عزل خلايا Mesangiogenic السلف (البلدان المتوسطية الشريكة) من نخاع العظام البشرية

Summary

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Abstract

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Introduction

خلايا انسجة الوسيطة (اللجان الدائمة) هي القيمة السريرية ذات الصلة لقدرة التمايز متعددة نسبهم وقدرتها على دعم تكون الدم، لإفراز عوامل النمو / السيتوكينات وكذلك تلعب دورا في يممونوريغولاتيون ^1. في تعريف إنتاج خلايا العلاجات القائمة MSC-والطلب قد يكون هدفا للالسريرية وما قبل السريرية بحث مستفيض ^2، مع إيلاء اهتمام خاص لتنظيم دولي محدد من أجل سلامة وفعالية الخلايا المنتجات الطبية (CBMP) العلاجات ³ شهادة. اللجان الدائمة الإنسان يتم تربيتها على نطاق واسع في وسائل الإعلام التي تحتوي على ملاحق والكواشف ذات الأصل الحيواني، مثل مصل الجنين البقري (FBS) والتربسين البقري. لذلك، جنبا إلى جنب مع مع المخاطر المعدية المرتبطة معالجة الخلية، والمرضى أيضا تواجه بريون التعرض فضلا عن المخاطر المناعية المرتبطة البروتينات والببتيدات أو غيرها من الجزيئات الحيوية من أصل حيواني يمكن أن تستمر بعد حصاد الخلايا وtransplanالكساء ^4.

للالتفاف على المشكلة، ونحن مثقف نخاع عظام بشرية (HBM) اللجان الدائمة -derived في المتوسط ​​خالية من الحيوانات، لتحل محل FBS مع المجمعة البشرية نوع AB مصل (PhABS). في ظل هذه الظروف، إلى جانب اللجان الدائمة المتزايد حددنا سكان الخلية الرواية. وكانت هذه الخلايا شكليا وظاهريا مختلفة من اللجان الدائمة وأظهرت لمحة التعبير الجيني المميز وكذلك المميزة خصائص النمو / الالتصاق. احتفظوا كلا mesengenic وعائية إمكانية وبالتالي سميت خلايا أرومية متوسطة السلف (البلدان المتوسطية الشريكة) ^5. وفي وقت لاحق، كنا قادرين على تحديد شروط ثقافة انتقائية وقابلة للتكرار لتوليد البلدان المتوسطية الشريكة في درجة عالية من النقاء ^6.

ونحن التحقيق كذلك الخصائص المورفولوجية والبيولوجية من البلدان المتوسطية الشريكة. أظهرت البلدان المتوسطية الشريكة أن تكون nestin إيجابية، وبطء في ركوب الدراجات، كي-67-سلبي، ومع الكروموسومات التي تتميز التيلومير طويلة ^5. وأعربوا عن plurعوامل النسخ المرتبطة ipotency-أكتوبر-4 و NANOG بدلا من لجنة السلامة البحرية المنظمين سيد Runx2 وSox9 ^7. ظاهريا، أعرب البلدان المتوسطية الشريكة endoglin (CD105) في مستوى أدنى من اللجان الدائمة في حين تفتقر علامات الوسيطة CD73، CD90، CD166. كما أظهرت البلدان المتوسطية الشريكة نمط مميز من جزيئات الالتصاق تتميز التعبير ثابت من PECAM (CD31)، integrins αL (CD11a)، αM (CD11b)، αX (CD11c و) وكذلك إنتغرين β2 (CD18) أن يديم على وجه التحديد تشبه الهياكل podosome ⁸ . في وسائل الاعلام التوسع MSC القياسية، البلدان المتوسطية الشريكة متباينة على وجه السرعة إلى اللجان الدائمة من خلال مرحلة وسيطة يضم تفعيل خلية Wnt5 / كالمودولين يشير ^9. كما احتفظ البلدان المتوسطية الشريكة خصائص عائية، كما يتبين من قدرتها على الانطلاق من الكروية في الفئران المصفوفة خارج الخلية (ECM) الثقافات البروتين 3D. وكان احتمال عائية فقدت بسرعة بعد التمايز لجنة السياسة النقدية على طول النسب mesengenic.

هنا نقدم محترفينtocols الأمثل لعزل وتوصيف البلدان المتوسطية الشريكة العالية النقاء من عينات الدم HBM. ويرد أيضا بروتوكولات استنساخه لجنة السياسة النقدية mesengenic والتمايز عائية.

Protocol

ملاحظة: بعد موافقة خطية، تم الحصول على عينات HBM خلال جراحة العظام لاستبدال مفصل الورك. مباشرة بعد العظم عنق الفخذ وقبل الفخذ التوسيع حقنة 20 مل تحتوي على 500 واجهة المستخدم من الهيبارين، وكان يستخدم لنضح BM جديدة. البروتوكول هو يعتبر قابلا للتطبيق على نطاق واسع إلى أي مصدر BM.

1. عزل العظام الإنسان خلايا نخاع وحيدات النوى (HBM-الشركات المتعددة الجنسيات)

1. تمييع 5-10 مل من BM الطازجة إلى 50 مل، وتطبيق الفوسفات محلول ملحي Dulbecco و(D-PBS) وتخلط بواسطة قلب. بالتساوي توزيع 25 مل في اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل جديدة، إضافة 25 مل من مد برنامج تلفزيوني على كل أنبوب ومزيج من قبل انقلاب.
2. السماح للأنابيب على الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، لفصل شظايا العظام المعدنية والدهون من الحل.
3. بعناية ازالة الدهون العائمة مع ماصة باستير وتصفية تعليق الخلية معقمة من خلال 70 ميكرون مرشحات من دون إزعاج جزء بيليه العظام المعدنية.
<لى> تعيين أربعة 50 مل الأنابيب مع 15 مل من المتوسط ​​لمتقطع الطرد المركزي التدرج الكثافة (1.077 غ / مل). تأكد من أن هذه الوسيلة هي في درجة حرارة الغرفة.
4. وضع بلطف 20 - 25 مل من BM المخفف على رأس متوسطة الكثافة التدرج. تنفيذ هذه العملية بعناية، والسماح ضئيل تعليق الخلية على الجدران أنبوب لمنع طبقات الاختلاط.
5. تنفيذ التدرج الكثافة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل تعطيل.
6. جمع عصابة بيضاء من الخلايا تقع بين المرحلتين باستخدام ماصة باستور معقمة وتحويلها إلى أنبوب 50 مل الطازجة.
7. غسل الخلايا مع مستنبت الطازجة: الفينول الحمراء الخالية، انخفاض الجلوكوز (1000 ملغم / لتر) Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، 10٪ (ت / ت) تجمع بشري نوع AB مصل (PhABS)، 2 مم L-الجلوتامين و المضادات الحيوية (DMEM / 10٪ PhABS). أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
8. طاف نضح وإعادة تعليق بيليه في 5-10 مل من DMEM الطازجة / 10٪ PhABS.
9. الشروع في عدد خلايا.تحديد عدد خلايا الدم البيضاء بنسبة 1: 1 في تخفيف التريبان. ينطبق هذا على عدادة الكريات، ومراقبة تحت المجهر النقيض من المرحلة. استبعاد كريات الدم الحمراء صغيرة ومستديرة تماما والخلايا الميتة ملطخة الزرقاء من عدد خلايا.
   ملاحظة: ينصح بشدة أن PhABS شاشة دفعات على أدائهم في الانتعاش لجنة السياسة النقدية. أعطت PhABS من مصادر الولايات المتحدة الأمريكية أفضل النتائج في حين نتج معظم الأمصال من أصل مختلف في الثقافات جنة السياسة النقدية بنسب أعلى من الخلايا MSC شبيهة.

2. عزل البلدان المتوسطية الشريكة من HBM-الشركات المتعددة الجنسيات

1. تعيين مسعور T-75 قوارير مع 15 مل من DMEM طازجة / 10٪ PhABS وترك الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة يوازن لما قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة.
2. البذور 4-6 × 10 ⁷ HBM-الشركات المتعددة الجنسيات في قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.
3. نضح وتجاهل الخلايا المتوسطة وغير ملتصقة من قوارير. إضافة 15 مل من DMEM / 10٪ PhABS الطازجة واحتضان عند 37 درجة مئويةفي 5٪ CO _2. الحفاظ على الثقافات ل6-8 أيام، وتغيير المتوسط ​​كل 48 ساعة.
   اختياري: لزيادة الغلة لجنة السياسة النقدية، والخلايا غير ملتصقة من 2.3 يمكن إعادة مطلي في قارورة ثقافة جديدة والمحافظة عليها كما هو موضح في الثقافات الأولية.
4. نضح وتجاهل متوسطة من قوارير، ويغسل مع DMEM جديدة وإضافة 2 مل من الحيوانات البروتيني مجانا فصل الحل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقائق (تجنب الحضانة لفترات طويلة).
5. إضافة 10 مل من جديد DMEM / 10٪ PhABS، نضح تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق
6. نضح وتجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1-2 مل من DMEM الطازجة / 10٪ PhABS. الشروع في عدد خلايا كما هو موضح في الخطوة 1.10.
   ملاحظة: لا تستخدم التربسين / EDTA كما فصل كاشف. البلدان المتوسطية الشريكة والتربسين مقاومة. فحص الصرفي من الثقافات، قبل الحصاد خلية، ينصح بشدة لتقييم وجود خلايا تشبه MSC على شكل مغزل. في حالة كمية كبيرة من خلايا MSC-كما هي دetected، وزيادة نقاء المنتج الخلية عن طريق إزالة انتقائي الخلايا الملوثة. للقيام بذلك، يمكن أن يتم التربسين الهضم من قبل الحصاد لجنة السياسة النقدية، وذلك بإضافة 2 مل من التربسين / EDTA 0.05٪ لمدة 2 دقيقة. غسل الثقافات مرتين مع 5 مل من DMEM / 10٪ PhABS، ثم الانتقال إلى البروتيني العلاج على النحو الوارد أعلاه.

توصيف 3. خلية

1. التدفق الخلوي
   1. إعداد عينات مزدوجة من 10 ⁵ خلايا منفصلة حديثا في حل الغسيل: D-PBS تستكمل مع 0.5٪ (ت / ت) زلال المصل البقري (BSA) و 0.02٪ (ث / ت) أزيد الصوديوم. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
      تنبيه: أزيد الصوديوم السامة.
   2. اعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من محلول الغسيل وإضافة مكافحة CD90، ومكافحة CD45، ومكافحة CD73 والأجسام المضادة-CD31 مترافق مع الأصباغ الفلورية ( "اختبار")؛ في موازاة إعداد الضوابط نمط إسوي ( "CTRL").
      وينبغي أن تحدد المبالغ من تلطيخ الأجسام المضادة من قبل المعايرة أو أكور ملاحظة:دينغ لتعليمات الشركة الصانعة.
   3. احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل والحصول على ما لا يقل عن 5 × 10 ⁴ أحداث على تدفق متعدد الألوان الكريات ^{7 9 10.}
   5. تحليل النتائج وفقا لالدوت المؤامرات واستخدام "CTRL" الأحداث المسجلة لتحديد أجزاء.
      ملاحظة: من أجل تحديد ثقافة كثقافة لجنة السياسة النقدية يجب أن تكون نسبة CD73 CD90 ^{NEG NEG} CD45 ⁺ CD31 ⁺ الخلايا أكثر من 95٪. بالنسبة لبعض تطبيقات محددة، أي تحليل التعبير الجيني، واستعادة قطع لابد من زيادة إلى 97-98٪.
2. كشف Nestin وتحليل منظمة F-أكتين
   1. لوحة البلدان المتوسطية الشريكة المعزولة حديثا على الشرائح غرفة الثقافة (20000 / سم ^2). السماح للخلايا الالتزام من قبل الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
   2. غسل الخلايا في محلول الغسيل وفايس في 4٪ (ث / ت) شبه الفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لإزالة تثبيتي إضافة محلول الغسيل واحتضان لمدة 2 دقيقة وتصب.
   3. تكرار غسل مرتين.
   4. Permeabilize الخلايا في مد برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.05٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 15 دقيقة في RT.
   5. وقف رد فعل من البروتين محسن المجانية إشارة (30 دقيقة في RT) أو عرقلة الحل القياسية (D-PBS تستكمل مع 3٪ (ث / ت) BSA).
   6. إزالة إشارة محسن / عرقلة الحل.
   7. إضافة 7 ميكروغرام / مل (ث / ت) من الأجسام المضادة الأولية nestin مكافحة الإنسان واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل في غرفة ترطيب. في موازاة ذلك، استخدام الأجسام المضادة السيطرة إسوية النمط لتقييم إشارات مضان لم محددة.
   8. تغسل شرائح بإضافة مد برنامج تلفزيوني، وترك لمدة 2 دقيقة وتصب. كرر مرتين.
   9. إضافة 2 ميكروغرام / مل (ث / ت) من صبغة الفلورسنت الضد الثانوية مترافق واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الظلام.
   10. غسل الشرائح على النحو الوارد أعلاه.
   11. إضافة Phalloidin فلوري (5 UI / مل)، وترك في RT لمدة 30 مفي في الظلام ويغسل 3 مرات في مد برنامج تلفزيوني.
   12. إزالة جدران الغرفة وجبل الشرائح في وسط تصاعد مائي تستكمل مع antifade الكاشف و 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) للكشف نوى. الشروع في تصوير ^{7 9 10.}

4. Mesengenic تمايز البلدان المتوسطية الشريكة

1. لوحة 2 × 10 ⁴ / سم ² البلدان المتوسطية الشريكة المعزولة حديثا في قوارير ثقافة T75 تعامل TC-والسماح الخلايا على الالتصاق بين عشية وضحاها في DMEM / 10٪ PhABS عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
2. استبدال DMEM / 10٪ PhABS مع مستوى انخفاض المتوسطة في الدم، وحوالي 200 ميكرولتر / سم ^2، والمصممة لتوسيع الخلية الوسيطة اللحمية (MSC-RS المتوسطة). تنمو الخلايا لالتقاء (P1-اللجان الدائمة)، وعادة 7-10 أيام من تحريض. تحديث المتوسطة كل أيام 2.
3. نضح وتجاهل متوسطة من قوارير، ويغسل الطازجة المتوسطة MSC-RS وإضافة 2 مل من الحيوانات البروتيني مجانا فصل الحل. في احتضان 3776؛ مئوية لمدة 5-15 دقائق (تجنب الحضانة لفترات طويلة).
4. إضافة 10 مل من الطازجة المتوسطة MSC-RS، نضح تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق
5. طاف نضح وإعادة تعليق بيليه في 1-2 مل من الطازجة المتوسطة MSC-RS. الشروع في عدد خلايا كما هو موضح في الخطوة 1.10
6. انتقل إلى ثقافة فرعية لهم من قبل البذر 3-5 × 10 ³ خلية / سم ^2. تنمو الخلايا لالتقاء (P2-اللجان الدائمة).
7. خلايا الحصاد عن طريق الهضم البروتيني كما هو موضح من الخطوة 4.3 إلى الخطوة 4.5، والشروع في توصيف كما هو موضح في القسم 3.
   ملاحظة: سيكون هناك نسبة من CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 الخلايا ^NEG CD31 ^NEG أقل من 95٪ إلى التفاضل الجزئي فقط ويتطلب مرور مزيد من الثقافة.
8. لوحة P2-اللجان الدائمة في 2 × 10 ⁴ / سم ² في ست لوحات TC-معاملة جيدة وتنمو لالتقاء في وسط MSC-RS.
9. علامة بئرين بأنه "لا الفرق" وتحديث المتوسطة MSC-RS.
10. علامة اثنين جيدابأنها "أستيو" واستبدال المتوسطة مع 200 ميكرولتر / سم ² متوسطة عظمي المنشأ القياسية، التي صممت خصيصا لMSC التمايز.
11. علامة بئرين ب "Adipo" واستبدال المتوسطة مع 200 ميكرولتر / سم ² متوسطة مكون الشحم القياسية، التي صممت خصيصا لMSC التمايز.
12. الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ عن طريق تغيير وسائل الإعلام كلها كل 48 ساعة.
    ملاحظة: من المستحسن بشدة لاستخدام القياسية وسائل الاعلام التفريق المتاحة تجاريا لاختبار التكاثر. بعد 2/3 أسابيع في ظل ظروف التفريق، تظهر رواسب الكالسيوم في عظمية يسببها الثقافات، في حين أن تراكم قطرات الدهون داخل الخلايا هو واضح في الخلايا مكون الشحم التي يسببها.
13. نضح وتجاهل وسائل الإعلام ثقافة ثم يغسل مع مد برنامج تلفزيوني.
14. إصلاح الثقافات عن طريق إضافة 1 مل من 4٪ (ث / ت) شبه الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
15. لإزالة تثبيتي إضافة مد برنامج تلفزيوني، احتضان لمدة 2 دقيقة وتصب. تكرار الغسيلمرتين.
16. وصمة عار واحد "لا الفرق" جنبا إلى جنب مع "أستيو" اثنين ملحوظ الآبار في حل الفلورسنت محدد هيدروكسيباتيت واحدة "لا الفرق" جنبا إلى جنب مع اثنين من "Adipo" تميز الآبار في 200 نانومتر حل النيل الأحمر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ^11،12.
17. إزالة تلطيخ الحلول ويغسل في مد برنامج تلفزيوني مرتين.
18. تستكمل إزالة مد برنامج تلفزيوني، إضافة مد برنامج تلفزيوني مع 50٪ (V / V) الجليسرين، والشروع في التصوير ^{7 9 10.}

5. لجنة السياسة النقدية الجسم الشبه الكروي الإيراق الفحص

1. لإنتاج الأجسام الشبه الكروية 3D، وضع 20 قطرات ميكرولتر من تعليق لجنة السياسة النقدية المعزولة حديثا (1.5 × 10 ⁴ خلايا / قطرة) على السطح الداخلي للغطاء طبق بيتري.
   ملاحظة: كما تناول قطرات يمكن أن يؤدي إلى تمزق، فمن المفضل جدا لوضعهم في الزائدة.
2. بعناية استخدام غطاء لخلاصة طبق بتري تحتوي على مد برنامج تلفزيوني لمنع شنقا قطرات التبخر. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂بين عشية وضحاها للسماح للخلايا لتجميع في الكروية 3D.
3. وضع هلام سميكة من البروتينات الفئران المصفوفة خارج الخلية (ECM) وذلك بإضافة 300 مكل من البروتينات ECM القياسية في لوحة الثقافة 24-جيدا المبردة مسبقا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. تلميح بعناية على طبق بتري غطاء واختيار بلطف حتى الكروية باستخدام ماصة باستير العقيمة.
5. وضع الكروية على هلام بروتين ECM، إضافة 700 مكل من معيار البطانية المتوسطة نمو الخلايا-VEGF الغنية واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
6. بعد 24 ساعة وفي 7 أيام من الثقافة، والتقاط الصور من الثقافات 3D في قوة التكبير 4X. تقييم تنبت من الكروية تطبيق صورة برامج التحليل عن طريق قياس المسافة بين شعاعي الخلية الأخيرة الغازية وحافة كروي. تدابير كرر على طول لا يقل عن 20 اتجاهات مختلفة. يعتبر يعني المسافة بأنها إيجابية عند 50 ميكرون أو أكثر.

النتائج

وقد سمحت الظروف ثقافة انتقائية الموصوفة هنا عزلة رواية ملتصقة وmonomorphic تقريبا سكان الخلية كما 1،0٪ من HBM-الشركات المتعددة الجنسيات (0،5-2،0 × 10 ⁶ HBM-الشركات المتعددة الجنسيات 5-10 مل من عينات BM جديدة) ^5،6 . حددنا هذه كبيرة (40 - 60 ميكرون في القطر)، وتقريبه، وخلايا هادئة، كي-67-سلبية البلدان المتوسطية الشريكة ^5. شكليا، فهي تتميز مميزة البيض المقلي شكل مع المنطقة الأساسية سميكة تحيط بها محيط رقيقة مسطحة تظهر الكثير من أرجل كاذبة خيطية في ارتفاع قوة التكبير (السهام البيضاء في الشكل 1 A.1). استطالة القطبية من حدود الخلية الخارجي كثيرا ما لوحظ (السهام السوداء في الشكل 1 A.1). هذا التشكل هو واضح من مختلف على شكل مغزل الوسيطة ظهور خلايا انسجة نموذجي ورد في الثقافات MSC القياسية. تدفق أظهرت الخلوي أكثر من 95٪ من البلدان المتوسطية الشريكة المعزولة حديثا للتعبير عن CD31 و CD45 في حين مكانت esenchymal علامات المرتبطة CD90 و CD73 ¹³ غير قابل للكشف (الشكل 1 A.2). ونحن نعتبر هذه مجموعة محدودة من أربعة مولدات المضادات، باعتبارها مؤشرا للبلدان المتوسطية الشريكة. الخصائص المميزة أبعد من البلدان المتوسطية الشريكة هي توزيع منقط F-الأكتين وكشف عن عدد من الهياكل الشبيهة podosome (الأحمر في الشكل 1 A.3) والتعبير المكثف للnestin (الأخضر في الشكل 1 A.3)، الذي لم يتم الكشف في الخلايا ملطخة الضد سيطرة الأنماط الإسوية (لا تظهر البيانات).

زراعة البلدان المتوسطية الشريكة في RS القياسية المصممة المتوسطة للحصول على نتائج التوسع MSC في التمايز السريع إلى تزايد أضعافا مضاعفة الخلايا الشبيهة MSC (الشكل 1 B.1). بعد اثنين من الممرات خلايا التبديل أخيرا ملامحهم من CD73 ^NEG CD90 ^NEG CD45 ⁺ CD31 ⁺ CD73 ⁺ CD90 ^ل+ CD45 ^{NEG NEG} CD31 (الشكل 1 B.2). في هذه العملية، والبلدان المتوسطية الشريكة إعادة ORGA-nize F-الأكتين إلى ألياف الإجهاد في حين يصبح التعبير nestin تقتصر على عدد قليل من خلايا نادرة (الشكل 1 B.3). لجنة السياسة النقدية التمايز mesengenic في مثل MSC النمط الظاهري واضح يحدث من خلال خطوتين المتميزة التي كشفت عنها الأشكال التضاريسية مختلفة من الخلايا. بعد أسبوع واحد في لجنة السلامة البحرية RS المتوسطة يبلغ عدد سكانها المتبقية من خلايا MPC-تشبه ما زال كشفها ضمن طبقة متموجة من شقة، وخلايا متعددة الأضلاع متعددة ومتفرعة (P1-اللجان الدائمة في الشكل 2). مطلوب مرور مزيد من الحصول على ثقافة monomorphic تقريبا من المغزل على شكل خلايا تشبه MSC (P2-اللجان الدائمة في الشكل 2). هذه الخلايا تنمو باطراد يمكن التفريق بسهولة إلى الخلايا بانية العظم أو الخلايا الشحمية عند نقلها إلى وسائل الإعلام الانتقائي لمدة 2 أسابيع على الأقل، مما يؤكد طبيعة MSC بهم. في عظمية الناجم عن الثقافات والودائع الكالسيوم يمكن الكشف عنها بواسطة إما اللونية وصمة عار الصبغ الأحمر-S أو الأصباغ الفلورية معينة (اللون الأخضر في الشكل 2 ب). بعد خلايا تحريض مكون الشحمتظهر تراكم قطرات الدهون كما كشفت من قبل أي اللونية النفط الأحمر أو الفلورسنت النيل الأحمر وصمة عار (الأحمر في الشكل 2 ب).

وأكد لجنة السياسة النقدية في الكتابة وذلك تنتشر الأوعية الدموية الفحص. أظهرت البلدان المتوسطية الشريكة قدرتها على غزو (أكثر من 50 ميكرون) هلام بروتين ECM الفئران من الأجسام الشبه الكروية 3D بعد 24 ساعة VEGF التحفيز (الشكل 2 C). وبعد أن تم الكشف عن الخلايا الغازية أسبوع واحد في 300-600 بعد ميكرون. على العكس من ذلك، فقد القدرة الغزو في P2-اللجان الدائمة بعد التمايز mesengenic (الشكل 2 د).

الشكل 1. البلدان المتوسطية الشريكة المعزولة حديثا لها ملامح مميزة. التثقيف HBM-الشركات المتعددة الجنسيات في DMEM / 10٪ PhABS لمدة سبعة أيام يؤدي إلى سكان البلدان المتوسطية الشريكة هادئة (A) يمكن تمييزها بسهولة من اللجان الدائمة (ب) من حيث التشكل (A.1، B.1 والحانات على نطاق و= 100 ميكرون)، النمط الظاهري (A.2، B.2)، F-الأكتين توزيع (الأحمر في A.3، B.3)، و التعبير nestin (الأخضر في A.3، B.3 والحانات مقياس = 20 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. البلدان المتوسطية الشريكة تفرق في اللجان الدائمة القياسية ومشاهدة الإيراق الأوعية الدموية في المختبر. استبدال DMEM / PhABS مع RS متوفرة تجاريا مصممة المتوسطة للتوسع MSC يؤدي تحريض mesengenic من البلدان المتوسطية الشريكة. بعد أسبوع واحد في ثقافة بعض البلدان المتوسطية الشريكة المتبقية لا تزال يمكن اكتشافها (P1-اللجان الدائمة)، في حين ممر آخر في المتوسط ​​MSC-RS يؤدي إلى سكان متموجة خلايا MSC مثل (P2-اللجان الدائمة، وقضبان نطاق = 100 ميكرون). P2-اللجان الدائمة يفرق عضال إلى خلية عظمية أو الخلايا الشحمية تحت المحفزات المناسبة كما يتضح من ترسب الكالسيوم (الخضراء في الإفطار) وتراكم الدهون قطرة (الأحمر في المبيت والحانات على نطاق و= 200 ميكرون)، على التوالي. تظهر البلدان المتوسطية الشريكة تنتشر ثابت من الكروية في الفئران هلام بروتين ECM (C) في الفرق مع P2-اللجان الدائمة (D والحانات على نطاق و= 1.0 ملم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders^14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity¹⁶, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation.

Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability^17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity^10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in "crude" and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)². Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.

A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation²¹. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs^5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum⁶. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.

MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported⁹ would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions.

It is not clear if these "contaminating" MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow²² or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.

Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation⁷. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described^5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as "Mesangiogenic Progenitor Cells", maintaining the acronym MPCs.

We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages²³.

Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9 - 12 mg/ml) Final Concentration: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 μm Filters	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Sweden)	17-5442-03	medium for discontinuos density gradient centrifugation
Pooled human AB type serum (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Final Concentration: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100x Final Concentration: 2 mM
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5%
Sodium Azide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Final Concentration: 0.02%
Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063	Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/ml penicillin, 5,000 μg/ml Streptomycin Final Concentration: 50 UI/ml penicillin, 50 μg/ml Streptomycin
T-75 culture flask for suspension cultures	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658 190
T-75 culture flask TC treated	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12563-011	Animal-free proteases detaching solution Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
Trypsin/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	15400-054	Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25%
anti-CD90 APC antibody  (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-402	Final Concentration: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-609	Final Concentration: 1:40
anti-CD73 PE antibody (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-182	Final Concentration: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-105-260	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 APC antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-846	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-637	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-845	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-563	Final Concentration: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1,000 mg/L glucose
Fetal Bovine Serum  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Stock Concentration:0.2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml
Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	P-36931	Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1x
Paraformaldehyde	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Fixative Final Concentration: 4%
LAB-TEK two-well chamber slides	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Anti-Nestin antibody [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, UK)	ab2035	Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milan, Italy)	EMR237500	Final Concentration: 0.05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medium)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml
Pasteur Pipette	Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITALY )	329
StemMACS AdipoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-678
Osteoimage Bone mineralization Assay	LONZA (Walkersville MD-USA)	PA-1503	Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution
50 ml Polystyrene conical tube	Greiner bio-one (Kremsmünster Austria)	227261
Nile Red	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	N1142	Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm
Glycerin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	G2289	Final Concentration: 50%
Polistirene Petri dishes	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P5606
24-well plates TC-treated	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany)	662160
Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)	LONZA (Walkersville MD-USA)	CC-3162	VEGF-rich endothelial cell growth medium
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Germany)		Image analysis software