Synthèse des bioconjugués protéiques<em&gt; via</em&gt; Cystéine-maléimide Chemistry

Résumé

Ce protocole détaille les étapes importantes nécessaires pour la bioconjugaison d'une cystéine contenant la protéine à un maléimide, y compris la purification des réactifs, des conditions de réaction, la purification de bioconjugués et bioconjugué de caractérisation.

Résumé

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Introduction

Bioconjugaison consiste à lier de façon covalente une molécule biologique avec un autre ou avec une molécule synthétique tel qu'un colorant, un médicament ou un polymère. Méthodes de bioconjugaison de protéines sont maintenant largement utilisés dans de nombreux groupes de recherche chimie, la biologie et de la nanotechnologie avec des applications allant de fluorescent étiquetage de colorant ^1,2, ce qui rend la protéine (anticorps) -prodrugs ³ (conjugués anticorps - médicaments - CAN) la synthèse de dimères de protéines ^4,5 grâce à des hybrides d'auto-assemblage des protéines utilisées dans les polymères ^6,7 nanomedicine ⁸ et les systèmes de chimie ^9.

Spécificité de la chimie utilisée pour la bioconjugaison, tandis que pas toujours critique, est d'une importance capitale pour les bioconjugués protéiques les plus fonctionnels, de manière à ne pas interférer avec le site actif de la protéine cible. La réaction de bioconjugaison idéal doit remplir plusieurs critères, y compris: i) ciblant des sites rares ou uniques sur la protéine d'intérêt,ii) être sélectif vers cet objectif, iii) procéder dans des conditions non dénaturantes pour éviter le dépliement des protéines et iv) être à haut rendement comme la protéine cible est habituellement disponible uniquement à la concentration de sous-millimolaire. Le maléimide - Michael addition de cystéine se rapproche de remplir tous ces critères, et a pour cette raison selon longtemps un statut particulier dans le domaine de la chimie bioconjugué ^10. En effet, i) de nombreuses protéines contenant des résidus une seule cystéine sur leur surface peuvent être génétiquement là, ii) au bon pH de la réaction est très sélective vers cystéine, iii) il se déroule sans problème dans des tampons aqueux et iv) il est très rapide avec la seconde constante de vitesse de premier ordre de maléimides à des protéines contenant de la cystéine déclarés dépasse 5 000 M ^-1 s ^-1 dans certains ¹¹ cas. Pourvu que la protéine d'intérêt peut tolérer un petit (≈ 5-10%) quantité de co-solvant organique ^12, presque tout colorant maléimide fonctionnalisés, poLymer, une surface ou une autre protéine peut être liée aux protéines. En outre, les maléimides sont plus spécifiques pour les cysteines sur les protéines que les iodoacétamides, qui sont plus enclins à réagir avec d'autres agents nucléophiles à un pH élevé; et plus stables que les conjugaisons à base de disulfures, qui doivent être conservés à un pH acide pour empêcher l' échange de disulfure ^13.

Nous rapportons ici un protocole générique pour la conjugaison de molécules à fonction maléimide à une protéine contenant un résidu de cystéine unique en utilisant la réaction entre un Ru (II) à base chromophore et la protéine d'oxydo - réduction du cytochrome c à titre d'exemple. Ce protocole est également applicable à la plupart des autres protéines contenant un résidu de cystéine de la surface accessible et la cible correspondante à fonction maléimide, que ce soit une autre protéine, un colorant fluorescent, un chromophore ou un polymère synthétique.

Protocole

Remarque: Le protocole suivant a été conçu pour la synthèse d'un bioconjugué protéine-colorant , comme illustré sur la figure 1 Il est un protocole général pour la réaction d'un maléimide avec des protéines cystéine libre de surface contenant, avec des notes insérées le cas échéant , pour aider à la protéine membranaire. bioconjugués, bioconjugués protéine-polymère et d'un dimère de synthèse des protéines (protéine-protéine) bioconjugués. Dans ce cas particulier, la protéine iso-1 cytochrome c a un résidu cystéine de surface disponible pour réagir qui permet à un étiquetage très spécifique de se produire. Si une protéine d'intérêt a plusieurs résidus cystéine, le même protocole est applicable, bien que la perte de la spécificité et l'homogénéité du produit. Résidus de lysine de surface de chimie de ciblage, en utilisant les esters ou isothiocyanates de N, peut être une approche plus simple si la spécificité est pas nécessaire.

Figure schéma de réaction 1. bioconjugaison. Comme un cas d'exemple, une récolte de lumière, molécule d'antenne à base de ruthénium sera jointe au cytochrome c par addition de Michael d'un maléimide pendentif sur la molécule d'antenne à base de ruthénium et un résidu cystéine exposé (CYS102) sur la protéine. La zone rouge de la surface cyt c indique le groupe hème. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. La purification du cytochrome c

Remarque: Cette étape est pas applicable à toutes les protéines. Cependant, il est important de savoir qu'une protéine obtenue à partir d' un fournisseur commercial peut contenir d' autres isoformes de protéines indésirables qui peuvent avoir besoin d'être éliminés par une purification supplémentaire ^13.

1. Dissoudre 2,4 g de dihydrogénophosphate de sodium _(M = 120 g mol ^-1) dans 1 litre d'eau ultrapure à prepare une solution tampon contenant 20 mM de NaH ₂ PO _4. Ajuster le pH avec du NaOH 1 M à un pH de 7.
   Remarque: Les tampons phosphates utilisés dans ce protocole doivent être fraîchement préparés sur une base quotidienne, et filtrés à travers un filtre à membrane de 0,2 um de cellulose avant l'utilisation.
2. Dissoudre 29,22 g de chlorure de sodium _(M = 58,44 g ^-1 mol) dans 500 ml de NaH ₂ PO ₄ 20 mM de tampon pour effectuer une mM de NaH ₂ PO ₄ 20 et du tampon 1 M de NaCl. Ceci est le tampon d'élution pour la purification à l'étape 1.6).
3. Dissoudre 12,0 mg du cytochrome c lyophilisé (cyt c) dans 6 ml de pH 7 , 20 mM de tampon phosphate.
4. Séparément dissoudre 14,7 mg de dithiothréitol (DTT, M _w = 154.25 g / mol) dans 95,3 ul d'eau ultrapure pour préparer une solution mère 1 M.
   Remarque: La solution stock TNT doit être préparée fraîchement, car ce réactif est sensible à l'oxydation de désactivation en solution aqueuse.
5. Pépinette 60 ul de la solution 1 M DTT dans la solution de protéines pour réduire la cyt c. La couleur de la solution passe du rouge foncé au rouge clair lors du mélange.
6. Filtrer la solution de protéine réduite à travers un filtre en PVDF de liaison à seringue de 0,22 um faible en protéines avant l'injection sur tout support chromatographique.
7. Fixer une colonne d'échange de cations de 3,3 ml forte entre la boucle d'injection et d'un détecteur Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Instrument UV-Vis.
8. Équilibrer la colonne avec 3 volumes de colonne d'eau ultra-pure, suivi par 3 volumes de colonne de tampon à pH 7 de phosphate 20 mM, en utilisant un débit de 1 ml / min.
9. Charge 1 ml de brut réduit cyt c dans la boucle d'injection, et commencer une méthode de gradient 328-450 mM de NaCl, plus de 5 volumes de colonne. Surveiller les 280 nm et 410 nm canaux du détecteur UV-Vis, et recueillir le plus grand pic.
10. Augmenter la concentration en sel de 1 M à 2 volumes de colonne pour éluer iso-2 cytochromee c, et après la colonne a été rincée, ré-équilibrer la colonne avec 2 volumes de colonne de 20 mM de tampon phosphate avant d' injecter le prochain aliquote brut.
11. Répétez les étapes 01.09 à 01.10 jusqu'à ce que toute la protéine brute a été purifiée.
12. Réunir les fractions contenant iso-1 et les concentrer en utilisant un 3,5 kDa de poids moléculaire Cutoff (MWCO) filtre rotatif et centrifugation à 3000 x g.
13. Charger la protéine concentrée dans 3,5 kDa MWCO cassettes de dialyse et dialyser contre ultrapure eau pendant la nuit, avec 2 changements d'eau.
14. Déterminer la concentration de la solution de protéine pure, concentrée en prenant 10 pl, diluer à 100 ul avec de l'eau ultra-pure, et en prenant un spectre d'absorbance. Utilisez un faible volume, 100 cuvette de quartz ul pour obtenir les spectres d'absorption des protéines. En règle générale, la concentration en protéine non dilué est de l'ordre de 50 - 100 um.
    1. Utilisez le pic caractéristique 410 nm de cyt c pour quantifier la Concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert avec une valeur d'absorptivité molaire de 97,6 cm ^-1 mM ^-1:
       A = ε × c × ι
       où A est l'absorbance, ε est la capacité d' absorption molaire, c est la concentration en mM et ι est la longueur du trajet de la cuvette ¹³ en cm.
15. À ce stade, il faut diviser la protéine dans 1 ml aliquotes et garder congelé à -20 ° C jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires. Cyt c peut être congelé et décongelé sans perte de structure ou de fonction, mais les cycles répétés commencera à dénaturer la protéine.
    Nota: Les protéines tolèrent le gel à des degrés différents. Par exemple, les protéines fluorescentes vertes ^5,9 doivent pas être congelés, à la place conservés dans un réfrigérateur.

2. Synthèse de Cytochrome c bioconjugués

1. Dissoudre 0,9 mg de ruthénium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) ₂ -maléimide, 0,975 umol, 6 équivalents) dans 600 ul d'acétonitrile.
   Remarque: Si le maléimide utilisé est soluble dans l'eau, préparer une solution mère dans de l'eau au lieu de l'acétonitrile. Il est important que le maléimide soluble dans le tampon de réaction. Le diméthylsulfoxyde, le N, N - diméthylformamide et l' acétonitrile sont tous les adjuvants couramment utilisés pour aider à la dissolution de faible masse moléculaire ^12, souvent des réactifs maléimide hydrophobes.
2. Préparer une solution tampon contenant 100 mM de tampon de phosphate et 100 mM d' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, _M = 292,24 g / mol), qui , lorsqu'elle est diluée à 20 mM est à pH 7. Ajouter de l' hydroxyde de sodium solide jusqu'à ce que l'EDTA soit dissous (plusieurs grammes typiquement ) et ajuster le pH à 7.
3. Dissoudre 2,87 mg de Tris (2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP ^15, M _w = 286,65 g / mol) dans 1 ml d'eau ultrapure pour préparer une solution mère 10 mM. Cette étape est l'importationant d'assurer que la cystéine sur la protéine est complètement réduite avant le couplage ¹⁵ maléimide.
   Note: La solution stock PTCE doit être préparée fraîchement pour chaque réaction, que ce réactif est sensible à la désactivation par oxydation en solution aqueuse.
4. Combinez 11,4 ml d'eau ultrapure avec 3 ml de phosphate mM / EDTA solution mère 100 dans un tube en plastique de 50 ml. Lorsqu'elle est diluée davantage avec des solutions de protéines et de stocks maléimide la concentration du tampon est de 20 mM.
   Remarque: Si la protéine étant marqué est une protéine transmembranaire, en sorte qu'un détergent approprié est ajouté au tampon pour solubiliser la protéine. Si un détergent ne sert pas la protéine membranaire peut précipiter lentement, ce qui aura un impact négatif sur les rendements de la réaction. Utiliser le détergent dans toutes les étapes de purification ultérieures.
5. Ajouter de 0,15 pmol (3 ml d'une solution à 50 um, 1 équivalent) de purifié cyt c dans le tampon phosphate-EDTA.
6. Ajouter 7,5 ul du PTCE Stock solution (0,075 mol, 0,5 équivalent) à la solution de protéine et laisser sous agitation pendant 5 min pour réduire toute protéine qui peut avoir dimérisé due à l'oxydation de la cystéine.
   Remarque: Ne pas ajouter PTCE si la protéine d'intérêt ne dimériser pas facilement. Vérifier en exécutant un gel de protéine dans des conditions non réductrices.
7. Ajouter 600 ul de la solution dans l'acétonitrile de Ru (II) (tpa) ₂ -maléimide à la solution tamponnée réduite de cyt c et laisser l'agitation du mélange réactionnel, dans l'obscurité, à température ambiante, pendant 24 heures.
8. Concentrer le mélange de réaction en utilisant 3,5 filtres de spin kDa MWCO, centrifuger à 3000 xg, répéter 2-3 fois avec des produits frais 20 mM de tampon phosphate jusqu'à ce que le filtrat soit claire. Enlever autant maléimide qui n'a pas réagi à partir du mélange réactionnel que possible avant l'étape suivante de purification.
   Remarque: À ce stade, le mélange de bioconjugaison brut peut être conservé au réfrigérateur, dans l'obscurité. Il est important d'enlever n'a pas réagi colorant maléimide par centrifuge dialyse avant stockage maléimide peut lentement et de façon non spécifique réagir avec des résidus de lysine sur la surface de la protéine.

3. Purification du cytochrome c bioconjugués

1. Dissoudre 2,4 g de dihydrogénophosphate de sodium et 29,22 g de chlorure de sodium dans 1 L d'eau ultra pure pour préparer une solution tampon contenant 20 mM de NaH ₂ PO ₄ et 0,5 M de NaCl. Ceci est le tampon en cours d'exécution pour la purification Chromatographie métal affinité immobilisé (IMAC).
2. Dissoudre 17 g d'imidazole _(Mw = 68,077 g ^-1 mol) dans 500 ml de 20 mM de NaH ₂ PO ₄ et du tampon 0,5 M de NaCl. Ceci est le tampon d'élution pour la purification IMAC.
3. Ajuster le pH des deux tampons à pH 7 en utilisant du NaOH 1 M ou du HCl, et les filtrer à travers des membranes de 0,22 um de cellulose régénérée avant son utilisation dans la FPLC.
4. Comme les colonnes IMAC achetés sont expédiés sans ions métalliques chargés sur le collonne, préparer la colonne pour une purification à base de Ni ²⁺ par lavage de la colonne avec 3 ml d'eau ultrapure, 3 ml d' une solution d'acétate de nickel 100 mM et 6 ml d'eau ultrapure. Si la colonne ne doit pas être utilisé immédiatement par lavage 3 ml d'éthanol à 20% et de stocker la colonne dans le réfrigérateur pour empêcher la croissance bactérienne.
5. Joindre un Ni ²⁺ 1 ml colonne chargé en IMAC le FPLC entre la boucle d'injection et détecteur UV-Vis.
6. Équilibrer la colonne avec 3 volumes de colonne de phosphate 20 mM, tampon de NaCl 0,5 M en utilisant un débit de 0,5 ml / min.
7. Charge 100 ul de mélange réactionnel brut (filtré à travers un filtre à seringue de 0,22 um) sur la colonne Ni ²⁺ IMAC. Laver la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon courante pour éluer qui n'a pas réagi cyt c, suivie d'un gradient d'imidazole 0 à 125 mM , plus de 3 volumes de colonne pour éluer le ruthénium bisterpyridine cytochrome c bioconjugué (Ru (II) -cyt c) .
8. Laver le cOLONNE avec 250 mM de tampon imidazole pour 5 volumes de colonne, puis ré-équilibrer la colonne avec du phosphate 20 mM, NaCl 0,5 M et répétez l'étape 3.7 jusqu'à ce que tout le bioconjugué brut a été purifié.
9. Réunir les fractions de bioconjugués et les concentrer en utilisant une kDa MWCO filtre 3,5 spin, centrifugation à 3000 x g.
10. Chargez le bioconjugué concentré dans 3,5 kDa MWCO cassettes de dialyse et dialyser contre ultrapure eau pendant la nuit, avec 2 changements d'eau.
11. Déterminer la concentration de la solution pure bioconjugué concentrée par UV-Vis, en utilisant la même valeur d'absorptivité molaire que l' iso-1 cytochrome c (97,6 mM ^-1 cm ^-1) à 410 nm. En règle générale, la concentration en bioconjugué est de l'ordre de 50 - 100 um.
12. Diviser le bioconjugué en 25 aliquotes et garder congelé à -20 ° C jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.

4. Caractérisation du cytochrome c bioconjugués

1. Dissuadermination de la masse bioconjugué par MALDI-TOF
   1. Dissoudre 10 mg d'acide caféique dans 1 ml d'une solution / d'eau / acide trifluoroacétique dans l'acétonitrile (80: 20: 0,1 v / v / v).
   2. Diluer 5 pi de solution concentrée de protéine avec 5 ul d'une solution d'acide caféique.
   3. Coin 0,5 ul d'une solution d'acide caféique sur la plaque cible MALDI et laisser la solution sécher.
   4. Spot 0,5 ul de la solution échantillon / matrice sur le dessus de cet endroit de l'acide caféique, laisser place à sécher. Repérez un autre 0,5 pi de matrice de l'échantillon au-dessus de cela "sandwich" l'échantillon entre les couches de la matrice, et laisser sécher.
   5. Acquérir des spectres de masse en mode linéaire en utilisant les paramètres appropriés de l' instrument pour les protéines ^16.
2. Etude de bioconjugués par électrophorèse sur gel
   1. Préparer 10 pi de chaque échantillon de protéine à exécuter par dilution d'échantillons de protéines avec du sulfate dodécylique prémélangée de lithium (LDS, pH 8,4) tampon (4x) toa concentration finale d'environ 20 pg par puits. Pour les puits qui nécessitent des conditions de réduction, ajouter 1 pl de dithiothréitol 500 mM (DTT) Agent (10x) réduire.
   2. Des échantillons de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min.
   3. Ajouter 50 ml de pré-mélangé 1 M MES, une base M de Tris, 2% de SDS, EDTA 20 mM (pH 7,7) fonctionnant mélange tampon (20x) à partir d'une source commerciale de 950 ml d'eau ultra pure pour préparer le tampon de gel en cours d'exécution.
   4. Retirez le peigne en plastique à partir du gel et placer le gel dans le réservoir de gel de roulement. Remplir le réservoir avec un tampon de gel de roulement de sorte que les puits sont recouverts avec un tampon.
   5. Charger les échantillons soigneusement sur un préfabriqué de 12% Bis-Tris, 1 mm, gel à 10 puits en utilisant des embouts de pipette longues pour aider au chargement. Chargez le précolorés 10 protéine marqueur de poids moléculaire (3-188 kDa) dans un puits milieu du gel pour faciliter l'analyse.
   6. Exécutez le gel à 200 V tension constante pendant 35 min.
   7. Colorer le gel avec une solution bleue commerciale Coomassie pendant 2 heures, et laver avec ultrapeau ure pendant 48 heures.
3. Détermination de la pureté de bioconjugués par spectroscopie UV-Vis
   1. Préparer 120 ul de solution 5 uM de Ru (II) (tpa) -maléimide _2, l' iso-1 cyt c et Ru (II) c -cyt.
   2. Mesurer le spectre de la cuvette en quartz contenant de l'eau ultra-pure uniquement de référence, de 250 nm à 650 nm.
   3. Mesurer le spectre de chaque composant, assurant la cuve est rincée et séchée entre chaque mesure.
   4. Tracer l'absorbance de chaque composant en fonction de la longueur d' onde, et comparer la somme linéaire des matériaux de départ avec le produit final afin de déterminer si un rapport 1: 1 de Ru (II) (tpa) ₂ -maléimide à cyt c a réagi.

Résultats

La synthèse de bioconjugués est confirmée par trois méthodes principales: Matrix Assisted Laser Désorption Ionisation spectromètre de masse à temps de vol (MALDI-TOF), l' électrophorèse sur gel de polyacrylamide et ultraviolet-visible par spectroscopie (UV-Vis), comme représenté sur les figures 2, 3 et 4. Une augmentation de la masse correspondant à la masse de la petite molécule jointe et l'absence d'une protéine qui n'a pa...

Discussion

Purification des matières premières avant une bioconjugaison est d'une importance capitale. Les protéines obtenues à partir de sources recombinantes du commerce contiennent souvent d'autres isoformes de la protéine d'intérêt, qui peut avoir différentes chimie de surface et de la réactivité. Par exemple, dans la bioconjugaison décrit, la cyt disponible dans le commerce c contient un mélange des deux iso-1 et iso-2 cyt c ^12,14,17. Iso-2 et l' iso-1 forme de cytochro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 mL strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 mL IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	extremely corrosive! Use caution
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette