סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים החשובים הנדרשים bioconjugation של ציסטאין המכיל חלבון על maleimide, כוללים טיהור מגיבה, תנאי תגובה, טיהור bioconjugate ואפיון bioconjugate.

Abstract

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Introduction

Bioconjugation עוסק בחיבור קוולנטית biomolecule אחד עם השני או עם מולקולה סינתטית כגון צבע, סמים או פולימר. שיטות bioconjugation חלבון נמצאות כיום בשימוש נרחב קבוצות מחקר כימיה, ביולוגיה וננוטכנולוגיה רבות עם יישומים החל תיוג פלורסנט לצבוע ^1,2, מה שהופך של חלבון (נוגדן) -prodrugs ³ (conjugates תרופת נוגדן - ADC) סינתזה של הדימרים חלבון ^4,5 , ועד כלאי חלבון-פולימר הרכבה עצמית ^6,7 המשמשים כימיה nanomedicine ⁸ ומערכות ^9.

ספציפית של הכימיה המשמש bioconjugation, בעוד לא תמיד קריטי, הוא בעל חשיבות עליונה עבור bioconjugates חלבון הפונקציונלי ביותר, כדי לא להפריע את האתר הפעיל של חלבון המטרה. תגובת bioconjugation האידיאלית צריכה לקיים מספר קריטריונים, כולל: i) מיקוד אתרים נדירים או ייחודיים על החלבון של עניין,ii) להיות סלקטיבית כלפי יעד זה, iii) להמשיך בתנאים שאינם denaturing להימנע חלבון התגלגלות iv) להיות גבוה מניב כמו חלבון המטרה הוא בדרך כלל זמין רק בריכוז תת-millimolar. Maleimide - ציסטאין מיכאל בנוסף מתקרב להגשמת כל הקריטריונים הללו, ויש לו מסיבה זו טענה ארוכה מעמד מיוחד בתחום כימית bioconjugate ^10. הסיבה לכך היא כי אני) חלבונים רבים המכילים שאריות ציסטאין היחיד על פני השטח שלהם יכול להיות מהונדסים גנטית שם, ב) על pH הנכון התגובה היא מאוד סלקטיבית כלפי ציסטאין, iii) זה יתנהל למישרין מאגרים מימיים iv) זה מהר מאוד עם קבוע של maleimides שיעור מסדר שני חלבונים המכילים ציסטאין דיווחו יעלה 5,000 M ^-1 שניות ^-1 ובמקרים מסוימים ^11. ספקו את החלבון של עניין יכול לסבול קטנה (≈ 5-10%) כמות אורגן שיתוף ממסים ^12, כמעט כל צבען פונקציונלי maleimide, פוlymer ומשטחים או חלבון אחר יכול להיות קשור חלבונים. בנוסף, maleimides הם ספציפי יותר עבור cysteines על חלבונים מאשר iodoacetamides, אשר נוטה יותר להגיב עם נוקלאופיל אחר ב- pH הגבוהה; ויציבה יותר מאשר גזרה בבניינים מבוססי דיסולפיד אשר צריך להישמר ב- pH חומצי כדי למנוע חילופי דיסולפיד ^13.

כאן אנו מדווחים פרוטוקול גנרי הנטייה של מולקולות פונקציונלי maleimide לחלבון המכיל שאריות ציסטאין יחידות באמצעות התגובה בין Ru (II) כרומופור מבוסס ואת ציטוכרום C חלבון חיזור כדוגמא. פרוטוקול זה הוא החלים באופן שווה על רוב החלבונים אחרים המכילים שאריות ציסטאין משטח נגישות ויעד maleimide הפונקציונלית המקביל, בין אם הוא חלבון אחר, צבע ניאון, כרומופור או פולימר סינטטי.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא מיועד הסינתזה של bioconjugate חלבון-צבען כפי שמוצג באיור 1 זהו פרוטוקול כללי עבור התגובה של maleimide עם חלבונים המכילים ציסטאין משטח בחינם, עם הערות מוכנסות ישים לסייע עם חלבון הממברנה. bioconjugates, bioconjugates חלבון-פולימר, ו דימר חלבון סינתטי (חלבונים) bioconjugates. במקרה המסוים הזה, ציטוכרום C חלבון iso-1 יש שאריות ציסטאין משטח אחד זמינות להגיב המאפשרות תיוג מאוד ספציפי להתרחש. אם חלבון של עניין יש שאריות ציסטאין מרובות, באותו הפרוטוקול חל, אמנם עם הפסד של סגוליות והומוגניות מוצר. כימיה מיקוד שאריות ליזין פני השטח, באמצעות אסטרים -hydroxysuccinimidyl N או isothiocyanates, עשויה להיות גישה יותר פשוט אם סגוליות אינו נדרש.

תכנית תגובה באיור 1. Bioconjugation. כמקרה לדוגמא, קציר אור, מולקולת אנטנה מבוססת רותניום תצורף ציטוכרום C באמצעות מיכאל תוספת של תליון maleimide על מולקולת האנטנה מבוססת רותניום שאריות ציסטאין החשוף (CYS102) על החלבון. האזור האדום של משטח ג CYT מציין את קבוצת heme. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טיהור 1. של ציטוכרום C

הערה: שלב זה אינו חל על כל החלבונים. עם זאת, חשוב לדעת כי חלבון המתקבל מן ספק מסחרי יכול להכיל isoforms חלבון אחר, רצוי אשר ייתכן שיהיה הצורך להסירו באמצעות טיהור נוספת ^13.

1. ממיסים 2.4 גרם של פוספט dihydrogen נתרן (M _w = 120 גרם mol ^-1) ב 1 ליטר של מים ultrapure כדי prepare פתרון מאגר המכיל 20 מ"מ לאא ₂ PO _4. התאם את ה- pH עם 1 M NaOH ל- pH 7.
   הערה: מאגרים פוספט משמש פרוטוקול זה צריך להיות מוכן טרי על בסיס יומי, ולסנן דרך פילטר ממברנה תאית 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.
2. ממיסים 29.22 גרם של נתרן כלורי (M _w = 58.44 גרם mol ^-1) ב 500 מ"ל של חיץ 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ לעשות 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ ו -1 חיץ M NaCl. זהו חיץ elution לטיהור בשלב 1.6).
3. ממיסים 12.0 מ"ג של ציטוכרום C lyophilized (ג CYT) ב 6 מ"ל של pH 7 חיץ פוספט 20 מ"מ.
4. בנפרד לפזר 14.7 מ"ג של dithiothreitol (DTT, M _w = 154.25 g / mol) ב 95.3 μl של מים ultrapure להכין פתרון המניה 1 M.
   הערה: פתרון מניות DTT אמור להיות מוכן טרי, כמו מגיב זה רגיש שחרור משרות חמצונים בתמיסה מימית.
5. צִפצוּףette 60 μl של פתרון M DTT 1 לתוך תמיסת החלבון להפחית את ג CYT. הצבע של הפתרון ישתנה מאדום כהה לאדום אור על ערבוב.
6. סנן את פתרון החלבון המופחת דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר נמוך חלבון מחייב PVDF לפני ההזרקה גבי כל מדיה chromatographic.
7. צרף עמודת קטיוני 3.3 מיליליטר חזקה בין לולאת הזרקת הגלאי-Vis UV של מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית מהיר חלבון (FPLC).
8. לאזן את העמודה עם 3 כרכים עמוד מים ultrapure, ואחריו 3 כרכים הטור של חיץ פוספט 20 מ"מ pH 7, באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה.
9. טען 1 מ"ל של ג CYT גולמי מופחת לתוך הלולאה זריקה, ולהתחיל שיטה שיפוע 328 - 450 מ"מ NaCl, מעל 5 כרכים עמודה. לפקח על ערוצי 280 ננומטר ו 410 ננומטר של גלאי UV-Vis, לאסוף את השיא הגדול.
10. להגדיל את ריכוז מלח 1 M עבור 2 כרכים עמודה כדי elute ציטוכרום iso-2דואר ג, ואחרי הטור כבר סמוק, מחדש לאזן את העמודה עם 2 כרכי עמודה של 20 מ"מ חיץ פוספט לפני הזרקת aliquot הגולמי הבא.
11. חזור על שלבי 1.9-1.10 עד שכל החלבון הגולמי טוהר.
12. פינת שברים המכיל 1 iso ולרכזם באמצעות מסנן ספין 3.5 kDa מולקולרית משקל קטעון (MWCO) ו centrifuging ב 3,000 x גרם.
13. טען את חלבון מרוכז לתוך 3.5 קלטות דיאליזה kDa MWCO ו dialyze נגד במים למשך הלילה ultrapure, עם 2 שינויים של מים.
14. קבע את הריכוז של הפתרון חלבון טהור, מרוכז על ידי לקיחת 10 μl, דילול אותו ל -100 μl עם מים ultrapure, ובנטילת ספקטרום ספיגת. השתמש בנפח נמוך, 100 קובט קוורץ μl להשיג ספקטרום ספיגת החלבון. בדרך כלל, ריכוז החלבון החי הוא בסדר גודל של 50 - 100 מיקרומטר.
    1. השתמש שיא 410 ננומטר האופייניים ג CYT לכמת את concentration באמצעות החוק בר-למברט עם ערך ספיג טוחן של 97.6 סנטימטר ^-1 מ"מ ^-1:
       A = ε × ג × ι
       כאשר A הוא ספיג, ε הוא הספיגות הטוחנת, c הוא ריכוז מ"מ, ו ι הוא הנתיב אורך קובט בסנטימטר ^13.
15. בשלב זה, לחלק את החלבון לתוך 1 aliquots מ"ל ולשמור קפוא ב -20 ° C עד שהם נחוצים. ג CYT אפשר להקפיא מופשר ללא אובדן של מבנה או תפקוד, אך מחזורים חוזרים יתחילו לפגל החלבון.
    הערה: חלבונים לסבול הקפאה בדרגות שונות. לדוגמא, חלבוני ניאון ירוקים ^5,9 לא צריך להיות קפוא, מאוחסנים במקום במקרר.

סינתזה 2. של ציטוכרום C Bioconjugates

1. ממיסים 0.9 מ"ג של רותניום (II) bisterpyridine maleimIDE (Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide, 0.975 μmol, 6 ושווי) ב 600 μl של אצטוניטריל.
   הערה: אם maleimide בשימוש הוא מסיס במים, להכין פתרון מניות במים במקום אצטוניטריל. חשוב עבור maleimide להיות מסיס למאגר התגובה. Dimethylsulfoxide, N, N -dimethylformamide, ו אצטוניטריל כולם נפוץ adjuvants כדי לסייע בפירוק של משקל מולקולרי נמוך ^12, לעתים קרובות המגיב maleimide הידרופובי.
2. הכן פתרון מאגר המכיל 100 מ"מ חיץ פוספט 100 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA, M _w = 292.24 g / mol), אשר כאשר מדולל ל 20 מ"מ הוא ב- pH 7. להוסיף נתרן הידרוקסידי מוצק עד EDTA נמס (כמה גרם בדרך כלל ) ולהתאים ל -7 pH.
3. ממיסים 2.87 מ"ג של טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine ⁽¹⁵ TCEP, M _w = 286.65 g / mol) ב 1 מ"ל של מים ultrapure להכין פתרון המניה 10 מ"מ. שלב זה הוא יבואנמלה על מנת להבטיח כי ציסטאין על החלבון מצטמצם לפני ומזומן maleimide צימוד ^15.
   הערה: פתרון מניות TCEP צריך להיות מוכן טרי עבור כל תגובה, כפי מגיבים זה רגיש שחרור משרות חמצונים בתמיסה מימית.
4. שלב 11.4 מ"ל מים ultrapure עם 3 מ"ל של 100 מ"מ פתרון פוספט / EDTA המניות צינור פלסטיק 50 מ"ל. כאשר מדולל יותר עם פתרונות מניות חלבון maleimide ריכוז החיץ יהיה 20 מ"מ.
   הערה: אם החלבון מתיוג הוא חלבון הטרנסממברני, להבטיח כי חומר ניקוי מתאים מתווסף למאגר כדי solubilize חלבון. אם חומר ניקוי אינו משמש החלבון הקרומי עלול לעורר לאט, אשר תשפיע באופן שלילי על תשואות תגובה. השתמש דטרגנט בכל השלבים לטיהור שלאחר מכן.
5. להוסיף 0.15 μmol (3 מ"ל של פתרון 50 מיקרומטר, 1 שווה ערך) של ג CYT מטוהרים למאגר פוספט-EDTA.
6. להוסיף 7.5 μl של solut המניות TCEPיון (0.075 μmol, 0.5 ושווי) לפתרון חלבון ולהשאיר ערבוב במשך 5 דקות כדי להפחית חלבון כלשהו שייתכן dimerized עקב חמצון ציסטאין.
   הערה: אל תוסיף TCEP אם החלבון של עניין לא dimerize בקלות. בדוק זאת על ידי הפעלת ג'ל חלבון בתנאים שאינם צמצום.
7. להוסיף 600 μl של פתרון אצטוניטריל של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide לפתרון מופחת, שנאגרו של ג CYT, ולהשאיר את ערבוב תערובת התגובה, בחושך, ב RT, למשך 24 שעות.
8. לרכז את תערובת התגובה באמצעות 3.5 מסננים ספין kDa MWCO, centrifuging ב 3,000 XG, לחזור 2-3 פעמים עם חיץ פוספט 20 מ"מ טריים עד תסנין פועל ברורה. סר כמו maleimide unreacted מתערובת התגובה ככל האפשר לפני השלב הבא של טיהור.
   הערה: בשלב זה, את תערובת bioconjugation הגולמית ניתן לאחסן במקרר, בחושך. חשוב להסיר צבע maleimide unreacted ידי centrifuge דיאליזה לפני אחסון כמו maleimide יכול לאט nonspecifically להגיב עם שאריות ליזין על פני השטח של החלבון.

טיהור 3. Bioconjugates ציטוכרום C

1. ממיסים 2.4 גרם של פוספט dihydrogen נתרן 29.22 גרם של נתרן כלורי ב 1 ליטר של מים ultrapure להכין פתרון מאגר המכיל 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ ו 0.5 M NaCl. זהו למאגר פועל עבור כרומטוגרפיה מתכת-זיקה משותקת (IMAC) טיהור.
2. ממיסים 17 גרם של imidazole (M _w = 68.077 גרם mol ^-1) ב 500 מ"ל של 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ ו 0.5 חיץ M NaCl. זהו חיץ elution לטיהור IMAC.
3. התאם את ה- pH של שני מאגרי pH 7 באמצעות 1 M NaOH או HCl, ולסנן אותם דרך 0.22 מיקרומטר ממברנות תאית מחדש לפני השימוש ב FPLC.
4. כמו העמודות IMAC שנרכשו נשלחות ללא יונים של מתכות הועמסו על colטור ה, להכין את העמודה במשך טיהור Ni ^{2 +} מבוססת ידי שטיפת הטור עם 3 מיליליטר מי ultrapure, 3 מיליליטר של תמיסה יצטט ניקל 100 מ"מימ, ו -6 מיליליטר מי ultrapure. אם העמודה אינה לשמש מיד לשטוף באמצעות 3 מ"ל של 20% אתנול ו לאחסן בעמודה במקרר כדי למנוע התפתחות חיידקים.
5. צרף Ni ^{2 +} -loaded 1 מיליליטר טור IMAC אל FPLC בין לולאת הזרקת גלאי Vis-UV.
6. לאזן את העמודה עם 3 כרכים הטור של פוספט 20 מ"מ, 0.5 חיץ M NaCl באמצעות קצב הזרימה של 0.5 mL / min.
7. טען 100 μl של תערובת התגובה גולמי (מסוננים דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר) על הטור Ni ^{2 +} IMAC. לשטוף את העמודה עם 3 כרכים הטור של הפעלת המאגר כדי elute ג CYT הלא הגיבו, ואחריו שיפוע imidazole מן 0 ל 125 מ"מ מעל 3 כרכים עמודה כדי elute את bioconjugate ג bisterpyridine-ציטוכרום רותניום (Ru (II) -cyt ג) .
8. שטפו את גolumn עם חיץ imidazole 250 מ"מ עבור 5 כרכי עמודה, ולאחר מכן מחדש לאזן את העמודה עם 20 פוספט מ"מ, 0.5 M NaCl וחזרו על שלב 3.7 עד שכל bioconjugate הגולמי טוהר.
9. פינת שברי bioconjugate ולרכזם באמצעות מסנן ספין 3.5 kDa MWCO, centrifuging ב 3,000 x ז.
10. טען את bioconjugate מרוכז לתוך 3.5 קלטות דיאליזה kDa MWCO ו dialyze נגד במים למשך הלילה ultrapure, עם 2 שינויים של מים.
11. קבע את הריכוז של פתרון bioconjugate הטהור, מרוכז על ידי UV-Vis, באמצעות אותו ערך ספיג טוחן כמו ציטוכרום C iso-1 (97.6 מ"מ ^{-1 -1} סנטימטר) ב -410 ננומטר. בדרך כלל, ריכוז bioconjugate הוא בסדר גודל של 50 - 100 מיקרומטר.
12. מחלקים את bioconjugate לתוך 25 aliquots μl ולשמור קפוא ב -20 ° C עד שהם נחוצים.

אפיון 4. Bioconjugates ציטוכרום C

1. להרתיעmination המסה bioconjugate ידי MALDI-TOF MS
   1. ממיסים 10 מ"ג של חומצה caffeic ב 1 מ"ל של פתרון חומצה אצטוניטריל / מים / trifluoroacetic (80: 20: 0.1, נ / V / V).
   2. לדלל 5 μl של פתרון חלבון מרוכז עם 5 μl של פתרון חומצה caffeic.
   3. ספוט 0.5 μl של פתרון חומצה caffeic על הצלחת היעד MALDI ולאפשר פתרון להתייבש.
   4. ספוט 0.5 μl הפתרון מדגם / מטריקס על גבי כתם חומצה caffeic זה, לאפשר במקום להתייבש. ספוט אחר 0.5 μl של מטריקס מדגם על גבי זה כדי "כריך" המדגם בין שכבות של מטריקס, ולאפשר לו להתייבש.
   5. רוכשת ספקטרה המונית במצב ליניארי באמצעות גדרות מכשיר מתאימות חלבונים ^16.
2. חקירת bioconjugates ידי ג'ל אלקטרופורזה
   1. כן 10 μl של כל דגימת חלבון שיופעלו על ידי דילול דגימות חלבון עם סולפט dodecyl ליתיום premixed (LDS, pH 8.4) חיץ (4x) tOA ריכוז סופי של כ 20 מיקרוגרם לכל טוב. עבור בארות הדורשים הפחתת התנאים, להוסיף 1 μl של 500 מ"מ dithiothreitol (DTT) צמצום סוכן (10x).
   2. דגימות מחממים על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   3. הוסף 50 מ"ל של מעורבבים מראש 1 M MES, 1 בסיס M טריס, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7.7) פועל תערובת חיץ (20x) ממקור מסחרי עד 950 מ"ל מים ultrapure להכין למאגר פועל ג'ל.
   4. הסר את מסרק פלסטיק מן הג'ל ומניחים את הג'ל בתוך הטנק פועל ג'ל. מלא את המכל עם חיץ ריצת ג'ל כך הבארות מכוסות חיץ.
   5. דגימות טענו בזהירות על טרומיים 12% Bis-טריס, 1 מ"מ, 10-גם ג'ל באמצעות טיפי פיפטה ארוכים כדי לסייע טעינה. טען את סמן משקל מולקולרי 10 חלבון prestained (3-188 KDA) לתוך באר באמצע ג'ל לסייע ניתוח.
   6. הפעל את הג'ל על 200 V מתח קבוע במשך 35 דקות.
   7. הכתם ג'ל עם פתרון כחול מסחרי Coomassie עבור שעה 2, ולשטוף עם ultrapמים יור במשך 48 שעות.
3. קביעת טוהר bioconjugate ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis
   1. הכן 120 μl של 5 מיקרומטר פתרונות של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide, ג CYT iso-1, ו Ru (II) ג -cyt.
   2. מדוד את ספקטרום הבסיס של קובט קוורץ המכיל מים ultrapure רק, החל מ -250 ננומטר ל -650 ננומטר.
   3. מדוד את הספקטרום של כל רכיב, הבטחת קובט היא שטף מיובשת בין כל מדידה.
   4. מגרש את הספיגה של כל רכיב כפונקציה של אורך גל, ולהשוות את הסכום ליניארי של חומרים המוצא עם המוצר הסופי כדי לקבוע אם יחס של 1: 1 של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide ג CYT הגיב.

תוצאות

הסינתזה של bioconjugates אושר על ידי שלוש שיטות עיקריות: זמן יינון Desorption לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה טיסה (MALDI-TOF MS), ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide, ו-סגול-גלוי (UV-Vis) ספקטרוסקופיה, כפי שמוצג איורים 2, 3 ו -4. עלייה מונית המתאימה המסה של ה...

Discussion

טיהור של חומרים החל לפני bioconjugation הוא בעל חשיבות עליונה. חלבונים שהושגו ממקורות מסחריים רקומביננטי בדרך כלל מכילים isoforms אחר של החלבון של עניין, אשר יכולה להיות כימית תגובתיות משטח שונה. לדוגמא, ב bioconjugation המתואר, ג CYT הזמין המסחרי מכיל תערובת של שניהם ^12,14,17 ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 ml strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 ml IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	Extremely corrosive! Use caution.
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette