Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat.

Zusammenfassung

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Einleitung

Biokonjugation beinhaltet die Verknüpfung kovalent ein Biomolekül mit einem anderen oder mit einem synthetischen Molekül, wie ein Farbstoff, Arzneimittel oder einem Polymer. Protein Biokonjugation Methoden werden nun ausführlich in vielen Chemie, Biologie und Nanotechnologie Forschungsgruppen mit Anwendungen , die von fluoreszierenden Farbstoffmarkierung ^1,2, Herstellung von Protein (Antikörper) -prodrugs ³ (Antikörper - Wirkstoff - Konjugate - ADCs) verwendet Synthese von Protein - Dimere ^4,5 bis hin zu selbstorganisierenden Protein-Polymer - Hybriden ^6,7 verwendet in den Bereich Nanomedizin ⁸ und Systemchemie ^9.

Spezifität der Chemie für die Biokonjugation verwendet, während nicht immer kritisch, ist von größter Bedeutung für die meisten funktionellen Protein Biokonjugate, um nicht mit der aktiven Stelle des Zielproteins zu stören. Die ideale Biokonjugation Reaktion muss mehrere Kriterien erfüllen, darunter: i) Targeting seltene oder einzigartige Stellen auf dem Protein von Interesse,ii) werden selektiv in Richtung auf dieses Ziel, iii) gehen unter nicht-denaturierenden Bedingungen Proteins zu vermeiden Entfalten und iv) werden mit hoher Ausbeute als das Zielprotein bei unteratmosphärischem millimolar Konzentration der Regel nur zur Verfügung steht. Das Maleimid - Cystein Michael Zusätzlich kommt in der Nähe , alle diese Kriterien zu erfüllen, und hat aus diesem Grund lange einen besonderen Status im Bereich der Biokonjugat Chemie ¹⁰ beansprucht. Dies ist, weil i) viele Proteine ​​nur einen Cysteinrest an ihrer Oberfläche enthalten, können genetisch es so konstruiert werden, ii) in der richtigen pH der Reaktion auf Cystein hochselektiv ist, iii) es verläuft glatt in wässrigen Puffern und iv) es ist sehr schnell mit der Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung von Maleimiden in Cystein enthaltenden Proteinen berichtet überschreiten 5,000 M ^-1 sec ^-1 in einigen Fällen ^11. Sofern das Protein von Interesse einen kleinen (≈ 5-10%) Menge an organischem Co-Lösungsmittel ^12, fast jede Maleimid-funktionalisierten Farbstoff tolerieren kann, polymer, Oberfläche oder ein anderes Protein können an Proteine ​​gebunden werden. Darüber hinaus sind Maleinimide spezifischer für Cysteine ​​an Proteinen als iodoacetamides, die Reaktion mit anderen Nucleophilen bei erhöhten pH anfälliger sind; und stabiler als Disulfid-basierte Konjugationen , die bei einem sauren pH gehalten werden müssen Disulfidaustausch ¹³ zu verhindern.

Hier berichten wir über ein generisches Protokoll für die Konjugation von Maleimid-funktionalisierten Molekülen an ein Protein , einen einzelnen Cysteinrest unter Verwendung der Reaktion zwischen einem Ru (II) -Basis Chromophor und dem Redoxprotein Cytochrom c als Beispiel enthalten. Dieses Protokoll ist gleichermaßen auf die meisten anderen Proteine, die eine zugängliche Oberfläche Cysteinrest und das entsprechende Maleimid-funktionalisierten Ziel, sei es ein anderes Protein, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Chromophor oder ein synthetisches Polymer enthält.

Protokoll

Hinweis: Das folgende Protokoll wird für die Synthese eines Proteins-Farbstoff - Biokonjugat ausgelegt wie in Figur 1 gezeigt , ist es ein allgemeines Protokoll für die Reaktion einer Maleimid mit freien Oberfläche Cystein enthaltenden Proteinen, mit Anmerkungen eingefügt gegebenenfalls mit Membranprotein zu unterstützen. Biokonjugate, Protein-Polymer-Biokonjugate und synthetische Protein-Dimer (Protein-Protein) Biokonjugate. In diesem speziellen Fall das Protein iso-1 - Cytochrom c hat eine Oberfläche Cysteinrest Verfügung zu reagieren , die auftreten , eine hochspezifische Kennzeichnung ermöglicht. Wenn ein Protein von Interesse mehrere Cysteinreste hat, gilt das gleiche Protokoll, wenn auch mit dem Verlust der Spezifität und Produkthomogenität. Chemie Targeting Oberfläche Lysinresten unter Verwendung von N -hydroxysuccinimidyl Ester oder Isothiocyanate kann ein einfacherer Ansatz, wenn Spezifität nicht erforderlich ist.

Abbildung 1. Reaktionsschema Biokonjugation. Als Beispiel Fall einer Lichtsammlung, auf Rutheniumbasis Antennen Molekül wird über die Michael - Addition von einem Anhänger Maleimid auf der Basis von Ruthenium Antennen Molekül und einem freiliegenden Cystein - Rest (CYS102) an Cytochrom c befestigt werden auf dem Protein. Der rote Bereich des cyt c Oberfläche zeigt die Häm - Gruppe. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Reinigung von Cytochrom c

Hinweis: Dieser Schritt für alle Proteine, die nicht anwendbar ist. Jedoch ist es wichtig , dass ein Protein von einem kommerziellen Lieferanten erhalten wissen kann andere unerwünschte Protein - Isoformen enthalten , die durch weitere Reinigung ¹³ entfernt werden müssen.

1. Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat (M _w = 120 g mol ^-1) in 1 l Reinstwasser prepare eine Pufferlösung 20 mM NaH ₂ PO ₄ enthält. Den pH-Wert mit 1 M NaOH auf pH 7 gestellt.
   Anmerkung: Die Phosphatpuffer in diesem Protokoll verwendet werden, sollten frisch auf einer täglichen Basis hergestellt werden, und filtriert durch ein 0,2 um Cellulose-Membranfilter vor der Verwendung.
2. Man löst 29,22 g Natriumchlorid (M _w = 58.44 g mol ^-1) in 500 ml des 20 mM NaH ₂ PO ₄ Puffer 20 mM NaH ₂ PO ₄ und 1 M NaCl - Puffer zu machen. Dies ist der Elutionspuffer für die Reinigung in Schritt 1.6).
3. Man löst 12,0 mg lyophilisiertes Cytochrom C (cyt c) in 6 ml pH 7 20 mM Phosphatpuffer.
4. Auflösen Getrennt 14,7 mg Dithiothreitol (DTT, M _w = 154,25 g / mol) in 95,3 ul Reinstwasser zu einer 1 M Stammlösung vorzubereiten.
   Hinweis: Die DTT-Stammlösung sollte frisch hergestellt werden, da dieses Reagenz zu oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist.
5. Pipette 60 ul der 1 M DTT - Lösung in die Proteinlösung den cyt c zu reduzieren. Die Farbe der Lösung von dunkelrot bis hellrot ändern beim Mischen.
6. Filtern Sie die reduzierte Proteinlösung durch ein 0,22 & mgr; m geringer Proteinbindung PVDF-Spritzenfilter, bevor sie auf jedem chromatographischen Medium zu injizieren.
7. Bringen Sie ein 3,3 ml starke Kationenaustauschsäule zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis-Detektor eines Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Instrument.
8. Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina Reinstwasser, gefolgt von 3 Säulenvolumina 20 mM pH 7 Phosphatpuffer, eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird.
9. Last 1 ml reduziertes Rohöl cyt c in die Injektionsschleife, und starten Sie eine Gradientenmethode 328-450 mM NaCl, über 5 Säulenvolumen. Überwachen Sie die 280 nm und 410 nm Kanäle des UV-Vis-Detektor, und sammeln die größte Spitze.
10. Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 M für 2 Säulenvolumina iso-2 Cytochrom zu eluierene c, und nachdem die Säule gespült wurde, Re-Äquilibrieren der Säule mit 2 Säulenvolumina von 20 mM Phosphatpuffer , bevor der nächste grobe Aliquot einzuspritzen.
11. Wiederholen Sie die Schritte 1,9-1,10, bis das gesamte rohe Protein gereinigt worden ist.
12. Pool, die iso-1 enthaltenden Fraktionen und konzentriert sie mit einem 3,5 kDa Molekulargewichtsgrenze (MWCO) Spinfilter und Zentrifugieren bei 3000 x g.
13. Legen Sie das konzentrierte Protein in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel.
14. Bestimmen Sie die Konzentration des reinen, konzentrierten Proteinlösung von 10 & mgr; l nehmen, Verdünnen auf 100 ul mit Reinstwasser und unter ein Absorptionsspektrum. Verwenden Sie ein geringes Volumen, 100 & mgr; l Quartzküvette Protein Absorptionsspektren zu erhalten. Typischerweise ist das unverwässerte Proteinkonzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 & mgr; M.
    1. Verwenden Sie die charakteristische 410 nm - Spitze von Cyt c , um den concentratio quantifizierenn mit dem Beer-Lambert - Gesetz mit einem molaren Absorptionswert von 97,6 cm ^-1 mM ^-1:
       A = ε × c × ι
       wobei A die Extinktion ist, ε der molare Extinktionskoeffizient, c die Konzentration in mM ist und ι die Weglänge der Küvette in cm ^13.
15. An dieser Stelle teilen das Protein in 1 ml Aliquots und gefroren halten bei -20 ° C, bis sie benötigt werden. Cyt c kann ohne Verlust der Struktur oder Funktion eingefroren und aufgetaut werden, aber Wiederholungszyklen beginnt das Protein zu denaturieren.
    Hinweis: Die Proteine ​​tolerieren Einfrieren in unterschiedlichem Ausmaß. Zum Beispiel sollte grün fluoreszierende Proteine ^​​5,9 nicht eingefroren werden, statt in einem Kühlschrank gelagert.

2. Synthese von Cytochrom c -Biokonjugaten

1. Man löst 0,9 mg Ruthenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (jato) ₂ -Maleimid, 0,975 & mgr; mol, 6 Äquivalente) in 600 & mgr; l Acetonitril.
   Hinweis: Bei Verwendung der Maleimid in Wasser löslich ist, um eine Stammlösung in Wasser herzustellen, anstatt Acetonitril. Es ist wichtig für das Maleimid löslich in dem Reaktionspuffer sein. Dimethylsulfoxid, N, N - Dimethylformamid und Acetonitril werden alle Hilfsstoffe gemeinhin verwendet in der Auflösung von niedrigem Molekulargewicht , ¹² zu unterstützen, häufig hydrophobe Maleimid Reaktanden.
2. Bereiten einer Pufferlösung , enthaltend 100 mM Phosphatpuffer und 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, M _w = 292,24 g / mol), die , wenn sie 7 bis 20 mM bei pH verdünnt festes Natriumhydroxid hinzu , bis das EDTA gelöst (mehrere Gramm typischerweise ) und stellen Sie den pH-Wert auf 7.
3. Man löst 2,87 mg Tris (2-carboxyethyl) phosphin - Hydrochlorid (TCEP ^15, M _w = 286,65 g / mol) in 1 ml Reinstwasser eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Dieser Schritt ist der Important , um sicherzustellen , daß das Cystein auf dem Protein vollständig vor verringert Kupplung ¹⁵ an Maleimid.
   Anmerkung: Die Stammlösung sollte TCEP frisch für jede Reaktion hergestellt werden, da dieses Reagenz oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist.
4. Kombinieren 11,4 ml Reinstwasser mit 3 ml 100 mM Phosphat / EDTA-Stammlösung in einem 50 ml Kunststoffröhrchen. Wenn weiter verdünnt mit Protein und Maleimid Stammlösungen der Pufferkonzentration 20 mM sein.
   Hinweis: Wenn das Protein markiert ist ein Transmembranprotein ist, stellen Sie sicher, dass ein geeignetes Reinigungsmittel zu dem Puffer hinzugefügt wird, das Protein löslich zu machen. Wenn ein Reinigungsmittel nicht verwendet wird, kann das Membranprotein langsam auszufallen, was sich negativ auf die Reaktionsausbeuten auswirken wird. Verwenden Sie das Waschmittel in allen nachfolgenden Reinigungsschritte.
5. 0.15 & mgr; mol (3 ml einer 50 uM - Lösung, 1 Äquivalent) gereinigt cyt c mit dem Phosphat-EDTA - Puffer.
6. 7.5 ul der TCEP Lager solutIon (0,075 & mgr; mol, 0,5 Äquivalente) zu der Proteinlösung und lassen Sie für 5 min Rühren jedes Protein zu reduzieren, die aufgrund Cysteinoxidation dimerisierte haben.
   Hinweis: TCEP nicht hinzufügen, wenn das Protein von Interesse nicht ohne weiteres dimerisieren. Überprüfen Sie dies durch ein Protein-Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen läuft.
7. Hinzufügen 600 ul der Acetonitrillösung von Ru (II) (tpy) ₂ -maleinimid der reduzierten, gepufferten Lösung von cyt c und lassen das Reaktionsgemisch unter Rühren im Dunkeln bei RT 24 h.
8. Konzentriere das Reaktionsgemisch mit 3,5 kDa MWCO Spinfilter, bei 3000 × g zentrifugiert, wiederholen 2-3 mal mit frischem 20 mM Phosphatpuffer, bis das Filtrat klar bleibt. Entfernen Sie so viel nicht umgesetzte Maleimid aus dem Reaktionsgemisch wie möglich, bevor die nächste Stufe der Reinigung.
   Anmerkung: An diesem Punkt kann die rohe Biokonjugation Gemisch im Kühlschrank aufbewahrt werden, in der Dunkelheit. Es ist wichtig, um nicht umgesetztes Maleimid centr Farbstoff zu entfernenifuge Dialyse vor der Lagerung als Maleinimid langsam und unspezifisch mit Lysinresten auf der Oberfläche des Proteins reagieren.

3. Reinigung von Cytochrom c -Biokonjugaten

1. Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat und 29.22 g Natriumchlorid in 1 l Reinstwasser eine Pufferlösung herzustellen , die 20 mM NaH ₂ PO ₄ und 0,5 M NaCl. Dies ist der Laufpuffer für die immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) Reinigung.
2. Man löst 17 ​​g Imidazol (M _w = 68,077 g mol ^-1) in 500 ml des 20 mM NaH ₂ PO ₄ und 0,5 M NaCl - Puffer. Dies ist der Elutionspuffer für die IMAC-Reinigung.
3. Der pH-Wert beider Puffer pH 7 unter Verwendung von 1 M NaOH oder HCl, und filtern sie durch 0,22 um regenerierte Cellulosemembranen vor der Verwendung in der FPLC.
4. Da die IMAC Spalten gekauft werden ohne Metallionen ausgeliefert auf den col geladenUMN, bereiten Sie die Spalte für eine Ni ²⁺ -basierten Reinigung durch die Säule mit 3 ml Reinstwasser Waschen, 3 ml 100 mM Nickelacetat - Lösung und 6 ml Reinstwasser. Wenn die Spalte nicht sofort durch 3 ml 20% igem Ethanol und speichern die Säule im Kühlschrank waschen verwendet werden Bakterienwachstum zu verhindern.
5. Bringen Sie ein Ni ²⁺ -beladene 1 ml IMAC - Säule auf die FPLC zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis - Detektor.
6. Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl-Puffer mit einem Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min verwendet wird.
7. Last 100 ul des rohen Reaktionsgemisches (filtriert durch ein 0,22 um - Spritzenfilter) auf der Ni ²⁺ IMAC - Säule. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer läuft nicht umgesetztem cyt c zu eluieren, gefolgt von einem Imidazol - Gradienten von 0 bis 125 mM über 3 Säulenvolumina des Rutheniums bisterpyridine-Cytochrom c Biokonjugat zu eluieren (Ru (II) -cyt c) .
8. Waschen Sie die cPALTE mit 250 mM Imidazol-Puffer für 5 Säulenvolumina, anschließend erneut äquilibriert Die Säule wird mit 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl und wiederhole Schritt 3.7, bis das gesamte rohe Biokonjugat gereinigt wurde.
9. Pool die Biokonjugat Fraktionen und konzentrieren sie mit einem 3,5 kDa MWCO Spinfilter, Zentrifugieren bei 3000 x g.
10. Legen Sie das konzentrierte Biokonjugat in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel.
11. Bestimmung der Konzentration des reinen, konzentrierten Biokonjugat Lösung durch UV-Vis, unter Verwendung der gleichen molaren Absorptionswert als iso-1 - Cytochrom c (97,6 mM ^-1 cm ^-1) bei 410 nm. Typischerweise ist die Biokonjugat Konzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 uM.
12. Teilen Sie die Biokonjugat in 25 ul Aliquots und halten gefroren bei -20 ° C, bis sie benötigt werden.

4. Charakterisierung von Cytochrom c -Biokonjugaten

1. AbhaltenDigen Biokonjugat Masse durch MALDI-TOF-MS
   1. Man löst 10 mg Kaffeesäure in 1 ml eines Acetonitril / Wasser / Trifluoressigsäure-Lösung (80: 20: 0,1, v / v / v).
   2. Verdünne 5 & mgr; l konzentrierte Proteinlösung mit 5 ul Kaffeinsäure Lösung.
   3. Spot 0,5 ul Kaffeinsäure Lösung auf dem MALDI Zielplatte und die Lösung zu trocknen.
   4. Spot 0,5 & mgr; l der Probe / Matrix-Lösung im oberen Teil der Kaffeesäure Stelle, kann der Stelle zu trocknen. Beschmutzen weitere 0,5 & mgr; l Probenmatrix auf dieses auf "Sandwich" der Probe zwischen den Schichten der Matrix und trocknen lassen.
   5. Erwerben Massenspektren im linearen Modus geeignet Geräteeinstellungen für Proteine ^​​16 verwenden.
2. Untersuchung der Biokonjugate durch Gelelektrophorese
   1. Herstellung von 10 ul jeder Proteinprobe durch Verdünnen von Proteinproben mit vorgemischten Lithiumdodecylsulfat (LDS, pH 8,4) Puffer (4x) t zu laufenoa Endkonzentration von etwa 20 & mgr; g pro Vertiefung. Für Brunnen, die reduzierenden Bedingungen benötigen, fügen 1 ul 500 mM Dithiothreitol (DTT) Reduktionsmittel (10x).
   2. Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min.
   3. 50 ml vorgemischtes 1 M MES, 1 M Tris-Base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) Laufpuffergemisch (20x) von einer handelsüblichen Quelle auf 950 ml Reinstwasser des Gel-Laufpuffer herzustellen.
   4. Entfernen Sie die Kunststoff-Kamm aus dem Gel und legen Sie das Gel in dem Gel Lauftank. Füllen Sie den Tank mit Gel-Laufpuffer, so dass die Vertiefungen mit Puffer bedeckt sind.
   5. Laden Sie die Proben vorsichtig auf eine Fertig 12% Bis-Tris, 1 mm, 10-Well-Gel lange Pipettenspitzen beim Laden zu unterstützen. Laden Sie das färbten 10 Protein-Molekulargewichtsmarker (3-188 kDa) in eine mittlere Vertiefung der Gel-Analyse zu unterstützen.
   6. Führen Sie das Gel bei 200 V konstanter Spannung für 35 min.
   7. Stain das Gel mit einem kommerziellen Coomassieblau-Lösung für 2 Stunden und waschen mit ultrapure Wasser für 48 Stunden.
3. Bestimmung von Biokonjugat Reinheit durch UV-Vis - Spektroskopie
   1. Bereiten 120 & mgr; l von 5 & mgr; M Lösungen von Ru (II) (tpy) ₂ -maleimid, iso-1 cyt c und Ru (II) -cyt c.
   2. Messen der Basislinienspektrum der Quarzküvette nur Reinstwasser, von 250 nm bis 650 nm enthält.
   3. Messen Sie das Spektrum der einzelnen Komponenten gewährleistet die Küvette gespült und zwischen jeder Messung getrocknet.
   4. Plotten die Absorption jeder Komponente als eine Funktion der Wellenlänge, und vergleichen die lineare Summe der Ausgangsmaterialien mit dem Endprodukt zu bestimmen , ob eine 1: 1 - Verhältnis von Ru (II) (tpy) -maleinimid ₂ bis cyt c reagiert hat.

Ergebnisse

Die Synthese von Biokonjugaten wird durch drei primäre Methoden bestätigt: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), Polyacrylamid - Gelelektrophorese und UV-VIS (UV-Vis) Spektroskopie, wie in den 2, 3 und 4. Eine Massenzunahme der Masse des beigefügten kleine Molekül und das Fehlen eines nicht - umgesetztem Protein entspricht zeigt die erfolgreiche kovalente Verknüpfung von Ru (II) (tpy) -maleinimi...

Diskussion

Reinigung der Ausgangsmaterialien vor einer Biokonjugation ist von größter Bedeutung. Proteine, erhalten aus kommerziellen rekombinanten Quellen enthalten oft andere Isoformen des Proteins von Interesse, die unterschiedliche Oberflächenchemie und Reaktivität aufweisen. Beispielsweise in dem beschriebenen Biokonjugation, enthält das handelsübliche cyt c ein Gemisch aus beiden iso-1 und iso-cyt c 2 ^12,14,17. Iso-2 und iso-1 Formen von Cytochrom c sind weitgehend homolog mit der ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 mL strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 mL IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	extremely corrosive! Use caution
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette