Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

Özet

Bu protokol, reaktif saflaştırma, reaksiyon koşulları, Bioconjugate saflaştırma ve Bioconjugate karakterizasyonu dahil olmak üzere, bir maleimid proteini ihtiva eden bir sisteinin bioconjugation için gerekli olan önemli adımlar göstermektedir.

Özet

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Giriş

Bioconjugation kovalent bir boya, bir ilaç veya bir polimer gibi bir sentetik molekülü bir ya da sadece bir biyomolekülün bağlantı içerir. Protein bioconjugation yöntemleri artık yoğun protein yapma, floresan boya etiketleme ^1,2 arasında değişen uygulamalarla birçok kimya, biyoloji ve nanoteknoloji araştırma gruplarında kullanılan (antikor) ³ (antikor ilaç konjugatları - ADK) -prodrugs protein dimerleri ^4,5 sentezini , nanotıp ⁸ ve sistemler kimya ⁹ kullanılan kendinden montaj protein polimer melezler ^6,7 kadar.

kimya Özelliği, her zaman kritik olmasa da, hedef proteinin aktif site ile müdahale etmeyecek şekilde, en fonksiyonel proteini biyokonjugatlar için büyük önem taşımaktadır, bioconjugation kullanılır. Ilgilenilen protein i) hedefleme nadir veya benzersiz siteler: İdeal bioconjugation reaksiyonu da dahil olmak üzere, çeşitli kriterleri yerine getirmek gerekiyorii) iii) açılımı protein önlemek için denatüre edici olmayan koşullar altında devam, bu hedefe yönelik seçici olmak ve hedef protein genellikle alt milimolar konsantrasyonda kullanılabilir olarak iv) yüksek verimli olacak. Maleimid - sistein Michael katılması, tüm bu kriterlere uygun yakın geliyor ve bu nedenle uzun Bioconjugate Chemistry ¹⁰ alanında özel bir statüye iddia için vardır. i) kendi yüzeyi üzerinde tek bir sistein kalıntısı ihtiva eden bir çok protein, genetik doğru pH Reaksiyon sistein karşı yüksek oranda seçicidir ii) vardır tasarlanmış olabilir, çünkü bu, iii), sulu tamponlar içinde düzgün bir şekilde devam eder ve iv) çok hızlıdır bazı durumlarda, ¹¹ 5000 ^{M-1 sn-1} aşan bildirilmiştir sistein içeren proteinlere maleimid ikinci dizi oranı sabiti ile. ¹² ilgilenilen protein organik bir küçük (≈% 5-10) miktarı tolere edebilir sağlanan eş-çözücü, hemen hemen her maleimid fonksiyonlu boya, polymer, yüzey veya başka bir protein, protein ile bağlantılı olabilir. Buna ek olarak, maleimitler, yüksek pH diğer nükleofillerle reaksiyona daha yatkındır iyodoasetamid, daha proteinler üzerinde sistein daha özel olarak; ve disülfid değişim ¹³ önlemek için asidik pH değerinde tutulması gerekir disülfid tabanlı çekimleri daha kararlı.

Burada, bir Ru (ll) tabanlı kromofor ve örnek olarak redoks proteini sitokrom c arasındaki reaksiyonu kullanarak tek bir sistein kalıntısı ihtiva eden bir proteine ​​maleimid işlevselleştirilmiş moleküllerin bağlanması için genel bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, erişilebilir bir yüzeye sistein kalıntısı ve karşılık gelen maleimid-işlevselleştirilmiş bir hedef içeren, başka proteinler için de geçerlidir, bu bir protein, bir floresan boya, bir kromofor veya sentetik polimer.

Protokol

Not: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, aşağıdaki protokolü, bir protein-boya Bioconjugate sentezi için tasarlanmıştır notları yerleştirilmiş membran protein ile yardımcı olmak için durumlarda bu, serbest yüzey sistein ihtiva eden proteinlerle bir maleimid reaksiyonu için genel bir protokoldür. Bioconjugatlar protein polimer Bioconjugatlar ve sentetik protein dimeri (protein-protein) Bioconjugatlar. Bu özel durumda, protein izo-1 sitokrom C yüksek ölçüde özel bir işaretleme meydana sağlar tepkimeye uygun bir yüzey sistein artığı bulunur. ilgi konusu bir protein çoklu sisteyin artıkları ihtiva ediyor ise, aynı protokol özgüllük ve ürün homojenliği kaybı olsa geçerlidir. Özgüllük gerekli değilse N -hydroxysuccinimidyl esterleri ya da izotiosiyanatlar kullanılarak Kimya hedefleme yüzeyi lisin artıkları, daha basit bir yaklaşım olabilir.

Şekil 1 Bioconjugation Reaksiyon Şeması. Örnek durumda, hafif hasat olarak rutenyum esaslı bir anteni molekülü (CYS102) rutenyum esaslı bir anteni molekül üzerinde bir asılı maleimid ve açık bir sistein kalıntısının Michael ilave edilerek sitokrom c bağlı olacaktır protein. Cyt c yüzeyinin kırmızı alan heme grubu gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sitokrom c 1. Saflaştırma

Not: Bu adım, tüm proteinlerin için geçerli değildir. Bununla birlikte, ticari bir kaynaktan elde edilen bir protein, bir daha arıtılmadan ¹³ çıkarılabilir gereken diğer istenmeyen protein izoformları içeren olduğunu bilmek önemlidir.

1. Pr ultra saf su, 1 L (= 120 g ^mol-1 _W E) sodyum dihidrojen fosfat 2.4 g çözülür20 mM NaH ₂ PO ₄ ihtiva eden bir tampon çözelti epare. pH 7-1 M NaOH ile pH ayarlayın.
   Not: Bu protokolde kullanılan fosfat tampon her gün taze olarak hazırlanmıştır, ve kullanımdan önce 0.2 um'lik bir selüloz zar filtresi gerekir.
2. 20 mM NaH ₂ PO ₄ ve 1 M NaCl tampon yapmak için sodyum klorid 29.22 gramını _(ağırlık M = 58.44 g ^mol-1), 20 mM NaH ₂ PO ₄ tampon, 500 ml içinde çözülür. Bu adım 1.6) 'de arıtma için elüsyon tamponudur.
3. PH 7 20 mM fosfat tamponu içinde 6 ml liyofilize sitokrom c (cyt c) 12.0 mg eritin.
4. Ayrıca, bir 1 M stok çözelti hazırlamak için ultra saf su 95,3 ul ditiyotreitol 14.7 mg (DTT, _B, E = 154,25 g / Mol) çözülür.
   Not: bu madde, sulu çözelti içinde oksidatif deaktivasyon duyarlı olduğu gibi DTT stok çözeltisi taze hazırlanmalıdır.
5. ölmekProtein çözeltisi içine 1 M DTT çözeltisi 60 ul ette Cyt c azaltır. çözeltinin renk karıştırma üzerine ışık kırmızı koyu kırmızı değişecektir.
6. Herhangi bir kromatografik ortama enjekte etmeden önce 0.22 mikron düşük protein bağlayıcı PVDF şırınga filtresi aracılığıyla azaltılmış protein çözüm Filtre.
7. enjeksiyon döngüsü ve Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) aletin UV-Vis detektörü ile 3.3 ml güçlü katyon değişim sütunu takın.
8. 1 ml / dk'lık bir akış oranı kullanılarak, 20 mM pH 7 fosfat tamponunun 3 sütun hacim ardından ultra saf su, 3 kolon hacminde ile sütun dengelenmesi.
9. Yük 1 enjeksiyon döngü içine indirgenmiş ham cyt c ml ve 328 bir degrade yöntemi başlatmak - 5 sütun hacmi üzerinde 450 mM NaCl,. UV-Vis dedektör 280 nm ve 410 nm kanalı izlemek, ve en büyük zirve toplamak.
10. iso-2 sitokrom Zehir 1 M 2 kolon hacmi tuz konsantrasyonunu arttırmakE, C ve sütun boşaltılan sonra, aşağıdaki ham kısım enjekte edilmeden önce fosfat tampon 20 mM 2 sütun hacmi ile sütun yeniden dengeye.
11. tüm ham protein saflaştırılmış kadar tekrarlayın 1.9-1.10 adımları.
12. izo-1 ihtiva eden fraksiyonlar bir havuz ve 3.5 kDa moleküler ağırlık cutoff değeri (MWCO) sıkma filtre kullanılarak ve 3,000 x g de santrifüj bunları konsantre edin.
13. 3.5 kDa MWCO diyaliz kasetleri içine konsantre protein yükleyin ve su 2 değişikliklerle, ultra saf su bir gecede karşı dialyze.
14. 10 ul alan, aşırı saf su ile 100 ul'ye seyreltilmesi, ve absorbans spektrumunun alınarak saf, konsantre protein çözeltisi konsantrasyonunu belirlemek. Düşük hacim kullanın, 100 ul kuvars küvet protein emme spektrumları elde etmek. 100 uM - Tipik olarak, seyreltilmemiş protein konsantrasyonu 50 mertebesindedir.
    1. Concentratio ölçmek için Cyt c karakteristik 410 nm tepe kullanınn 97.6 cm ^-1 mM ^-1 molar absorptivite değeri Beer-Lambert yasası kullanılarak:
       A = ε × c × ι
       Bir emme olduğu, ε molar emicilik, Cı mM konsantrasyonu, ve ι cm ¹³ küvetin yolu uzunluğudur.
15. Bu noktada, 1 mL alikotlara protein bölmek ve gerekli olana kadar -20 ° C'de dondurulmuş tutun. Sit c dondurulmuş ve yapı ya da fonksiyon kaybı olmadan çözülmüş, ancak tekrar döngüleri proteinin denatüre başlayacak edilebilir.
    Not: Proteinler farklı derecelerde dondurma tahammül. Örneğin, ^5,9 dondurulamaz yeşil floresan protein yerine bir buzdolabı içinde depolanmıştır.

Biyokonjugatlar c Sitokrom 2. Sentezi

1. rutenyum 0.9 mg çözülür (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (TPY) ₂ -maleimid, 0.975 umol, 6 eşdeğer) ihtiva eden bir 600 ul.
   Not: kullanılan maleimid suda çözünür ise, su yerine asetonitril içinde bir stok çözeltisi hazırlanır. maleimid reaksiyon tamponu çözünür olması çok önemlidir. Dimetilsülfoksid, N, N-dimetilformamid ve asetonitril tüm yaygın düşük moleküler ağırlık ^12, genellikle hidrofobik maleimid reaktiflerin çözünmesine yardımcı olmak için yardımcı maddeler kullanılmaktadır.
2. 20 mM'ye seyreltilmiş EDTA çözünene kadar, tipik olarak (birkaç gram katı sodyum hidroksit ilave pH 7 olan 100 mM fosfat tamponu ve 100 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA, _Mw = 292,24 g / mol) ihtiva eden bir tampon çözeltisi hazırlayın ) ile pH 7'ye ayarlanır.
3. (286,65 g / Mol _w = TCEP ^15, m), aşırı saf su, 1 ml bir 10 mM stok çözelti hazırlamak için tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür 2.87 mg çözülür. Bu adım ithalatAnt protein sistein tam ¹⁵ bağlanması maleimide önceden indirgenmiş olduğundan emin olmak için.
   Not: bu madde, sulu çözelti içinde oksidatif deaktivasyon duyarlı olduğu TCEP stok çözeltisi, her bir reaksiyon için, taze hazırlanmalıdır.
4. 50 ml'lik plastik bir tüp içinde 100 mM fosfat / EDTA stok çözeltisi 3 ml ultra saf su 11,4 ml birleştirin. Protein ve maleimid çözeltisi ile, daha da seyreltildi zaman tampon konsantrasyonunun 20 mM olacak.
   Not: etiketlendikten protein, bir trans membran proteini olup, uygun bir deterjan proteini çözünür hale getirmek için tampona eklenir sağlamak. bir deterjan kullanılmazsa zar proteini yavaş olumsuz reaksiyon verimlerini etki edecek ve, hızlandırabilir. Sonraki tüm saflaştırma aşamaları deterjan kullanın.
5. Fosfat-EDTA tampon maddesi ile arıtılmış, Cyt c 0.15 umol (50 uM çözelti 3 ml, 1 eşdeğer) eklenir.
6. TCEP stok SOLUT 7.5 ul ekleyinprotein çözeltisi iyon (0.075 umol, 0.5 eşdeğer) ve sistein oksidasyon nedeniyle dimerize olabilir herhangi bir protein azaltmak için 5 dakika boyunca karıştırıldıktan bırakın.
   Not: İlgili protein kolayca dimerize yoksa TCEP katmayın. indirgeyici olmayan koşullar altında, bir protein jeli çalıştırarak kontrol edin.
7. 24 saat süre ile, oda sıcaklığında, karanlıkta, Ru (II) (TPY) Cyt c düşük tamponlu solüsyona ₂ -maleimid asetonitril çözeltisi 600 ul ekleyin ve reaksiyon karışımı, karıştırma bırakın.
8. 3.5 kDa MWCO döndürme filtreleri kullanarak reaksiyon karışımının, 3000 xg'de santrifüj süzüntü berrak bitene kadar taze 20 mM fosfat tamponu ile 2-3 kez tekrar konsantre. arıtılmadan bir sonraki aşamada önce mümkün olduğu reaksiyon karışımından kadar tepkimemiş maleimid çıkarın.
   Not: Bu noktada ham bioconjugation Karışım, karanlıkta, buzdolabında saklanabilir. Centr ile reaksiyona girmeyen maleimid boya kaldırmak için önemlidirdepolamadan önce diyaliz ifuge maleimid yavaş olması ve spesifik olmayan protein yüzeyi üzerinde lizin kalıntıları ile reaksiyona girebilir.

Sitokrom c Bioconjugatlar 3. saflaştırılması

1. 20 mM NaH ₂ PO ₄ ve 0.5 M NaCl içeren bir tampon çözeltisi hazırlamak için, sodyum dihidrojen fosfat 2.4 g ve ultra saf su, 1 L sodyum klorür 29.22 g çözündürülür. Bu hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) saflaştırma için çalışan tampondur.
2. Imidazol 17 g _(ağırlık M = 68,077 g ^mol-1), 20 mM NaH ₂ PO ₄ ve 0.5 M NaCl tampon 500 ml içinde çözülür. Bu IMAC arıtma için elüsyon tamponu olduğunu.
3. 1 M NaOH veya HCI kullanılarak pH 7'ye Her iki tampon maddesi pH ayarlama, ve FPLC kullanılmadan önce 0.22 um rejenere selüloz membranlar yoluyla filtre.
4. Satın alınan IMAC sütun col yüklenen herhangi bir metal iyonları olmadan sevk edilir olarakUMN, ultra saf su 3 ultra saf su ml, 100 mM nikel asetat çözeltisi, 3 ml ve 6 ml ile yıkanması ile Ni2 ⁺ merkezli saflaştırılması için kolon hazırlanmıştır. Kolon hemen kullanılmak üzere değilse% 20 3 ml etanol ile yıkama ve bakteri büyümesini engellemek üzere buzdolabı içinde sütun saklayın.
5. Bir Ni ²⁺ enjeksiyon döngü ve UV-Vis dedektör arasındaki FPLC 1 ml IMAC sütunu -yüklü takın.
6. 20 mM fosfat, 3 kolon hacminde, 0.5 ml / dakika bir akış oranı ile 0.5 M NaCl tampon madde ile sütundan dengelenmesi.
7. Yük Ni2 ⁺ IMAC kolonu (0.22 um'lik bir şırınga filtreden filtre) ham tepkime karışımından 100 ul. Rutenyum bisterpyridine-sitokrom C biokonjugatlannı elüte etmek için 125 mM 3 üzerinde sütun hacim 0 ilâ bir imidazol gradyanı, ardından reaksiyona girmemiş Cyt c elüt edilmesi için çalışan tampon, 3 kolon hacminde ile kolon yıkaması (Ru (II) '-cyt c) .
8. C yıkamaTüm ham Bioconjugate saflaştırılmıştır kadar olumn 5 kolon hacmi için 250 mM imidazol tampon maddesi ile, daha sonra 20 mM fosfat, 0.5 M NaCl ve adımı tekrar 3.7 ile kolon yeniden dengeye.
9. Bioconjugate kesirler havuzu ve 3.000 x g santrifüj, 3.5 kDa MWCO döndürme filtresi kullanarak konsantre.
10. 3.5 kDa MWCO diyaliz kasetleri içine konsantre biokonjugatlannı yükleyin ve su 2 değişikliklerle, ultra saf su bir gecede karşı dialyze.
11. Izo-1 sitokrom c ile aynı molar absorptivitesi değerini kullanarak, UV-Vis saf, konsantre edildi Bioconjugate çözeltisinin konsantrasyonu belirlemek (97.6 ^{mm-1 cm-1)} 410 nm'de. 100 mcM - Tipik olarak, Bioconjugate konsantrasyonu 50 mertebesinde olduğunu.
12. 25 ul kısma biokonjugatlannı bölün ve ihtiyaç duyulan kadar -20 ° C'de dondurulmuş tutun.

Sitokrom c Bioconjugatlar 4. Karakterizasyonu

1. caydırmak-TOF MS tarafından Bioconjugate kütlesinin ermesi
   1. bir asetonitril / su / trifloroasetik asit çözeltisi, 1 ml kafeik asit, 10 mg çözülür (80: 20: 0.1, v / v / v).
   2. kafeik asit çözeltisi 5 ul derişik protein çözeltisi 5 ul seyreltilir.
   3. Nokta 0.5 MALDI hedef plaka üzerine kafeik asit çözeltisi ul ve çözüm kurumasını bekleyin.
   4. Nokta 0.5 Bu kafeik asit yerinde üstündeki numune / matris çözümü ul, spot kurumasını bekleyin. "Sandviç" matris katmanları arasındaki numunenin bu üstündeki numune matris başka 0.5 ul nokta ve kurumasını bekleyin.
   5. Proteinlerin ¹⁶ için uygun olan alet ayarları kullanılarak lineer şekilde kütle spektrumları elde edin.
2. Jel elektroforezi ile biyokonjugatlar incelenmesi
   1. Her protein örneğinin 10 ul önceden karıştırılmış lityum dodesil sülfat (LDS, pH 8.4) tamponu (4x) t ile protein örneklerinin seyreltilmesi tarafından çalıştırılacak hazırlayıned oyuk başına yaklaşık 20 ug nihai konsantrasyon. indirgeyici koşullar gerektiren kuyuları, 500 mM ditiyotreitol (DTT) madde (10x) azaltmak için 1 ul ekle.
   2. 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısı örnekleri.
   3. Jel Yürütme tamponu hazırlamak için önceden karıştırılmış, 50 ml, 1 M MES, 1 M Tris baz,% 2 SDS, 20 mM EDTA (pH 7.7), ultra saf su 950 ml ticari bir kaynaktan tampon karışımı (20x) çalıştıran ekleyin.
   4. jelden plastik tarak çıkarın ve jel çalışan tankında jel yerleştirin. Kuyular tamponu ile kaplıdır, böylece jel çalışan tampon tankı doldurun.
   5. Numuneleri dikkatli bir şekilde prefabrik% 12 Bis-Tris üzerine, 1 mm boyunda, pipet uçları kullanılarak 10 oyuklu jel yükleme yardımcı olmak için. analiz yardım etmek için jel orta kuyuya prestained 10 protein moleküler ağırlık markerine (3-188 kDa) yükleyin.
   6. 35 dakika için 200 V sabit gerilimde jel üzerinde çalıştırıldı.
   7. 2 saat süre ile, ticari bir Coomassie mavisi solüsyonu ile jel leke ve ultrap yıkayın48 saat boyunca ure su.
3. UV-Vis spektroskopisi yoluyla Bioconjugate saflık tayini
   1. Ru (II) (TPY) ₂ -maleimid, izo-1 Cyt C ve Ru (II) '-cyt Cı 5 uM çözeltilerinin 120 ul hazırlayın.
   2. 250 nm 650 nm, tek ultra saf su içeren kuvars küvette bazal spektrumunu ölçün.
   3. Küvet durulandı ve her bir ölçüm arasında kurutulur sağlanması her bir bileşenin spektrumunu ölçün.
   4. Dalga boyunun bir fonksiyonu olarak her bir bileşenin absorbans Konu ve 1 belirlemek için nihai ürün ile başlangıç ​​malzemelerinin lineer bir miktar karşılaştırın Ru (II), (TPY) Cyt c ₂ -maleimid 1 oranında reaksiyona.

Sonuçlar

Biyokonjugatlar sentezi, üç ana yöntem ile teyit edilir: flight kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS), poliakrilamid jel elektroforezi Matris destekli lazer dezorpsiyon iyonizasyon süresi ve ultraviyole-Görünür (UV-Vis) spektroskopisi, Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3, 4. Ekteki küçük molekülün kütlesine karşılık gelen bir kütle artışı, ve reaksiyona girmemiş protein eksikliği Ru (II), başarılı bir şekilde ...

Tartışmalar

Bir bioconjugation önce başlangıç ​​malzemelerinin saflaştırılması büyük önem taşımaktadır. Ticari rekombinan kaynaklardan elde edilen proteinler, sıklıkla farklı yüzey kimya ve reaktiviteye sahip, ilgilenilen protein, diğer izoformları içerir. Örneğin, tarif edilen bioconjugation olarak, ticari olarak temin edilebilir Cyt Cı iki izo-1 ve izo-2 Cyt C ^12,14,17 oluşan bir karışımı içerir. İzo-2 ve izo-1 sitokrom c formları temel fark, izo-1 sitokrom...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	71496
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71691
sodium chloride	Sigma-Aldrich	73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	C2436
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
TSKgel SP-5PW	Sigma-Aldrich	Tosoh SP-5PW, 07161	3.3 mL strong cation exchange column
Amicon Ultra-15	Merck-Millipore	UFC900308	3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units	Thermo Scientific	66333	3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide	Lab made		see ref (14)
acetonitrile	Sigma-Aldrich	A3396
ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	93284
imidazole	Sigma-Aldrich	56749
nickel acetate	Sigma-Aldrich	244066
AcroSep IMAC Hypercell column	Pall	via VWR: 569-1008	1 mL IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter	Whatman	Z697958	47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter	Merck-Millipore	SLGV013SL	syringe filters for proteins
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84426	extremely corrosive! Use caution
caffeic acid	Sigma-Aldrich	60018	MALDI matrix
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707	extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain	Thermo Scientific	LC6060	Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel	Thermo Scientific	NP0342BOX	precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925	premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Scientific	NP0008	premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Scientific	NP0004	premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Scientific	NP0002	premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS	Applied Biosystems
Acta FPLC	GE		Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer	Varian-Agilent		UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser	Merck-Millipore		ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette	Hellma	105-201-15-40	100 microliter cuvette