Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

Resumen

Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado.

Resumen

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Introducción

La bioconjugación implica la unión covalente de una biomolécula con otra o con una molécula sintética, tal como un tinte, fármaco o un polímero. Métodos bioconjugation proteína ahora se utilizan ampliamente en muchos grupos de investigación química, biología y nanotecnología con aplicaciones que van desde el etiquetado colorante fluorescente ^1,2, haciendo de proteína (anticuerpo) -prodrugs ³ (conjugados de fármaco anticuerpo - ADC) síntesis de dímeros de proteína ^{de 4,5} , a través de los híbridos de proteína-polímero auto-montaje de ^6,7 utilizadas en nanomedicina ⁸ y ⁹ sistemas de la química.

La especificidad de la química utilizada para bioconjugation, aunque no siempre crítico, es de suma importancia para bioconjugados proteína más funcionales, a fin de no interferir con el sitio activo de la proteína diana. La reacción bioconjugation ideales necesita cumplir varios criterios, incluyendo: i) dirigidas a sitios raros o únicos en la proteína de interés,ii) ser selectiva hacia este objetivo, iii) proceda en condiciones no desnaturalizantes para evitar desplegamiento de la proteína y iv) ser de alto rendimiento como la proteína diana es por lo general sólo está disponible a una concentración sub-milimolar. La maleimida - cisteína adición de Michael se acerca a cumplir con todos estos criterios, y tiene por ello reclamó durante mucho tiempo un estatus especial en el campo de la química de bioconjugados ^10. Esto se debe a que i) muchas proteínas que contienen residuos sólo una cisteína en su superficie pueden ser modificadas por ingeniería genética allí, ii) en el pH correcto de la reacción es altamente selectiva hacia cisteína, iii) se produce más fácilmente en tampones acuosos y iv) es muy rápido con la segunda constante de velocidad orden de maleimidas a las proteínas que contienen cisteína reportados exceda de 5.000 M ^-1 s ^-1 en algunos casos ^11. Siempre que la proteína de interés puede tolerar una cantidad pequeña (≈ 5-10%) de co-disolvente orgánico ^12, casi cualquier colorante de maleimida-funcionalizado, poLymer, superficie u otra proteína puede estar ligada a las proteínas. Además, maleimidas son más específicos para las cisteínas en proteínas que yodoacetamidas, que son más propensos a reaccionar con otros nucleófilos a pH elevado; y más estable que conjugaciones a base de disulfuro que deben mantenerse a un pH ácido para impedir el intercambio de disulfuro de ^13.

Aquí se presenta un protocolo genérico para la conjugación de moléculas de maleimida-funcionalizado para una proteína que contiene un único residuo de cisteína mediante la reacción entre un cromóforo Ru basado en (II) y la proteína citocromo c redox como un ejemplo. Este protocolo es igualmente aplicable a la mayoría de otras proteínas que contienen un residuo de cisteína superficie accesible y el objetivo maleimida-funcionalizado correspondiente, ya sea otra proteína, un colorante fluorescente, un cromóforo o un polímero sintético.

Protocolo

Nota: El siguiente protocolo está diseñado para la síntesis de un bioconjugado de proteína-colorante como se muestra en la Figura 1 Se trata de un protocolo general para la reacción de una maleimida con las proteínas de cisteína superficie libre que contienen, con notas insertan en su caso para ayudar con la proteína de la membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, y dímero de proteínas sintéticas (proteína-proteína) bioconjugados. En este caso particular, la proteína de iso-1 citocromo c tiene un residuo de cisteína de superficie disponible para reaccionar que permite un etiquetado altamente específico que se produzca. Si una proteína de interés tiene múltiples residuos de cisteína, se aplica el mismo protocolo, aunque con la pérdida de la especificidad y la homogeneidad del producto. Química de orientación residuos de lisina superficie, usando N -hydroxysuccinimidyl ésteres o isotiocianatos, pueden ser un enfoque más simple si no se requiere la especificidad.

Figura 1. Esquema de Reacción bioconjugación. Como un caso ejemplo, un captador de luz, molécula de antena basado en rutenio se adjuntará al citocromo c a través de adición de Michael de una maleimida colgante en la molécula de la antena a base de rutenio y un residuo de cisteína expuesta (CYS102) en la proteína. El área roja de la superficie cyt c indica el grupo hemo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Purificación de citocromo c

Nota: Este paso no es aplicable a todas las proteínas. Sin embargo, es importante saber que una proteína obtenida de un proveedor comercial puede contener otras isoformas de proteínas no deseadas, que pueden necesitar ser eliminado por purificación adicional ^13.

1. Disolver 2,4 g de dihidrogenofosfato de sodio (M _w = 120 g mol ^-1) en 1 L de agua ultrapura a prepare una solución tampón que contiene 20 mM NaH ₂ PO _4. Se ajusta el pH con NaOH 1 M a pH 7.
   Nota: Los tampones de fosfato utilizados en este protocolo deben prepararse recientemente sobre una base diaria, y se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,2 micras de celulosa antes de su uso.
2. Disolver 29,22 g de cloruro de sodio (M _w = 58,44 g mol ^-1) en 500 ml de la NaH ₂ PO ₄ 20 mM tampón para hacer una mM NaH ₂ PO ₄ 20 y tampón M NaCl 1. Este es el tampón de elución para la purificación en el paso 1.6).
3. Disolver 12,0 mg de liofilizado citocromo c (cyt c) en 6 ml de pH 7 20 mM de tampón de fosfato.
4. Por separado se disuelven 14,7 mg de ditiotreitol (DTT, M _w = 154,25 g / mol) en 95,3 l de agua ultrapura para preparar una solución madre 1 M.
   Nota: La solución de TDT Debe prepararse, ya que este reactivo es susceptible a la desactivación oxidativa en solución acuosa.
5. Pepitaette 60 l de la solución 1 M de DTT en la solución de proteína para reducir el cyt c. El color de la solución cambia de color rojo oscuro a rojo claro tras la mezcla.
6. Se filtra la solución de proteína reducida a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,22 micras de unión baja en proteínas antes de inyectar en cualquier medio cromatográfico.
7. Adjuntar una columna de intercambio catiónico 3,3 ml fuerte entre el bucle de inyección y detector de UV-Vis de un instrumento de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC).
8. Equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna de agua ultrapura, seguidos por 3 volúmenes de columna de pH 7 tampón fosfato 20 mM, utilizando una velocidad de flujo de 1 ml / min.
9. Cargar 1 ml de crudo reducido cyt c en el circuito de inyección, y comenzar un método de gradiente desde 328 - 450 mM de NaCl, en 5 volúmenes de columna. Monitorear los canales de 280 nm y 410 nm del detector de UV-Vis, y recoger el pico más grande.
10. Aumentar la concentración de sal de 1 M de 2 volúmenes de columna para eluir iso-2 citocromoe c, y después de la columna ha sido lavado, re-equilibrar la columna con 2 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM antes de la inyección de la siguiente parte alícuota crudo.
11. Repita los pasos del 01/09 a 01/10 hasta que toda la proteína cruda se ha purificado.
12. Se combinan las fracciones que contienen iso-1 y concentrarlos usando un (MWCO) filtro giratorio 3.5 kDa de peso molecular de corte y centrifugación a 3.000 x g.
13. Cargar la proteína concentrada en casetes de diálisis de 3,5 kDa MWCO y dializar contra ultrapura agua durante la noche, con 2 cambios de agua.
14. Determinar la concentración de la solución de proteína pura, se concentró mediante la adopción de 10 l, diluir a 100 l con agua ultrapura, y teniendo un espectro de absorbancia. Use un volumen bajo, 100 l cubeta de cuarzo para obtener espectros de absorción de proteínas. Típicamente, la concentración de proteína sin diluir es del orden de 50 - 100 mM.
    1. Utilice la característica pico de 410 nm de cyt c para cuantificar el concentration utilizando la ley de Beer-Lambert con un valor de absortividad molar de 97,6 ^cm-1 mM ^-1:
       A = ε × c × ι
       donde A es la absorbancia, ε es la absortividad molar, c es la concentración en mM, y ι es la longitud de la trayectoria de la cubeta en cm ^13.
15. En este punto, se divide la proteína en alícuotas de 1 ml y mantener congelada a -20 ° C hasta que se necesiten. Cyt c puede congelarse y descongelarse sin pérdida de estructura o función, pero los ciclos de repetición comenzará a desnaturalizar la proteína.
    Nota: Las proteínas resiste heladas en diferentes grados. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes verdes ^5,9 no debe congelarse, ahora almacenadas en un refrigerador.

2. Síntesis de citocromo c bioconjugados

1. Disolver 0,9 mg de rutenio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) ₂ maleimida, 0,975 mmol, 6 equivalentes) en 600 l de acetonitrilo.
   Nota: Si la maleimida utilizado es soluble en agua, preparar una solución madre en agua en lugar de acetonitrilo. Es importante para la maleimida a ser soluble en el tampón de reacción. Dimetilsulfóxido, N, N-dimetilformamida, acetonitrilo y se utilizan todos comúnmente adyuvantes para ayudar en la disolución de bajo peso molecular ^12, a menudo los reactivos de maleimida hidrófobos.
2. Preparar una solución tampón que contiene tampón fosfato 100 mM y 100 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, M _w = 292,24 g / mol), que cuando se diluye a 20 mM está en pH 7. Añadir hidróxido de sodio sólido hasta que se disuelva el EDTA (varios gramos típicamente ) y ajustar el pH a 7.
3. Disolver 2,87 mg de Tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP ^15, M _w = 286,65 g / mol) en 1 ml de agua ultrapura para preparar una solución madre 10 mM. Este paso es la importaciónhormiga para asegurar que la cisteína en la proteína está totalmente reduce antes de maleimida de acoplamiento ^15.
   Nota: La solución de TCEP Debe prepararse para cada reacción, ya que este reactivo es susceptible a la desactivación oxidativa en solución acuosa.
4. Combinar 11,4 ml de agua ultrapura con 3 ml de solución de fosfato / EDTA de stock 100 mM en un tubo de plástico de 50 ml. Cuando se diluye aún más con las soluciones de proteínas y de existencias de maleimida la concentración del tampón será de 20 mM.
   Nota: Si la proteína de ser etiquetado es una proteína transmembrana, asegurar que un detergente adecuado se añade a la memoria intermedia para solubilizar la proteína. Si no se usa un detergente la proteína de membrana puede precipitar lentamente, lo que afectará negativamente los rendimientos de reacción. Utilice el detergente en todas las etapas de purificación posteriores.
5. Añadir 0,15 mmol (3 ml de una solución 50 mM, 1 equivalente) de purificado cyt c en el búfer de fosfato-EDTA.
6. Añadir 7,5 l de la TCEP Stock solution (0,075 mol, 0,5 equivalentes) a la solución de proteína y dejar de agitar durante 5 min para reducir cualquier proteína que pueda haber dimerizada debido a la oxidación de cisteína.
   Nota: No agregue TCEP si la proteína de interés no dimerize fácilmente. Comprobarlo ejecutando un gel de proteína en condiciones no reductoras.
7. Añadir 600 l de la solución de acetonitrilo de Ru (II) (tpa) ₂ maleimida a la solución reducida, tamponada de cyt c, y dejar la mezcla de reacción bajo agitación, en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 24 horas.
8. Se concentra la mezcla de reacción usando filtros de giro de 3,5 kDa MWCO, centrifugación a 3.000 xg, repitiendo 2-3 veces con tampón fosfato 20 mM frescas hasta que el filtrado salga clara. Eliminar la mayor cantidad de maleimida sin reaccionar de la mezcla de reacción como sea posible antes de la siguiente etapa de purificación.
   Nota: En este punto, la mezcla de bioconjugación crudo se puede almacenar en el refrigerador, en la oscuridad. Es importante eliminar tinte de maleimida sin reaccionar por centrifuge diálisis antes del almacenamiento como la maleimida puede reaccionar lentamente y no específicamente con residuos de lisina en la superficie de la proteína.

3. Purificación de bioconjugados citocromo C

1. Disolver 2,4 g de dihidrógeno fosfato de sodio y 29,22 g de cloruro sódico en 1 L de agua ultrapura para preparar una solución tampón que contiene 20 mM NaH ₂ PO ₄ y 0,5 M NaCl. Este es el tampón de ejecución para la purificación cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).
2. Disolver 17 g de imidazol (M _w = 68.077 g mol ^-1) en 500 ml de la 20 mM NaH ₂ PO ₄ y tampón de NaCl 0,5 M. Este es el tampón de elución para la purificación IMAC.
3. Ajustar el pH de ambos tampones a pH 7 con NaOH 1 M o HCl, y filtrar a través de membranas de 0,22 micras de celulosa regenerada antes de su uso en la FPLC.
4. Como las columnas IMAC comprados se envían sin ningún tipo de iones metálicos cargados en la colUMN, preparar la columna para un Ni ²⁺ purificación basado lavando la columna con 3 ml de agua ultrapura, 3 ml de solución de acetato de níquel 100 mM, y 6 ml de agua ultrapura. Si la columna no es para ser usado inmediatamente lavar a través de 3 ml de etanol al 20% y almacenar la columna en la nevera para evitar el crecimiento bacteriano.
5. Adjuntar un ^{2 +} Ni RESORTE 1 ml de columna IMAC a la FPLC entre el bucle de inyección y detector de UV-Vis.
6. Equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna de fosfato 20 mM, tampón NaCl 0,5 M usando una tasa de flujo de 0,5 ml / min.
7. Carga de 100 l de mezcla de reacción bruta (filtrada a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras) en la columna de Ni ²⁺ IMAC. Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón de ejecución para eluir no reaccionado cyt C, seguido de un gradiente de imidazol 0 a 125 mM más de 3 volúmenes de columna para eluir el c bioconjugado bisterpyridine-citocromo de rutenio (Ru (II) Cyt c) .
8. Se lava la cOLUMNA con tampón de imidazol 250 mM durante 5 volúmenes de columna, a continuación, volver a equilibrar la columna con fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M y repita el paso 3.7 hasta que todo el bioconjugado bruto ha sido purificada.
9. Reunir las fracciones Bioconjugate y concentrar utilizando un filtro de giro 3,5 kDa MWCO, centrifugación a 3000 x g.
10. Cargar el bioconjugado se concentra en casetes de diálisis de 3,5 kDa MWCO y dializar contra ultrapura agua durante la noche, con 2 cambios de agua.
11. Determinar la concentración de la solución de bioconjugado puro, se concentró por UV-Vis, usando el mismo valor de absortividad molar como iso-1 citocromo c (97,6 mM ^-1 cm ^-1) a 410 nm. Típicamente, la concentración bioconjugado es del orden de 50 - 100 mM.
12. Divida el bioconjugado en 25 ml de alícuotas congeladas y mantener a -20 ° C hasta que se necesiten.

4. Caracterización de bioconjugados citocromo C

1. Desalentarminación de la masa bioconjugado por MALDI-TOF MS
   1. Disolver 10 mg de ácido cafeico en 1 ml de una solución de ácido acetonitrilo / agua / ácido trifluoroacético (80: 20: 0,1, v / v / v).
   2. Diluir 5 l de solución de proteína concentrada con 5 l de solución de ácido cafeico.
   3. Punto de 0,5 l de solución de ácido cafeico en la placa de MALDI objetivo y permita que la solución se seque.
   4. Punto 0.5 l de la solución de la muestra / de la matriz en la parte superior de este punto de ácido cafeico, permita que el punto de que se seque. Detectar otros 0,5 l de matriz de la muestra en la parte superior de este a "sándwich" la muestra entre las capas de la matriz, y dejar secar.
   5. Adquirir los espectros de masas en modo lineal utilizando los ajustes del instrumento adecuados para las proteínas ^16.
2. Investigación de bioconjugados por electroforesis en gel
   1. Preparar 10 l de cada muestra de proteína que se ejecutan mediante la dilución de las muestras de proteínas con sulfato dodecil premezclada de litio (LDS, pH 8,4) tampón (4x) tOA concentración final de aproximadamente 20 mg por pocillo. Para los pozos que requieren condiciones reductoras, añadir 1 l de ditiotreitol 500 mM (DTT) agente (10x) reducir.
   2. muestras de calor a 70 ° C durante 10 min.
   3. Añadir 50 ml de premezcla 1 M MES, base de 1 M Tris, 2% de SDS, EDTA 20 mM (pH 7,7) que se ejecuta mezcla tampón (20x) de una fuente comercial a 950 ml de agua ultrapura para preparar el tampón de gel en funcionamiento.
   4. Retire el peine de plástico a partir del gel y colocar el gel en el depósito de gel en marcha. Llenar el tanque con tampón de gel de ejecución, por lo que los pozos se cubren con tampón.
   5. Cargar las muestras con cuidado en un prefabricado 12% Bis-Tris, 1 mm, gel de 10 pocillos usando puntas de pipeta largos para ayudar en la carga. Cargar el prestained proteína 10 peso molecular marcador (3-188 kDa) en un pozo medio del gel para ayudar a análisis.
   6. Correr el gel a 200 V de tensión constante durante 35 min.
   7. Teñir el gel con una solución de azul de Coomassie comercial durante 2 horas, y lavar con ultrapUre agua durante 48 horas.
3. Determinación de la pureza bioconjugado mediante espectroscopía de UV-Vis
   1. Preparar 120 l de 5 M soluciones de Ru (II) (tpa) ₂ maleimida, iso-1 cyt c, y Ru (II) Cyt c.
   2. Medir el espectro de línea base de la cubeta de cuarzo que contiene sólo agua ultrapura, de 250 nm a 650 nm.
   3. Medir el espectro de cada componente, garantizando la cubeta se enjuaga y se seca entre cada medición.
   4. Trazar la absorbancia de cada componente como una función de longitud de onda, y comparar la suma lineal de los materiales de partida con el producto final para determinar si una relación 1: 1 de Ru (II) (tpa) ₂ maleimida a cyt c ha reaccionado.

Resultados

La síntesis de bioconjugados se confirma por tres métodos principales: Matrix-Assisted Laser Desorption ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS), electroforesis en gel de poliacrilamida, y ultravioleta-visible espectroscopia (UV-Vis), como se muestra en las figuras 2, 3 y 4. Un aumento de la masa correspondiente a la masa de la molécula pequeña anexa, y la falta de una proteína sin reaccionar demuestra la exitosa unión co...

Discusión

La purificación de los materiales de partida antes de una bioconjugation es de suma importancia. Las proteínas obtenidas a partir de fuentes recombinantes comerciales contienen a menudo otras isoformas de la proteína de interés, que puede tener diferente química de la superficie y reactividad. Por ejemplo, en la bioconjugación descrito, el cyt c comercialmente disponible contiene una mezcla de ambos cyt c ^12,14,17 iso-1 e iso-2. Iso-2 y las formas de citocromo c 1 Iso-son en g...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 mL strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 mL IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	extremely corrosive! Use caution
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette