JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الضامة هي خلايا بلاستيكية من نظام المكونة للدم التي لها دور حاسم في مناعة وقائية والتوازن. في هذا التقرير، وصفنا الأمثل في تقنيات المختبر إلى ظاهريا ووظيفيا تميز الضامة التنظيمية المتسلل الكسب غير المشروع التي تتراكم في الجهاز المزروع تحت ظروف التحمل.

Abstract

وقد تم الاعتراف منذ فترة طويلة تراكم بلعم في الأعضاء المزروعة سمة من سمات الطعم المغفل الرفض 1 . الحيدات المناعية التسلل في المزروع في وقت مبكر بعد زرع، جبل استجابة الكسب غير المشروع رد الفعل ضد الجهاز المزروع، والشروع في رفض الجهاز 2 . وتشير البيانات الأخيرة أن الضامة قمعية تسهيل نجاح زرع على المدى الطويل 3 وهي مطلوبة لتحريض زرع التسامح 4 . وهذا يوحي بمفهوم متعدد الأبعاد للنسيج البلاعم، والتفعيل، والوظيفة، الأمر الذي يتطلب خارطة طريق جديدة لعزل وتحليل وظيفة البلاعم 5 . بسبب اللدونة من الضامة، فمن الضروري توفير منهجية لعزل وتوصيف الضامة، اعتمادا على بيئة الأنسجة، وتحديد وظائفهم وفقا لسيناريوهات مختلفة. هنا، نحن تصفيكون بروتوكول لتوصيف المناعة من الضامة المتسلل الكسب غير المشروع والطرق التي استخدمناها لتقييم وظيفيا قدرتها على منع انتشار CD8 + T وتعزيز CD4 + Foxp3 + تريج التوسع في المختبر .

Introduction

يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لدراسة وظيفة الضامة تسلل الأنسجة معزولة من المغايرة القلب، وفقا لقدرتها على تعديل استجابات الخلايا التائية. وصفت على نطاق واسع في الأدب، والأصباغ تتبع الخلايا الفلورسنت في تركيبة مع التدفق الخلوي، هي أدوات قوية لدراسة وظيفة قمعية من أنواع الخلايا المحددة في المختبر وفي الجسم الحي. بروتوكول لدينا يتبع طريقة إستر سوتسينيميديل كاربوكسيفلورسين (كفس) لرصد انتشار الخلايا الليمفاوية في المختبر .

عندما تنقسم خلية كفس المسمى، نسلها يكتسب نصف عدد من الجزيئات كاربوكسيفلورسين الموسومة 6 . الانخفاض المقابل في مضان الخلية عن طريق التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم انقسام الخلايا، ورصد قدرة الضامة قمعية لتعديل الاستجابات المناعية خلية T. منذ كفس هو صبغة فلوريسئين، وهو متوافق مع برمجموعة أواد من فلوروكروميس أخرى، مما يجعلها قابلة للتطبيق على متعدد الألوان التدفق الخلوي. الاختيار المناسب من فلوروكروميس ل فينوتيبينغ مهم أيضا لتجنب التداخل الطيفي المفرط وعدم القدرة على التعرف على الخلايا المضادة للأجسام المضادة، وخاصة مع مرئية الأصباغ البروتين مثل كفس 7 .

هناك العديد من المزايا من استخدام الأصباغ الفلورية على التقنيات البديلة التي تقيس تكاثر الخلايا، مثل فحص ثيميدين التأسيس، والذي يستخدم ثيميدين راديولبلد (تبر) 8 . هذا الفحص يستخدم ثيميدين تريتيتد ( 3 H-تدر) التي تم دمجها في فروع جديدة من الحمض النووي الكروموسومات خلال انقسام الخلايا الانقسامية. ومن الشواغل المتعلقة بالسلامة المرتبطة بهذا الفحص استخدام النظائر المشعة، حيث يستخدم مقياس بيتا التلألؤ لقياس النشاط الإشعاعي في الحمض النووي المسترجع من الخلايا من أجل تحديد مدى انقسام الخلايا. من الناحية المنهجية، والحمض ثيميدين تريتيتدأي ليست مرنة بما يكفي لتناسب القيود المخبرية السريرية الهامة مثل انخفاض عدد الخلايا وتأخر التحليل بعد تلطيخ. على العكس من ذلك، وقد تبين تلطيخ كفس لمنع تكاثر الخلايا والتدخل مع علامات التنشيط الحرجة، مثل CD69، هلا-در و CD25 9 . لذلك، فهم مزايا وحدود كل منهجية، وخاصة في دراسات متعددة الألوان حيث يتم استخدام الأصباغ متعددة لتتبع أنواع الخلايا المختلفة، أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

في هذه الدراسة، يتم وضع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية وزارة الزراعة في الولايات المتحدة وتوصيات دليل الخدمات الصحية العامة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تنفيذ جميع التقنيات التجريبية التي تنطوي على استخدام الحيوان وفقا ل المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك) - البروتوكولات المعتمدة من مدرسة جبل سيناء الطب.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. إعداد كامل رمي 1640 المتوسطة مع 10٪ فبس و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (10000 U / مل) باستخدام 2 ملي L- الجلوتامين، 1 ملي بايروفات الصوديوم، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الضرورية، 5 ملي هيبيس، و 0.05 ملي 2 -mercaptoethanol.

2. مزروع العزلة وحيدة الخلية تعليق

ملاحظة: تم وصف تقنية زرع ومفاغرة الشريان الرئوي والوريد الأجوف السفلي في البداية من قبل كوري والمتعاونين ويمكن تصور في ليو وكانغs = "كريف"> 10 ، 11 ( الشكل 1A ).

  1. تخدير ماوس مزروع مع 4-5٪ إيسوفلوران في غرفة الاستقراء. التضحية به عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. جعل شق البطن خط الوسط مع مقص القياسية وإزالة محتويات البطن لتوطين الأبهر.
    ملاحظة: سوف يكون القلب المزروع على الجانب الأيمن من المتلقي الشريان الأورطي البطني ( الشكل 1B ).
  3. سحب الكسب غير المشروع بلطف باستخدام غرامة ملقط حادة الأسنان ووضعه على الفور في المتوسطة رمي الجليد الباردة.
    ملاحظة: استخدام مقص جراحة لفصل الكسب غير المشروع من الشريان الأورطي يمكن أن تتلف الكسب غير المشروع وتسبب بعض الأنسجة أن تبقى التمسك المستلم.
  4. بعد جمع جميع الطعوم، نقلها إلى غطاء العقيمة ثقافة لمعالجة الأنسجة. وضع الكسب غير المشروع في طبق بتري والزهر الأنسجة إلى قطع صغيرة (1 ملم) باستخدام العقيمة، حادة، مقص المجهرية.
  5. مع شوكة الأسنان الحادةإبس، ونقل القطع إلى أنبوب 50 مل مع 5 مل من كولاجيناز A (0.1 ملغ / مل كولاجيناز في برنامج تلفزيوني العقيمة 1X). احتضان لمدة 1 ساعة في حمام 37 درجة مئوية.
  6. إضافة 5 مل من رمي المتوسطة لتحييد كولاجيناز ونقل العينة من خلال مصفاة 100 ميكرون مع مساعدة من المكبس من حقنة 1 مل.
  7. تدور العينة أسفل في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  8. ريسوسبيند الكرية في 1 مل من العازلة تحلل أك. مزيج جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. إضافة 1 مل من رمي المتوسطة لتحييد العازلة تحلل وتدور العينة أسفل في 400 x ج لمدة 5 م في 4 درجات مئوية.
  10. ريسوسبيند خلية بيليه في 200 ميكرولتر من رمي المتوسطة ونقله إلى 5 مل البولي بروبيلين أنبوب القاع.
    ملاحظة: أنابيب البولي بروبلين دعم أقل الالتزام. أيضا، والحفاظ على الخلايا في درجة حرارة منخفضة، مثل 4 درجات مئوية، ويقلل من التصاق.

3. عزل الضامة تسلل الكسب غير المشروع باستخدام خلية مضان تنشيط فرزجي

  1. كتلة ملزمة غير المرغوب فيها محددة على خلايا الدم النخاعي باستخدام مستقبلات فك حجب ماب (الفئران المضادة للماوس CD16 / 32). إضافة 1-2 ميكرولتر لكل عينة، 15 دقيقة قبل تلطيخ السطح.
  2. وصمة عار مع المضادة للماوس CD11b بيركب / Cy5.5 (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي في وسط رمي)، ومكافحة الماوس CD45 أبك / eFluor780 (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر)، ومكافحة الفأر Ly6C أبك (2 ميكروغرام / ميكرولتر) ومكافحة الفأر Ly6G بي / Cy7 (2 ميكروغرام / ميكرولتر). تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الأجسام المضادة الفلورسنت من الضوء واحتضان الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
    ملاحظة: للحصول على تعويضات وصمة عار واحدة، وإعداد أنبوب السيطرة السلبية (لا وصمة عار) والأنابيب مع الخلايا المسمى منفردة مع كل من فلوروكروميس. للمساعدة في إعداد البوابة، وضوابط إيزوتيب يمكن استخدامها خاصة ل Ly6C (IgG2a) و Ly6G (IgG2b).
  3. غسل الخلايا مرتين مع رمي المتوسطة وتدور لهم في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق و هيموسيتوميتr وتمييع لهم في 1 مل من رمي المتوسطة في 1 × 10 6 خلايا. قبل الفرز، ونقل العينات من خلال 5 مل، 70 ميكرون كاب غطاء أنبوب مصفاة. إضافة دابي (1 ميكروغرام / مل) كعلامة بقاء الخلية والمضي قدما في الفرز.
  4. لأن الضامة هي خلايا حساسة وهشة، تعيين ظروف الفرز إلى 20 رطل واستخدام 100 ميكرون حجم فوهة لعزل الضامة باستخدام وضع نقاء 4 في اتجاه.
  5. إعداد أنابيب جمع مع 1 مل من رمي المتوسطة في أنبوب البولي بروبلين 5 مل.
  6. باستخدام برنامج فارز فتح تجربة جديدة وحدد تجربة فارغة مع لوحة فارغة لتحديد الإعدادات.
  7. إعداد مؤامرة نقطة الذي يعرض إلى الأمام (فسك) مقابل ( مقابل ) مبعثر الجانب (سك) وبوابة على جميع الكريات البيض، باستثناء الحطام والتكتلات مع أدنى تشتت إلى الأمام والجانب. من هذه البوابة الأم، إنشاء مؤامرة نقطة جديدة تعرض سك مقابل دابي والبوابة على خلايا دابي.
    1. على هذا العدد الجديد من البوابات، أنشئ إعلاناالمؤامرة التي يعرض CD11b مقابل CD45 والبوابة على ضعف إيجابي (CD11b + CD45 + ) الضامة والعدلات.
    2. من هنا، إنشاء مؤامرة نقطة النهائية عرض Ly6C مقابل Ly6G وبوابة السكان المرغوبة: Ly6C مرحبا Ly6G - ، Ly6C لو Ly6G - ، و Ly6C إنت Ly6G + ( الشكل 2 ).
  8. بعد الفرز، تحقق من النقاء وقابلية الخلية (> 90٪) وتدور أنابيب جمع في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان وكريات الدم و ريسوسبيند لهم في التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 1 × 10 6 الضامة / مل) في المتوسطة رمي كاملة.
  9. لوحة 50 × 10 3 الضامة لكل بئر في لوحة 96-جيدا جولة القاع مع الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من المتوسطة رمي كاملة. ترك الخلايا دون عائق لمدة 24 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .

4 - إيسولاتيوn من الخلايا T باستخدام الفرز خلية تنشيط مضان

ملاحظة: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / جن هو مرتبط X- تدق سلالة الماوس التي تشارك علامات الخلايا معربا عن الجين Foxp3 (فوركهيد مربع P3) مع بروتين فلوري أحمر أحادي (مرفب).

  1. تخدير والتضحية C57BL / 6 و C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2B) الفئران كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1. عزل الطحال والغدد الليمفاوية (لن: الأربية، قطني، أكسيلار، العضدية، وعنق الرحم) ووضعها بسرعة في المتوسطة رمي الجليد الباردة.
  2. من أجل عزل لن، ضع الماوس في موقف ضعيف، وجعل شق الجلد خط الوسط من أسفل إلى أعلى، وقطع بعناية البريتوني ونشر بلطف الجلد بعيدا. مرة واحدة يتم جمع كل الإربية، قطني، إبطي، العضدية، وعنق الرحم لن ( الشكل 1C ، الملونة باللون الأحمر)، وقطع الصفاق وعزل الطحال في الجانب الأيسر العلوي من القناة الهضمية.
  3. تصنيف الطحال و لن باستخدام مرشح 100 ميكرون وضعتعلى رأس أنبوب 50 مل. باستخدام المكبس من حقنة 1 مل، اضغط بلطف على الأنسجة. شطف مرشح مع المتوسطة رمي عدة مرات حسب الضرورة حتى أنها نظيفة.
    ملاحظة: لن والطحال من كل الماوس يمكن تجميعها معا في نفس أنبوب.
  4. تدور باستمرار في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. ريسوسبيند الكرية في 2 مل من العازلة تحلل أك. مزيج جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. إضافة 2 مل من رمي المتوسطة لتحييد العازلة تحلل. تدور باستمرار في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. ريسوسبيند الخلية بيليه في 200 ميكرولتر من رمي المتوسطة ونقله إلى 5 مل البوليسترين أنبوب جولة القاع.
  8. وصمة عار لمكافحة الماوس CD4 أبك (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر) و / أو المضادة للماوس CD8 PeCy7 (2 ميكروغرام / ميكرولتر). تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الأجسام المضادة الفلورسنت من الضوء، واحتضان الأنابيب في الثلاجة في 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
    ملاحظة: للحصول على تعويضات وصمة عار واحدة، وإعداد أنبوب التحكم السلبي (لا وصمة عار) وأنابيب مع خلايا المسمى منفردة مع كل من فلوروكروميس.
  9. غسل الخلايا مرتين مع رمي المتوسطة وتدور لهم في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان وكريات الدم.
    ملاحظة: يتم توفير صبغ كفس كما كاربوكسيفلورسين دياسيتات سوتسينيميديل استر مسحوق عادة في 50 ميكروغرام. إضافة 18 ميكرولتر دمسو إلى قارورة من كفس لحل المخزون النهائي من 5 ملي وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  10. ل كفس وضع العلامات، ريسوسبيند CD8 الملون الخلايا في تركيز تصل إلى 10 6 خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني في تركيز العمل النهائي من 5 ميكرومتر كفس من الحل الأسهم. احتضان لهم في حمام في 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق كما هو موضح سابقا 6 .
    ملاحظة: (الخطوة الحرجة) للخلايا في تركيز منخفض (≤10 6 لكل مل)، فمن الضروري أن يتم وصف الخلايا في وجود البروتين وأضاف إلى العازلة الآثار السامة لل كفس. لذلك، يمكن أن تحتوي على بس 5٪ فبس. لاحظ أنه إذا كان لييستخدم ديوم، الأحماض الأمينية الحرة قد يقلل من كفاءة وضع العلامات من خلال التنافس على كفس.
  11. تحييد كفس مع 2 مل من رمي المتوسطة. تدور في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إضافة 1 مل من رمي المتوسطة لكل 1 × 10 6 خلايا T8 CD8.
  12. قبل الفرز، ونقل العينة من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون على غطاء أنبوب 5 مل. إضافة 50 ميكرولتر من 1X دابي (1 ميكروغرام / مل) كعلامة بقاء الخلية والمضي قدما في الفرز.
    ملاحظة: 1x يعني 1: 1 نسبة الكاشف مع احترام المكونات الأخرى.
  13. تعيين ظروف الفرز في 20 رطل و 100 ميكرون حجم فوهة لعزل مزدوج إيجابي CD8 + كفس + T الخلايا ( الشكل 3A ).
  14. إعداد أنابيب جمع مع 1 مل من رمي المتوسطة في أنبوب 5 مل البولي بروبيلين والمضي قدما في الفرز.
  15. باستخدام برنامج فارز فتح تجربة جديدة وحدد تجربة فارغة مع لوحة فارغة لتحديد الإعدادات.
  16. لعزلة الخلايا CD4 + T، إعداد نقطة مؤامرة التي ديسيلعب فسك مقابل سك والبوابة على الخلايا الليمفاوية، باستثناء الحطام وكذلك الخلايا الحبيبية الكبيرة، مثل الخلايا الجذعية.
    1. من هذه البوابة الأم، إنشاء مؤامرة نقطة جديدة تعرض سك مقابل دابي والبوابة على خلايا دابي.
    2. على هذا السكان بوابات حديثا، وخلق مؤامرة نقطة الذي يعرض سك مقابل CD4 لعزل جميع خلايا CD4 + ( الشكل 3B ). بدلا من ذلك، يمكن استخدام مضادة لمكافحة CD3 ماب لضمان عزل الخلايا خلية T النقي.
      ملاحظة: يجب أن يكون جزء صغير من جميع خلايا CD4 + T (5-10٪) Foxp3 + مرفب + .
  17. بعد الفرز، تحقق من النقاء وقابلية الخلية (> 90٪) وتدور أنابيب جمع في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان وكريات الدم. ريسوسبيند باستخدام 1 مل من متوسط ​​رمي المتوسطة لكل 2X10 6 خلايا T.
  18. إعداد فحص قمع عن طريق زراعة الخلايا التائية مع الضامة فرزها سابقا. لوحة 10 × 10 4 سد4 + T و 10 × 10 4 CD8 + كفس + T الخلايا في نفس جيدا في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من المتوسطة رمي كاملة. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 96 ساعة.
    ملاحظة: تم استخدام الضامة والخلايا التائية في نسبة 1: 4.
  19. تحفيز انقسام الخلايا T عن طريق غسل T خلية المنشط CD3 / CD28 الخرز المغناطيسي في 2 مل من برنامج تلفزيوني قبل استخدامها من أجل مسح العازلة التي تحتوي على أزيد. إضافة 5 ميكرولتر من الفئران T خلية المنشط CD3 / CD28 الخرز لكل بئر.
    ملاحظة: الخرز المغناطيسية متشابهة في الحجم لخلايا تقديم مستضد ويقترن لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 ماب، وتقدم طريقة بسيطة لتفعيل وتوسيع الخلايا التائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تظهر النتائج التمثيلية استراتيجية التبييض الموصوفة في البروتوكول أعلاه. النتائج أيضا عرض تحليل نشاط تكاثر الخلايا التائية بعد الثقافة المشتركة مع البلاعم التسلل الكسب غير المشروع. تم تحليل القدرة القمعية في المختبر من مجموعات فرعية بلعم في

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة في إمونوشاراكتيريز الكسب غير المشروع التسلل مجموعات فرعية النخاعي في نموذج الفئران التجريبية لزرع القلب، والذي ينطبق أيضا على الأنسجة الأخرى في نماذج تجريبية الفئران مختلفة. وكان الفرز المنخفض الضغط الخلية في 20 رطل لكل بوصة مربع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ونحن نعترف بالمساهمات التقنية من التدفق الخلوي، الجراحة المجهرية، والمستودع الحيوي / مراكز علم الأمراض التميز البحثي في ​​جبل سيناء. وقد تم دعم هذا العمل من قبل العمل كوست BM1305: العمل على التركيز وتسريع العلاجات المسببة للحساسية الخلية (A فاكت)، وصندوق سيناي ريكاناتي / ميلر زرع النمو صناديق التنمية، وزيرة التنمية سي إنوفاسيون SAF2013-48834-R و SAF2016-80031-R JO

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10% FBSLife Technologies26140-079
1,000x 2-mercaptoethanolLife Technologies21985023
100x Pen/StrepLife Technologies15140122
100x L-glutamineLife Technologies25030081
100x Non Esential amino acidsCorning25025039
1 M HEPES buffer Corning25060CL
100 mM Sodium PyruvateThermoScientificSH30239.01
Penicilin/StreptavidynThermoScientific15140122
Collagenese ARoche70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)Corning21031CV
70 µm Cell strainerFisher22363548
ACK lysis bufferLife TechnologiesA10492-01
DAPISigma32670-5mg-F
CFSE-FITCInvitrogenC34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28Life Technologies11452D
96 well  U-bottom plateCorning353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APCeBioscience175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7Biolegend127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5eBioscience45011282
anti-CD45-APC/Cy7eBioscience47045182
anti-CD4-APCeBioscience17004181
anti-CD8-P/ Cy7eBioscience25008181
LSRII Flow CytometerBD Bioscience
FACSDiva SoftwareBD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J The Jackson Laboratory008374
C57BL/6The Jackson Laboratory000664
Balb/cThe Jackson Laboratory000651

References

  1. Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
  2. Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
  3. Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
  4. Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
  5. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
  6. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  7. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287(2012).
  8. Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
  9. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  10. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  11. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238(2007).
  12. Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
  13. Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
  14. Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
  15. Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
  16. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved