Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

Резюме

Этот протокол подробно описываются важные шаги, необходимые для биоконъюгации цистеина, содержащего белок малеимид, в том числе очистки реагентов, условий реакции, очистки Bioconjugate и Bioconjugate характеристики.

Аннотация

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Введение

Биоконъюгации включает ковалентного связывания одного биомолекул с другим или с синтетической молекулой, такой как краситель, лекарственного средства или полимера. Методы биоконъюгации белка в настоящее время широко используется во многих химии, биологии и нанотехнологических исследовательских групп с приложениями , начиная от маркировки флуоресцентного красителя ^1,2, что делает белок (антитела) -prodrugs ³ (антитела наркотиков конъюгатов - АСДУ) синтез белковых димеров ^4,5 , вплоть до самосборки белково-полимерных гибридов , используемых в ^6,7 наномедицинскими ⁸ и ⁹ систем химии.

Специфичность химии используется для биоконъюгации, в то время как не всегда критично, имеет огромное значение для большинства функциональных белковых биоконъюгатов, с тем, чтобы не мешать активным сайтом белка-мишени. Идеальная реакция биоконъюгации необходимо выполнить несколько критериев, в том числе: I), ориентированных на редких или уникальных сайтов интересующего белка,б) быть селективным к этой цели, III) протекают в неденатурирующих условиях, чтобы избежать разворачивания белка и IV) быть высокоурожайных, как белок-мишень, как правило, доступны только на суб-миллимолярной концентрации. Малеимидная - цистеин Михаэлю приближается к выполнению всех этих критериев, и имеет по этой причине долгое время утверждал , особый статус в области химии Bioconjugate ^10. Это происходит потому, что я) многие белки, содержащие только один остаток цистеина на их поверхности могут быть методами генной инженерии там, II) при правильном рН реакция имеет высокую селективность по отношению к цистеина, III) она протекает гладко в водных буферах и IV) он очень быстро со второй константой скорости порядка малеимидам в цистеин-содержащих белков , о которых превышает 5000 м ^-1 с ^-1 в некоторых случаях ^11. При условии , что интерес белок может выдержать небольшое (≈ 5-10%) количество органического сорастворителя ^12, почти любой малеимид-функционализированного красителя, роищейка, поверхность или другой белок, может быть связан с белками. Кроме того, малеинимидов более специфичны для цистеина на белках, чем iodoacetamides, которые более склонны к взаимодействию с другими нуклеофилами при повышенном значении рН; и более стабильны , чем на основе дисульфида конъюгации , которые должны храниться при кислом рН , чтобы предотвратить дисульфидный обмен ^13.

Мы сообщаем обобщенный протокол сопряжения малеимид-функционализированного молекул с белком , содержащим единственный остаток цистеина с использованием реакции между Ru (II) основе хромофора и редокс - белка цитохрома С в качестве примера. Этот протокол в равной степени применима и к большинству других белков, содержащих доступный остаток цистеина поверхность и соответствующую малеимидную функционализованных мишень, будь то другой белок, флуоресцентный краситель, хромофор или синтетический полимер.

протокол

Примечание: Следующий протокол предназначен для синтеза биоконъюгата белок-краситель , как показано на рисунке 1 Это общий протокол для реакции малеимид со свободной поверхностью на цистеин , содержащие белки, с примечаниями , вставленный , где это применимо , чтобы помочь с мембранным белком. Биоконъюгаты, белково-полимерные Биоконъюгаты и синтетические димер белка (белок-белок) Биоконъюгаты. В данном конкретном случае белок изо-1 цитохром С имеет один остаток цистеина поверхности , доступной для реакции , которая позволяет происходить высокоспецифичный маркировка. Если белок, представляющий интерес имеет несколько остатков цистеина, тот же протокол применяется, хотя и с потерей специфичности и однородности продукта. Химия нацеливание остатков поверхности лизина, с использованием N -hydroxysuccinimidyl эфиров или изотиоцианаты, может быть более простым подходом , если специфичность не требуется.

Рисунок 1. биоконъюгации Схема реакции. В качестве примера случай, легкий заготовки, рутений на основе молекулы антенны будет приложена к цитохрома с помощью Микаэля подвесной малеимид на основе рутени молекулы антенны и остатком цистеина воздействию (CYS102) на белке. Красная площадь цит гр поверхности указывает на группу гема. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Очистка цитохром С

Примечание: Этот шаг не применяется для всех белков. Тем не менее, важно знать , что белок , полученный из коммерческого поставщика может содержать другие нежелательные изоформы белка , которые , возможно , должны быть удалены путем дальнейшей очистки ^13.

1. Растворить 2,4 г дигидрофосфата натрия (M _W = 120 г моль ^-1) в 1 л сверхчистой воды в прepare буферный раствор , содержащий 20 мМ NaH ₂ PO _4. Доводят рН с помощью 1 М NaOH до рН 7.
   Примечание: фосфатные буферы, используемые в данном протоколе следует готовить непосредственно на ежедневной основе, и фильтруют через мембранный фильтр с размером 0,2 мкм целлюлозы перед использованием.
2. Растворить 29,22 г хлорида натрия (M _W = 58,44 г моль ^-1) в 500 мл 20 мМ NaH ₂ PO ₄ буфера , чтобы сделать 20 мМ NaH ₂ PO ₄ и 1 М NaCl буфера. Это элюции буфер для очистки на стадии 1.6).
3. Растворить 12,0 мг лиофилизированного цитохрома с (цит с) в 6 мл с рН 7 20 мМ фосфатном буфере.
4. Отдельно растворить 14,7 мг дитиотреитола (DTT, M _W = 154,25 г / моль) в 95,3 мкл сверхчистой воды с получением раствора 1 М маточного раствора.
   Примечание: Исходный раствор ДТТ должен быть подготовлен свеже, поскольку этот реагент чувствителен к окислительной дезактивацию в водном растворе.
5. зернышкоEtte 60 мкл 1 М раствора DTT в раствор белка , чтобы уменьшить цитохром с. Цвет раствора изменяется от темно-красного до светло-красного при смешивании.
6. Фильтр восстановленного белкового раствора через фильтр шприца связывания PVDF 0,22 мкм с низким содержанием белка перед инъекцией на любой хроматографических сред.
7. Приложить 3,3 мл сильной катионообменной колонке между петлей впрыска и UV-VIS детектором быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) инструмента.
8. Равновесие колонку с 3 объемами колонки сверхчистой воды, а затем 3 объемами колонки 20 мМ рН 7 фосфатным буфером, с использованием скорости потока 1 мл / мин.
9. Нагрузка 1 мл восстановленного неочищенного цит С в цикле впрыска и начать метод градиента от 328 - 450 мМ NaCl, более 5 объемами колонки. Монитор 280 нм и 410 нм каналы с UV-VIS детектора, и собрать большой пик.
10. Увеличение концентрации соли до 1 М на 2 объемами колонки для вымывания изо-2 цитохроме С, а после того, как колонна продувают, повторно уравновешивают колонку с 2 объемами колонки 20 мМ фосфатного буфера перед инъекцией следующего сырой аликвоты.
11. Повторите шаги 1.9-1.10, пока весь сырой белок не был очищен.
12. Объединяют изо-1, содержащие фракции и концентрировали их с использованием 3,5 кДа отсекающей молекулярную массу (MWCO) спиновый фильтр и центрифугирование при 3000 г.
13. Загрузите концентрированный белок в 3,5 кДа MWCO диализных кассетах и ​​диализ против сверхчистой воды в течение ночи, с 2-мя переменами воды.
14. Определить концентрацию чистого, концентрированного белкового раствора путем принимать 10 мкл, разбавляя его до 100 мкл сверхчистой воды, и принимая спектр поглощения. Использование низкого объема, 100 мкл кварцевую кювету для получения спектров поглощения белка. Как правило, в чистом виде концентрация белка составляет порядка 50 - 100 мкМ.
    1. Используйте характерный 410 нм пик цит C для количественного определения concentratioп , используя закон Ламберта-Бера с молярным значением поглощательной 97,6 см ^-1 мМ ^-1:
       A = ε × C × ι
       где А обозначает оптическую плотность, ε является молярный коэффициент поглощения, с представляет собой концентрацию в мМ, а ι длина пути кюветы в см ^13.
15. В этот момент, разделить белок на аликвоты по 1 мл и хранить замороженной при -20 ° С, пока они не потребуются. Цитохром с можно замораживать и оттаивать без потери структуры или функции, но повторные циклы начнут денатурации белка.
    Примечание: Белки переносит заморозков в разной степени. Например, зеленые флуоресцирующие белки не должны ^5,9 замерзнуть, вместо того, чтобы хранить в холодильнике.

2. Синтез цитохром с биоконъюгатов

1. Растворить 0,9 мг рутений (II), bisterpyridine maleimиде (Ru (II) , (тонн в год) ₂ малеимид, 0,975 мкмоль, 6 эквивалентов) в 600 мкл ацетонитрила.
   Примечание: Если используется малеимид растворим в воде, приготовить исходный раствор в воде вместо ацетонитрила. Важно, малеимид, чтобы быть растворимым в реакционном буфере. Диметилсульфоксид, N, N - диметилформамид, ацетонитрил и все обычно используются вспомогательные вещества для оказания помощи в растворении низкой молекулярной массой ^12, часто гидрофобных малеимид реагентов.
2. Приготовьте буферный раствор , содержащий 100 мМ фосфатного буфера и 100 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, М _W = 292,24 г / моль), которые при разбавлении до 20 мм при рН 7. Добавляют твердый гидроксид натрия до тех пор , ЭДТА не растворяется (несколько граммов , как правило , ) и доведения рН до 7.
3. Растворить 2,87 мг натриевой соли трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР гидрохлорид ^15, M _W = 286,65 г / моль) в 1 мл сверхчистой воды для приготовления 10 мМ маточного раствора. Этот шаг импортамуравей , чтобы гарантировать , что цистеин на белок полностью уменьшен до имидом малеиновой муфты ^15.
   Примечание: Исходный раствор ТСЕР следует готовить непосредственно для каждой реакции, поскольку этот реагент чувствителен к окислительной дезактивацию в водном растворе.
4. Смешайте 11,4 мл сверхчистой воды с 3 мл 100 мМ фосфатного / ЭДТА маточного раствора в 50 мл пластиковую пробирку. При разбавлении в дальнейшем с белковыми и малеимид маточных растворов, концентрация буфера будет 20 мМ.
   Примечание: Если белок клеймо представляет собой трансмембранный белок, убедитесь, что подходящего моющего средства добавляется в буфер для солюбилизации белка. Если моющее средство не используется мембранный белок, может медленно осаждаются, которая будет отрицательно воздействовать выходов реакции. Используйте моющее средство во всех последующих стадиях очистки.
5. Добавить 0,15 мкмоль (3 мл 50 мкМ раствора, 1 эквивалент) очищенного цит С в фосфатном буфере с ЭДТА.
6. Добавить 7,5 мкл акций Solut TCEPион (0,075 мкмоль, 0,5 эквивалента) к раствору белка и оставляют при перемешивании в течение 5 мин, чтобы уменьшить любой белок, который может быть димеризованный из-за окисления цистеина.
   Примечание: Не добавляйте TCEP если интерес белок не димеризуются легко. Проверьте это, запустив гель белка в невосстанавливающих условиях.
7. Добавьте 600 мкл ацетонитрила раствор Ru (II) ₍₂₎ тонн в год малеимид к уменьшенному, забуференного раствора цит с, и оставить перемешивание реакционной смеси, в ​​темноте, при комнатной температуре, в течение 24 часов.
8. Реакционную смесь концентрировали с использованием 3,5 спиновых фильтров кД MWCO, центрифугирование при 3000 XG, повторив 2-3 раза свежей 20 мМ фосфатным буфером до тех пор, пока фильтрат не станет прозрачной. Удалить столько непрореагировавший малеимид из реакционной смеси, как это возможно, до следующей стадии очистки.
   Примечание: На этом этапе биоконъюгации смесь сырой можно хранить в холодильнике, в темноте. Важно, чтобы удалить непрореагировавший малеимидную красителя CENTRifuge диализа перед хранением, как малеимид может медленно и неспецифически реагируют с остатками лизина на поверхности белка.

3. Очистка цитохром с биоконъюгатов

1. Растворить 2,4 г дигидрофосфата натрия и 29,22 г хлорида натрия в 1 л сверхчистой воды для приготовления буферного раствора , содержащего 20 мМ NaH ₂ PO ₄ и 0,5 М NaCl. Это работает буфер для очистки иммобилизованных металл-аффинной хроматографии (IMAC).
2. Растворить 17 г имидазола (M _W = 68,077 г моль ^-1) в 500 мл 20 мМ NaH ₂ PO ₄ и 0,5 М NaCl буфером. Это элюции буфер для очистки IMAC.
3. Доводят рН обоих буферов до рН 7 с помощью 1 М NaOH или HCl, и фильтровать их через 0,22 мкм регенерированных целлюлозных мембран перед использованием в FPLC.
4. Поскольку столбцы IMAC приобретенные поставляются без каких-либо металлических ионов, погруженных на седловинеитп, подготовить колонку для очистки -На Ni ²⁺ путем промывки колонки 3 мл сверхчистой воды, 3 мл раствора 100 мМ ацетата никеля, и 6 мл сверхчистой воды. Если столбец не будет использоваться сразу промыть через 3 мл 20% -ного этанола и хранят колонку в холодильнике, чтобы предотвратить рост бактерий.
5. Прикрепление Ni ²⁺ -loaded 1 мл колонку IMAC к FPLC между петлей впрыска и UV-VIS детектора.
6. Равновесие колонку с 3 объемами колонки 20 мМ фосфата, 0,5 М NaCl буфером при скорости потока 0,5 мл / мин.
7. Нагрузка 100 мкл сырой реакционной смеси (фильтровали через шприцевой фильтр 0,22 мкм) на колонке Ni ²⁺ IMAC. Промыть колонку с 3 объемами колонки рабочего буфера для элюции непрореагировавших CYT С с последующим имидазола градиентом от 0 до 125 мМ в течение 3 объемами колонки для элюирования рутений bisterpyridine-цитохром с Bioconjugate (Ru (II) -cyt с) ,
8. Вымойте грolumn с 250 мМ имидазола буфере в течение 5 объемами колонки, а затем повторно уравновешивают колонку с 20 мМ фосфата, 0,5 М NaCl и повторите шаг 3,7, пока весь сырой Bioconjugate не был очищен.
9. Бассейн биоконъюгата фракции и концентрировали их с помощью 3,5 кДа MWCO спиновый фильтр, центрифугирование при 3000 г.
10. Загрузите концентрированный биоконъюгата в 3,5 кДа MWCO диализных кассетах и ​​диализ против сверхчистой воды в течение ночи, с 2-мя переменами воды.
11. Определить концентрацию чистого, концентрированного раствора Bioconjugate по UV-VIS, с использованием той же молярной значения поглощательной способности, как изо-1 цитохрома С (97,6 мМ ^-1 см ^-1) при 410 нм. Как правило, концентрация Bioconjugate составляет порядка 50 - 100 мкМ.
12. Разделить биоконъюгата в 25 мкл аликвоты и хранить замороженной при -20 ° С, пока они не потребуются.

4. Характеристика цитохром с биоконъюгатов

1. отпугиватьmination из Bioconjugate массы с помощью MALDI-TOF MS
   1. Растворите 10 мг кофейной кислоты в 1 мл раствора ацетонитрил / вода / трифторуксусная кислота (80: 20: 0,1, об / об / об).
   2. Развести 5 мкл концентрированного белкового раствора с 5 мкл раствора кофейной кислоты.
   3. Пятно 0,5 мкл раствора кофейной кислоты на MALDI мишени пластины и дайте раствору высохнуть.
   4. Пятно 0,5 мкл образца / матричного раствора на вершине этого пятна кофейной кислоты, позволяют пятно высохнуть. Пятно еще 0,5 мкл матрицы образца на вершине этого к «сэндвич» образца между слоями матрицы, и дайте высохнуть.
   5. Приобретать масс - спектров в линейном режиме , используя подходящие настройки прибора для белков ^16.
2. Исследование биоконъюгатов с помощью гель - электрофореза
   1. Готовят по 10 мкл каждого образца белка для запуска путем разбавления образцов белка с помощью сульфата предварительно смешан лития додецилсульфата (LDS, рН 8,4) буфера (4x) тгабаритная конечной концентрации приблизительно 20 мкг на лунку. Для скважин, требующих восстановительных условий, добавляют 1 мкл 500 мМ дитиотреитола (DTT) восстановителя (10x).
   2. Образцы тепла при температуре 70 ° С в течение 10 мин.
   3. Добавляют 50 мл предварительно смешанного с 1 М MES, 1 М Трис-основание, 2% SDS, 20 мМ ЭДТА (рН 7,7) работает буферной смеси (20х) из коммерческого источника до 950 мл сверхчистой воды для приготовления буфера гель работает.
   4. Удалите пластиковую гребенку из геля и поместите гель в гель проточной баке. Заполнить бак с гелем проточной буфера, так что лунки покрыты буфером.
   5. Загружают образцы тщательно сборного на 12% Bis-Tris, 1 мм, 10-а гель с использованием длинных наконечников для оказания помощи в погрузке. Загрузите предварительно окрашенный 10 белка маркер молекулярной массы (3-188 кДа) в среднюю лунку геля для облегчения анализа.
   6. Запустите гель при 200 В постоянного напряжения в течение 35 мин.
   7. Пятно гель с коммерческим синий раствор кумасси в течение 2 ч и промывают ultrapЮр воды в течение 48 часов.
3. Определение чистоты Bioconjugate с помощью UV-VIS - спектроскопии
   1. Подготовьте 120 мкл 5 мкМ растворов Ru (II) (т в год) ₂ малеимид, изо-1 цит C, и Ru (II) -cyt с.
   2. Измеряют базовый спектр кварцевой кювете, содержащей только сверхчистой воды, от 250 нм до 650 нм.
   3. Измерьте спектр каждого компонента, обеспечивая кювета промывают и сушат между каждым измерением.
   4. Участок абсорбцию каждого компонента в зависимости от длины волны, и сравнить линейную сумму исходных материалов , с конечным продуктом , чтобы определить , есть ли в соотношении 1: 1 из Ru (II) ₍₂₎ тонн в год малеимид к цит C прореагировал.

Результаты

Синтез биоконъюгатов подтверждается тремя основными способами: Matrix-лазерной десорбцией ионизацией времени пролета масс - спектрометрии (MALDI-TOF - MS), электрофорез в полиакриламидном геле, и видимой области ультрафиолетового (УФ-видимой) спектроскопии, как показано на

Обсуждение

Очистка исходных материалов до того, как биоконъюгации имеет первостепенное значение. Белки, полученные из коммерческих рекомбинантных источников часто содержат другие изоформы белка, представляющего интерес, который может иметь различную химию поверхности и реакционной способнос?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 mL strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 mL IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	extremely corrosive! Use caution
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette