام (التي تمت تصفيتها من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون) على عمود ني ²⁺ ايماك. غسل العمود مع 3 مجلدات عمود العازلة على التوالي إلى أزل غير رد فعل CYT ج، تليها التدرج ايميدازول 0-125 ملم أكثر من 3 مجلدات العمود إلى أزل الروتينيوم-bisterpyridine السيتوكروم ج bioconjugate (رو (II) -cyt ج) .
8. غسل جolumn مع 250 ملي العازلة ايميدازول لمدة 5 مجلدات العمود، ثم إعادة توازن العمود مع 20 ملي الفوسفات، و 0.5 M كلوريد الصوديوم وكرر الخطوة 3.7 حتى يتم تنقية جميع bioconjugate الخام.
9. تجميع الكسور bioconjugate والتركيز عليها باستخدام 3.5 كيلو دالتون MWCO مرشح تدور، الطرد المركزي في 3000 ز س.
10. تحميل bioconjugate تتركز في 3.5 أشرطة غسيل الكلى كيلو دالتون MWCO وdialyze ضد عالى النقاء الماء طوال الليل، مع 2 التغييرات من الماء.
11. تحديد تركيز نقية، حل bioconjugate تتركز الأشعة فوق البنفسجية فيس، وذلك باستخدام نفس القيمة الامتصاصية المولية كما ISO-1 السيتوكروم ج (97.6 مم ^-1 سم ^-1) في 410 نانومتر. عادة، وتركيز bioconjugate هو بناء على أمر من 50-100 ميكرون.
12. تقسيم bioconjugate إلى 25 مكل والحفاظ المجمدة في -20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها.

4. توصيف Bioconjugates ج السيتوكروم

1. ردعmination من كتلة bioconjugate بواسطة MALDI-TOF MS
   1. حل 10 ملغ من caffeic حامض في 1 مل من محلول الأسيتونتريل / المياه / حمض trifluoroacetic (80: 20: 0.1، ت / ت / ت).
   2. تمييع 5 ميكرولتر من محلول البروتين المركز مع 5 ميكرولتر من حل caffeic حامض.
   3. بقعة 0.5 ميكرولتر من محلول caffeic حامض على لوحة الهدف MALDI والسماح للحل لتجف.
   4. بقعة 0.5 ميكرولتر من محلول العينة / مصفوفة على رأس هذه البقعة caffeic حامض، والسماح للبقعة لتجف. بقعة 0.5 ميكرولتر أخرى من عينة مصفوفة على رأس هذا إلى "ساندويتش" العينة بين طبقات من المصفوفة، والسماح ليجف.
   5. الحصول على أطياف الشامل في الوضع الخطي باستخدام إعدادات أداة مناسبة لالبروتينات ^16.
2. التحقيق في bioconjugates بواسطة الكهربائي للهلام
   1. استعد 10 ميكرولتر من كل عينة البروتين ليتم تشغيلها عن طريق تمييع عينات البروتين مع كبريتات الليثيوم خلط دوديسيل (LDS، ودرجة الحموضة 8.4) عازلة (4X) رالزراعة العضوية تركيز النهائي من ما يقرب من 20 ميكروغرام لكل بئر. للآبار التي تتطلب الحد من الظروف، إضافة 1 ميكرولتر من 500 ملي dithiothreitol (DTT) الحد من وكيل (10X).
   2. عينات الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   3. إضافة 50 مل من الممزوجة مسبقا 1 M زارة التربية والعلم، 1 M تريس قاعدة، 2٪ SDS، 20 ملي EDTA (درجة الحموضة 7.7) يعمل خليط عازلة (20x و) من مصدر تجاري إلى 950 مل من الماء عالى النقاء لإعداد عازلة هلام قيد التشغيل.
   4. إزالة المشط البلاستيك من هلام ووضع الجل في خزان هلام التوالي. تعبئة خزان العازلة مع هلام تشغيل بحيث تتم تغطية الآبار مع العازلة.
   5. نماذج تحميل بعناية في الصعود إلى الجاهزة 12٪ مكرر تريس، 1 مم، 10-جيدا هلام باستخدام نصائح ماصة طويلة للمساعدة في التحميل. تحميل prestained 10 البروتين الوزن الجزيئي علامة (3-188 كيلو دالتون) في بئر الأوسط من هلام لمساعدة التحليل.
   6. تشغيل هلام في 200 V الجهد المستمر لمدة 35 دقيقة.
   7. وصمة عار الجل مع Coomassie حل الزرقاء التجاري لمدة 2 ساعة، ويغسل مع ultrapالمياه لدى عودتهم لمدة 48 ساعة.
3. تقرير من النقاء bioconjugate بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس
   1. إعداد 120 ميكرولتر من 5 ميكرومتر حلول رو (II) (طن سنويا) ₂ -maleimide، ISO-1 CYT ج، ورو (II) ج -cyt.
   2. قياس الطيف الأساس كفيت الكوارتز تحتوي على الماء عالى النقاء الوحيد، من 250 نانومتر إلى 650 نانومتر.
   3. قياس الطيف لكل مكون، وضمان تشطف كفيت وتجفيفها بين كل قياس.
   4. رسم الامتصاصية من كل عنصر بوصفها وظيفة من الطول الموجي، ومقارنة المبلغ خطية من المواد الأولية مع المنتج النهائي لتحديد ما إذا كان نسبة 1: 1 رو (II) (طن سنويا) ₂ -maleimide إلى CYT ج وكان رد فعل.

النتائج

ويؤكد تركيب bioconjugates بواسطة ثلاث طرق رئيسية: مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الرحلة الطيف الكتلي (MALDI-TOF MS)، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام، والأشعة فوق البنفسجية-مرئي (أشعة فوق البنفسجية فيس) التحليل الطيفي، كما هو مبين في الشكلين 2، 3<...

Discussion

تنقية المواد الأولية قبل bioconjugation أمر في غاية الأهمية. البروتينات التي تم الحصول عليها من مصادر المؤتلف التجارية غالبا ما تحتوي على الإسوية أخرى من البروتين من الفائدة، والتي يمكن أن يكون مختلفا الكيمياء السطحية والقابلية للتفاعل. على سبيل المثال، في bioconjugation وصفها، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 ml strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 ml IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	Extremely corrosive! Use caution.
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette