タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

要約

このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。

要約

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

概要

バイオコンジュゲーションは、共有結合相互に、またはそのような染料、薬物またはポリマーなどの合成分子と1の生体分子を結合することを含みます。タンパク質バイオコンジュゲーション法の広範囲な蛍光色素標識^1,2に至るまでのアプリケーションで多くの化学、生物学、ナノテクノロジーの研究グループで使用されている、タンパク質の作成 ​​（抗体^）3（抗体薬物複合体- ADCを）-prodrugsタンパク質二量体^4,5の合成、ナノメディシン⁸およびシステム化学⁹で使用される自己集合タンパク質-ポリマーハイブリッド^6,7に至ります。

標的タンパク質の活性部位を妨害しないように、バイオコンジュゲーションのために使用される化学反応の特異性は、必ずしも重要ではないが、ほとんどの機能性タンパク質のバイオコンジュゲートのために最も重要です。 、目的のタンパク質上のI）を標的と希少または固有のサイト：理想的な生物結合反応は、以下を含む、いくつかの基準を満たす必要がありますⅱ）ⅲ）タンパク質のアンフォールディングを回避するために、非変性条件下で進行、この目標に向かって選択的かつ標的タンパク質は通常、サブミリモル濃度でのみ使用できますようⅳ）高収量になります。マレイミド-システインマイケル付加は、これらすべての基準を満たすに近づくと、その理由のために長いバイオコンジュゲート化学¹⁰の分野で特別な地位を主張しています。私は、その表面上に一つのシステイン残基は、遺伝子が操作することができる含む）多くのタンパク質は、ii）の反応は、システインに向かって高度に選択的であり、正確なpHで、III）は、水性緩衝液中で円滑に進行し、iv）は、それが非常に高速であるためであります5,000 M ^-1秒を超える^{-1 11}いくつかのケースで報告されたシステイン含有タンパク質に対するマレイミドの二次速度定数を有します。提供目的のタンパク質は、有機共溶媒¹²の小（≈五から十パーセント）の量、ほぼすべてのマレイミド官能染料、経口に耐えることができますlymerは、表面又は別のタンパク質は、タンパク質に結合させることができます。また、マレイミドは、上昇したpHで他の求核試薬と反応させることになりやすいですヨードアセトアミド、よりタンパク質上のシステインのために、より特異的です。およびジスルフィド交換^13を防止するために^、酸性pHで維持する必要がジスルフィドベースの活用よりも安定。

ここでは、（II）、Ruの間の反応を使用して、単一のシステイン残基を含有するタンパク質とマレイミド官能化分子の結合のための一般的なプロトコルを報告例として、発色団と酸化還元タンパク質シトクロムcをベース。このプロトコルは、アクセス可能な表面のシステイン残基と対応するマレイミド官能化標的を含むほとんどの他のタンパク質にも同様に適用可能であり、それは別のタンパク質、蛍光色素、発色団または合成ポリマーです。

プロトコル

注： 図1に示すように、以下のプロトコルは、タンパク質-色素バイオコンジュゲートの合成のために設計されているノートが挿入されて膜タンパク質を支援するために、該当する場合それは、自由表面システイン含有タンパク質とのマレイミドの反応のための一般的なプロトコルです。バイオコンジュゲートは、タンパク質 - ポリマーバイオコンジュゲート、および合成タンパク質の二量体（タンパク質 - タンパク質）バイオコンジュゲート。この特定の場合において、タンパク質アイソ1シトクロムcは、高度に特異的な標識化が発生することを可能にする反応に利用できる一面のシステイン残基を有します。目的のタンパク質が複数のシステイン残基を有する場合は、同じプロトコルは、特異性と製品の均一性の損失にもかかわらず、適用されます。特異性は要求されない場合、表面リジン残基を標的とする化学的性質は、N -hydroxysuccinimidylエステルまたはイソチオシアネートを使用して、単純なアプローチであり得ます。

図1. バイオコンジュゲーションの反応スキーム。例の場合、光収穫としては、ルテニウム系アンテナ分子は、（CYS102）ルテニウム系アンテナ分子上のペンダントマレイミドと露出したシステイン残基のマイケル付加を介してシトクロムcに添付されますタンパク質上。チトクロームcの表面の赤い部分は、ヘム基を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

シトクロムcの1精製

注：このステップはすべてのタンパク質には適用されません。しかし、商業的供給業者から得られたタンパク質は、さらに精製¹³によって除去する必要があるかもしれない他の、望ましくないタンパク質アイソフォームを含むことができることを知っておくことが重要です。

1. PRに超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム（= 120 gでモル^-1 _W M）を2.4g溶解20mMのNaH ₂ PO _4を含む緩衝液をepare。 pH7に1 M NaOHでpHを調整します。
   注意：このプロトコルで使用されるリン酸緩衝液は、毎日新たに調製し、使用前に、0.2μmのセルロース膜フィルターを通して濾過されるべきです。
2. 20 mMののNaH ₂ PO ₄および1 M NaCl緩衝液を作るために、塩化ナトリウムの29.22グラム（ _ワット M = 58.44グラムのモル^-1）を20mMのNaH ₂ PO ₄緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは）、ステップ1.6において精製のための溶出緩衝液です。
3. pHが7〜20 mMリン酸緩衝液の6ミリリットルで凍結乾燥したシトクロムc（のcyt c）は 12.0ミリグラムを溶解させます。
4. 別々に1 Mのストック溶液を調製し、超純水を95.3μlのジチオスレイトール14.7ミリグラム（DTT、M _W = 154.25グラム/モル）を溶解します。
   注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようにDTTストック溶液を、新たに調製しなければなりません。
5. ピップタンパク質溶液に1 M DTT溶液60μlのETTEは、チトクロームcを低減することができます。溶液の色は混合時に光赤に暗赤色に変わります。
6. 任意のクロマトグラフィー媒体に注入する前に、0.22μmの低タンパク質結合PVDFシリンジフィルターに通して減少したタンパク質溶液をフィルタリングします。
7. 注入ループと高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）装置の紫外可視検出器との間に3.3ミリリットルの強い陽イオン交換カラムを取り付けます。
8. 1ml /分の流速を用いて、20mMのpH7のリン酸緩衝液の3カラム体積、続いて超純水の3カラム容量でカラムを平衡化。
9. 注入ループへの負荷減少粗チトクロームcの1ミリリットルを、そして328から勾配法開始- 5カラム容量を超える450のNaClを、。紫外可視検出器の280 nmおよび410 nmのチャネルを監視し、最大ピークを収集します。
10. ISO-2チトクロムを溶出するために2カラム体積のために1 Mに塩濃度を増加させますE cおよびカラムをフラッシュした後、次の粗アリコートを注入する前に、リン酸緩衝液を20mMの2カラム容量でカラムを再平衡化。
11. すべての粗タンパク質が精製されている繰り返して、1.9から1.10を繰り返します。
12. プールイソ-1画分を含有し、それらは3.5 kDaの分子量カットオフ（MWCO）スピンフィルターを使用し、3000×gで遠心分離集中。
13. 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮タンパク質をロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。
14. 、10μLを取って超純水で100μlにそれを希釈し、吸光度スペクトルを取ることにより、純粋な濃縮タンパク質溶液の濃度を決定します。少量を使用し、100μlの石英キュベットは、タンパク質吸収スペクトルを得ました。 100μM - 一般的に、希釈していないタンパク質濃度は50程度です。
    1. concentratioを定量化するためのcyt cの特性410 nmのピークを使用しますnは97.6センチメートル^-1 mMの^-1のモル吸光係数の値とランベルト・ベールの法則を使用して：
       A =ε×C×ι
       Aは吸光度であり、εはモル吸光係数は、cはミリモルでの濃度であり、ιは、CM ¹³におけるキュベットの経路長です。
15. この時点で、1mLのアリコートにタンパク質を分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 CYT cは凍結し、解凍した構造または機能を失うことなく、しかし、繰り返しサイクルは、タンパク質を変性し始めることができます。
    注：タンパク質は、異なる程度に凍結耐えます。例えば、緑色蛍光タンパク質^5,9の代わりに冷蔵庫に保存し、凍結されるべきではありません。

シトクロムcバイオコンジュゲートの2合成

1. ルテニウムの0.9 mgのディゾルブ（II）bisterpyridine maleimIDEルテニウム_{（Ru（II）（TPY）2} -マレイミド、0.975マイクロモル、6当量）のアセトニトリル600μlのインチ
   注：使用マレイミドは水溶性である場合、水の代わりに、アセトニトリル中のストック溶液を調製します。マレイミドは、反応緩衝液中で可溶性であることが重要です。ジメチルスルホキシド、N、N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリルは、低分子量^12、多くの場合、疎水性のマレイミド反応物の溶解を助けるためにすべての一般的に使用されるアジュバントです。
2. 20mMに希釈したときにEDTAが溶解するまで、典型的には（数グラムを固体水酸化ナトリウムを加えてpH 7で100 mMリン酸緩衝液および100mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、M _W = 292.24グラム/モル）を含む緩衝液を調製）と、pHを7に調整します。
3. 10mMのストック溶液を調製し、超純水1ml中のトリスの2.87 mgの（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP ^15、M _W = 286.65グラム/モル）を溶解させます。このステップは、インポートされアリは、タンパク質上のシステインが完全に^15を連結^するマレイミドの前に低減されることを保証します。
   注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようTCEP原液は、それぞれの反応のために新たに調製しなければなりません。
4. 50ミリリットルプラスチックチューブで100 mMリン酸/ EDTAストック溶液3mlで超純水11.4ミリリットルを兼ね備えています。タンパク質およびマレイミド原液でさらに希釈すると緩衝液濃度を20mMになります。
   注：標識されたタンパク質は膜貫通タンパク質である場合、適切な界面活性剤は、タンパク質を可溶化するために緩衝液に添加されていることを確認します。洗剤を使用しない場合は、膜タンパク質が徐々にマイナスの反応収率に影響を与えるであろう、沈殿ができます。すべての後続の精製工程で洗剤を使用してください。
5. リン酸EDTA緩衝液に精製されたチトクロームcの0.15マイクロモル（50μM溶液3ml、1当量）を追加します。
6. TCEPストックsolutの7.5μLを追加タンパク質溶液にイオン（0.075マイクロモル、0.5当量）とは、システイン酸化による二量化している可能性のあるタンパク質を減らすために5分間攪拌したままにしておきます。
   注意：目的のタンパク質が容易に二量体化していない場合TCEPを追加しないでください。非還元条件下でタンパク質ゲルを実行することによってこれを確認してください。
7. 24時間、室温で、暗所でのRu（II）（TPY）のcyt cの減少、緩衝溶液に₂ -マレイミドのアセトニトリル溶液600μlを添加し、反応混合物の攪拌を残します。
8. ろ液が透明に実行されるまで、新鮮な20mMのリン酸緩衝液で2〜​​3回繰り返し、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを用いて反応混合物を濃縮します。精製の次の段階の前に、可能な限り、反応混合物からできるだけ多くの未反応のマレイミドを削除します。
   注：この時点で、粗製のバイオコンジュゲーション混合物を、暗所で、冷蔵庫で保存することができます。 CENTRにより未反応のマレイミド色素を除去することが重要です保存前の透析ifugeマレイミドのようにゆっくりと非特異的にタンパク質の表面上のリジン残基と反応することができます。

シトクロムcバイオコンジュゲートの3精製

1. 20mMのNaH ₂ PO _4、0.5 M NaClを含む緩衝液を調製し、超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム2.4gの塩化ナトリウムの29.22グラム溶解します。これは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）精製のためのランニングバッファーです。
2. イミダゾールの17グラム（ _ワット M = 68.077グラムのモル^-1）を20mMのNaH ₂ PO ₄および0.5MのNaCl緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは、IMAC精製の溶出緩衝液です。
3. 1 M NaOHまたはHClを用いてpH7に両方のバッファのpHを調整し、FPLCで使用する前に0.22μmの再生セルロース膜を介してそれらをフィルタリングします。
4. 購入したIMACカラムは、COL上にロードされた任意の金属イオンなしで出荷されているようにUMN、Niのためにカラムを準備²⁺ベースの超純水を3ml、100mMの酢酸ニッケル溶液3mlでカラムを洗浄することによって精製し、超純水6mLを。カラムをすぐに使用しない場合の20％エタノール3mlのを通して洗浄し、細菌の増殖を防ぐために冷蔵庫に列を格納します。
5. Ni ^2+を取り付け注入ループとUV-Visの検出器との間FPLCに1ミリリットルIMACカラムを-loaded。
6. 20mMのリン酸の3カラム体積、0.5ml /分の流速を用いて0.5 M NaCl緩衝液でカラムを平衡化します。
7. 負荷のNi ²⁺ IMACカラム（0.22μmのシリンジフィルターで濾過）粗反応混合物100μlの。 （C -cytのRu（II））ルテニウムbisterpyridineシトクロムCのバイオコンジュゲートを溶出するために、3カラム容量にわたって0からmMの125にイミダゾール勾配が続く未反応のチトクロームcを溶出するためにランニングバッファーの3カラム容量でカラムを洗浄。
8. Cを洗いますすべての粗バイオコンジュゲートを精製されるまでolumn 5カラム容量のための250 mMのイミダゾール緩衝液で、その後、20 mMのリン酸、0.5 M NaClおよび繰り返しステップ3.7でカラムを再平衡化。
9. バイオコンジュゲートの画分をプールし、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを使用してそれらを集中。
10. 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮されたバイオコンジュゲートをロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。
11. 純粋の濃度を決定し、410 nmでISO-1シトクロムc（97.6 mMの^-1 cm ^{-1 で} ）同じモル吸光値を使用して、UV-Visのことでバイオコンジュゲート液を濃縮しました。 100μM - 一般的に、バイオコンジュゲートの濃度が50程度です。
12. 25μlのアリコートにバイオコンジュゲートを分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。

シトクロムcバイオコンジュゲートの4キャラクタリゼーション

1. 抑止しますMALDI-TOF MSによるバイオコンジュゲートの質量のmination
   1. アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸溶液1mlにカフェー酸10mgを溶解し（80：20：0.1、v / v / v）です。
   2. コー​​ヒー酸溶液5μlの濃縮タンパク質溶液5μlを希釈します。
   3. MALDIターゲットプレート上のコーヒー酸溶液0.5μLを発見し、解決策を乾燥させます。
   4. スポット0.5は、このカフェー酸スポットの上にサンプル/マトリックス溶液μL、スポットが乾燥することができます。マトリックスの層の間のサンプル「サンドイッチ」にこの上にサンプルマトリックスの別の0.5μLをスポットし、乾燥させます。
   5. タンパク質¹⁶に適した機器の設定を使用してリニアモードで質量スペクトルを取得します。
2. ゲル電気泳動によるバイオコンジュゲートの調査
   1. 予混合ドデシル硫酸リチウム（LDS、pHは8.4）緩衝液（4×）トンでタンパク質試料を希釈することによって実行されるように、各タンパク質試料を10μlの準備OAウェルあたり約20μgのの最終濃度。条件を減らす必要が井戸の場合、エージェント（10倍）を低減500mMのジチオスレイトール（DTT）の1μlを添加します。
   2. 10分間70℃で熱サンプル。
   3. ゲルランニングバッファーを準備するために予混合の50mlの1M MES、1Mトリス塩基、2％SDS、20mMのEDTA（pHは7.7）の超純水950ミリリットルに商業的供給源から緩衝液混合物（20倍）を実行を追加します。
   4. ゲルからプラスチック製の櫛を削除し、ゲルランニングタンク内のゲルを置きます。ウェルを緩衝液で覆われているように、ゲルランニング緩衝液でタンクを埋めます。
   5. 慎重にプレキャスト12％ビス - トリス、1ミリメートル、ロードを支援するために、長いピペットチップを用いて10ウェルのゲル上にロードしたサンプル。分析を助けるために、ゲルの中央のウェルに予備染色10タンパク質分子量マーカー（3から188キロダルトン）をロードします。
   6. 35分間200 Vの定電圧でゲルを実行します。
   7. 2時間商用クマシーブルー溶液でゲルを染色し、ultrapで洗浄48時間URE水。
3. 紫外可視分光法によるバイオコンジュゲートの純度の決意
   1. Ruを5μMソリューション_{（II）（TPY）2} -マレイミド、イソ-1のcyt c、およびルテニウム（II）-cyt C120μlのを準備します。
   2. 250 nmのから650 nmまで、唯一の超純水を含む石英キュベットのベースラインスペクトルを測定します。
   3. キュベットは、各測定間ですすぎ、乾燥されることを保証、各成分のスペクトルを測定します。
   4. 波長の関数としての各成分の吸光度をプロットし、そして1かどうかを決定するために、最終製品に、出発物質の線形和を比較：ルテニウム（II）（TPY）CYTのC ₂ -マレイミドの1比率が反応しました。

結果

図2に示すように 、飛行質量分析（MALDI-TOF MS）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および紫外-可視（UV-Vis）で分光法のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間：バイオコンジュゲートの合成は、3つの主要な方法によって確認されます3,4。添付の小分子の質量に対応する質量の増加、および未反応のタンパ...

ディスカッション

バイオコンジュゲーションの前に出発物質の精製は、最も重要です。商業的な組換え供給源から得られたタンパク質は、しばしば、異なる表面化学と反応性を有することができ、目的のタンパク質の他のアイソフォームを含みます。例えば、記載生体結合に、市販のcyt cが両方イソ-1およびイソ-2のcyt Cの ^12,14,17の混合物が含まれています。シトクロムcのISO-2および...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 ml strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 ml IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	Extremely corrosive! Use caution.
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette