Caractérisation fonctionnelle des macrophages réglementaires qui inhibent l'immunité réactive du greffe

Résumé

Les macrophages sont des cellules plastiques du système hématopoïétique qui jouent un rôle crucial dans l'immunité protectrice et l'homéostasie. Dans ce rapport, nous décrivons des techniques in vitro optimisées pour caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les macrophages régulateurs infiltrants de greffe qui s'accumulent dans l'organe transplanté dans des conditions tolérantes.

Résumé

L'accumulation de macrophages dans les organes transplantés a longtemps été reconnue comme une caractéristique du rejet d'allogreffe ¹ . Les monocytes immunogènes infiltrent l'allogreffe au début de la transplantation, montent une réponse réactive du greffon contre l'organe transplanté et initient le rejet d'organe ² . Les données récentes suggèrent que les macrophages suppressifs facilitent la transplantation réussie à long terme ³ et sont nécessaires pour l'induction de la tolérance à la transplantation ⁴ . Cela suggère un concept multidimensionnel de l'ontogenèse, de l'activation et de la fonction des macrophages, qui exige une nouvelle feuille de route pour l'isolement et l'analyse de la fonction macrophage ⁵ . En raison de la plasticité des macrophages, il est nécessaire de fournir une méthodologie pour isoler et caractériser les macrophages, selon l'environnement tissulaire, et pour définir leurs fonctions selon différents scénarios. Ici, nous décriÊtre un protocole pour la caractérisation immunitaire des macrophages infiltrés par greffon et les méthodes que nous avons utilisées pour évaluer de manière fonctionnelle leur capacité à inhiber la prolifération de CD8 ⁺ T et à favoriser l'expansion Treg de CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ in vitro .

Introduction

Ce protocole décrit des techniques in vitro pour étudier la fonction des macrophages infiltrant les tissus isolés à partir d'allogreffes cardiaques, selon leur capacité à moduler les réponses des lymphocytes T. Dans la littérature, les colorants fluorescents de suivi des cellules en combinaison avec la cytométrie en flux sont des outils puissants pour étudier la fonction suppresseur de types de cellules spécifiques in vitro et in vivo. Notre protocole suit la méthode de l'ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes in vitro .

Lorsqu'une cellule marquée par le CFSE se divise, sa descendance acquiert la moitié du nombre de molécules marquées par la carboxyfluorescéine ⁶ . La diminution correspondante de la fluorescence cellulaire par cytométrie de flux peut être utilisée pour évaluer la division cellulaire, en surveillant la capacité des macrophages suppressifs à moduler les réponses immunitaires des lymphocytes T. Puisque le CFSE est un colorant à base de fluorescéine, il est compatible avec un brOuad d'autres fluorochromes, ce qui le rend applicable à la cytométrie de flux multicolores. Le choix approprié des fluorochromes pour le phénotypage est également important pour éviter le chevauchement spectral excessif et l'incapacité de reconnaître les cellules positives aux anticorps, en particulier avec des colorants protéiques visibles tels que le CFSE ⁷ .

Il existe de nombreux avantages d'utiliser des colorants fluorescents sur des techniques alternatives qui mesurent la prolifération cellulaire, comme le dosage d'incorporation de thymidine, qui utilise une thymidine radiomarquée (TdR) ⁸ . Ce dosage utilise de la thymidine tritiée (3H-TdR) qui est incorporée dans de nouveaux brins d'ADN chromosomique lors de la division des cellules mitotiques. Une préoccupation de sécurité associée à cet essai est l'utilisation de radio-isotopes, car un compteur bêta à scintillation est utilisé pour mesurer la radioactivité dans l'ADN récupéré à partir des cellules afin de déterminer l'étendue de la division cellulaire. Sur le plan méthodologique, le culot thymidine tritiéAy n'est pas suffisamment souple pour tenir compte des importantes contraintes de laboratoire clinique telles que le faible nombre de cellules et l'analyse retardée après coloration. Au contraire, la coloration au CFSE a été démontrée pour prévenir la prolifération cellulaire et pour interférer avec les marqueurs critiques d'activation, tels que CD69, HLA-DR et CD25 ⁹ . Par conséquent, la compréhension des avantages et des limites de chaque méthodologie, en particulier dans les études multicolores où les colorants multiples sont utilisés pour suivre différents types de cellules, est essentielle pour obtenir des résultats précis et reproductibles.

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Protocole

Dans cette étude, les souris sont logées conformément aux directives du ministère de l'Agriculture des États-Unis et aux recommandations du Guide du service de santé publique pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les techniques expérimentales impliquant l'utilisation d'animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) de la Mount Sinaï School of Medicine.

1. Préparation des médias

1. Préparer le milieu RPMI 1640 complet avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine (10 000 U / mL) en utilisant 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 5 mM d'HEPES et 0,05 mM de 2 -mercaptoethanol.

2. Isolation de l'allogreffe et suspension à une seule cellule

NOTE: La technique de transplantation et d'anastomose de l'artère pulmonaire et de la veine de cava inférieure a été initialement décrite par Corry et ses collaborateurs et peut être visualisée à Liu & KangS = "xref"> 10 ^{, 11} ( figure 1A ).

1. Anesthésier une souris transplantée avec 4-5% d'isoflurane dans une chambre d'induction. Sacrifiez-le par dislocation cervicale.
2. Faire une incision abdominale de la ligne médiane avec des ciseaux standard et éliminer le contenu abdominal pour localiser l'aorte.
   REMARQUE: Le coeur transplanté sera sur le côté droit de l'aorte abdominale du receveur ( Figure 1B ).
3. Retirez délicatement la greffe à l'aide d'une fine pince à dents pointues et placez-la immédiatement dans du milieu RPMI glacé.
   REMARQUE: L'utilisation d'un ciseau chirurgical pour séparer le greffon de l'aorte peut endommager le greffon et provoquer l'adhérence du tissu au receveur.
4. Une fois que tous les greffons ont été collectés, les déplacer dans un capot de culture stérile pour le traitement des tissus. Placez le greffon dans une boîte de Pétri et coupez les morceaux en petits morceaux (1 mm) en utilisant des ciseaux stériles, émoussés et à microchirurgie.
5. Avec dents pointuesEps, transférez les pièces dans un tube de 50 mL avec 5 mL de collagénase A (0,1 mg / mL de collagénase dans un PBS stérile 1x). Incuber pendant 1 h dans un bain de 37 ° C.
6. Ajouter 5 mL de milieu RPMI pour neutraliser la collagénase et transférer l'échantillon à travers un filtre de 100 μm à l'aide du piston d'une seringue de 1 ml.
7. Faire passer l'échantillon à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
8. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de tampon de lyse ACK. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
9. Ajouter 1 mL de milieu RPMI pour neutraliser le tampon de lyse et faire basculer l'échantillon à 400 xg pendant 5 m à 4 ° C.
10. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 μL de milieu RPMI et le transférer dans un tube à base ronde en polypropylène de 5 ml.
    REMARQUE: Les tubes en polypropylène supportent moins d'adhérence. En outre, le maintien des cellules à basse température, par exemple à 4 ° C, réduit l'adhérence.

3. Isolation des macrophages infiltrant le greffon à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescenceIng

1. Bloquer la liaison spécifique indésirable sur les cellules myéloïdes en utilisant un mAb de blocage du récepteur Fc (souris anti-souris CD16 / 32). Ajouter 1-2 μL par échantillon, 15 min avant la coloration de la surface.
2. Tachez avec la solution finale de CD11b Percp / Cy5.5 anti-souris (0,6 μg / μl de concentration finale dans le milieu RPMI), AP45 / IgFluor780 anti-souris (0,6 μg / μL), APC Ly6C anti-souris (2 μg / μL) Et Ly6G Pe / Cy7 anti-souris (2 μg / μL). Couvrir les tubes avec du papier d'aluminium pour protéger les anticorps fluorescents de la lumière et incuber les tubes au réfrigérateur à 4 ° C pendant 45 minutes.
   REMARQUE: Pour les compensations à une seule tache, préparer un tube de contrôle négatif (sans tache) et des tubes avec des cellules isolées avec chacun des fluorochromes. Pour aider à configurer la porte, les contrôles d'isotype peuvent être utilisés spécialement pour Ly6C (IgG2a) et Ly6G (IgG2b).
3. Lavez les cellules deux fois avec du milieu RPMI et tournez-les à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du bleu trypan et un hémocytomeR et diluez-les dans 1 mL de milieu RPMI pour 1 x 10 ⁶ cellules. Avant le tri, transférez les échantillons à travers un capuchon de tube de filtre de 5 μm, 70 μm. Ajouter DAPI (1 μg / mL) comme marqueur de viabilité cellulaire et procéder à la tri.
4. Étant donné que les macrophages sont des cellules fragiles et sensibles, définissez les conditions de tri à 20 psi et utilisent une taille de buse de 100 μm pour isoler les macrophages en utilisant un mode de pureté à 4 voies.
5. Préparer des tubes de collecte avec 1 mL de milieu RPMI dans un tube de polypropylène de 5 mL.
6. L'utilisation du logiciel du trieur ouvre une nouvelle expérience et sélectionne une expérience vide avec un panneau vierge pour définir les paramètres.
7. Configurez un diagramme de points qui affiche la diffusion latérale vers l'avant (FSC) contre ( contre ) côté et la porte sur tous les leucocytes, à l'exclusion des débris et des touffes avec la plus petite diffusion avant et latérale. À partir de cette porte parentale, créez un nouveau tracé de points qui affiche SSC vs DAPI et la porte sur les cellules DAPI.
   1. Sur cette population nouvellement fermée, créez une annonceOt plot qui affiche CD11b vs CD45 et porte sur des macrophages et des neutrophiles double-positifs (CD11b ⁺ CD45 ⁺ ).
   2. À partir de là, créez un dernier tracé de points affichant Ly6C vs. Ly6G et déployez les populations souhaitables: Ly6C ^hi Ly6G ^- , Ly6C ^lo Ly6G ^- et Ly6C ^int Ly6G ⁺ ( Figure 2 ).
8. Après le tri, vérifier la pureté et la viabilité cellulaire (> 90%) et faire tourner les tubes de collecte à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du trypan bleu et un hémocytomètre et resuspendez-les à la concentration souhaitée ( p. Ex., 1 x 10 ⁶ macrophages / mL) dans un milieu RPMI complet.
9. Placer 50 x 10 ³ macrophages par puits dans une plaque à fond rond de 96 puits avec un volume final de 100 μL de milieu RPMI complet. Laissez les cellules intactes pendant au moins 24 h à 37 ° C et 5% de CO ₂ .

4. IsolatioN de cellules T utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence

REMARQUE: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn est une souche de souris ciblée ciblée par X qui co-marque les cellules exprimant le gène Foxp3 (forkhead box P3) avec une protéine fluorescente rouge monomère (mRFP).

1. Anesthésier et sacrifier les souris C57BL / 6 et C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) comme décrit précédemment à l'étape 2.1. Isoler la rate et les ganglions lymphatiques (LN: inguinal, lombaire, axillaire, brachial et cervical) et les placer rapidement dans du milieu RPMI glacé.
2. Pour isoler le LN, placez la souris en position couchée, faites une incision de la ligne médiane de bas en haut, en coupant soigneusement le péritoine et en écartant délicatement la peau. Une fois que tous les LN inguinaux, lombaires, axillaires, brachiaux et cervicaux sont recueillis ( figure 1C , colorés en rouge), couper le péritoine et isoler la rate en haut à gauche de l'intestin.
3. Désagréger la rate et le LN en utilisant un filtre de 100 μm placéSur un tube de 50 ml. En utilisant le piston d'une seringue de 1 mL, appuyez doucement sur le tissu. Rincez le filtre avec du milieu RPMI autant de fois que nécessaire jusqu'à ce qu'il soit propre.
   REMARQUE: Le LN et la rate de chaque souris peuvent être regroupés dans le même tube.
4. Tourner à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
5. Remettre en suspension la pastille dans 2 ml de tampon de lyse ACK. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
6. Ajouter 2 ml de milieu RPMI pour neutraliser le tampon de lyse. Tourner à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 μL de milieu RPMI et le transférer dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml.
8. Teinture pour CD4 APC anti-souris (0,6 μg / μL) et / ou CD8 PeCy7 anti-souris (2 μg / μL). Couvrir les tubes avec du papier d'aluminium pour protéger les anticorps fluorescents de la lumière et incuber les tubes au réfrigérateur à 4 ° C pendant 45 minutes.
   REMARQUE: pour les compensations à une seule tache, prépare un tube de contrôle négatif (pas de tache) etTubes avec des cellules marquées isolément avec chacun des fluorochromes.
9. Lavez les cellules deux fois avec du milieu RPMI et tournez-les à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du trypan bleu et un hémocytomètre.
   NOTE: Le colorant CFSE est fourni sous forme de poudre d'ester succinimidylique de diacétate de carboxyfluorescéine en général à 50 μg. Ajouter 18 μL de DMSO dans un flacon de CFSE pour une solution mère finale de 5 mM et stocker à -20 ° C pendant plusieurs mois.
10. Pour l'étiquetage CFSE, ré-endiguer les cellules colorées au CD8 à une concentration de jusqu'à 10 ⁶ cellules par ml dans du PBS à une concentration de travail finale de 5 μM CFSE à partir de la solution mère. Incuber les dans un bain à 20 ° C pendant 5 minutes comme décrit précédemment ⁶ .
    REMARQUE: (ÉTAPE CRITIQUE) Pour les cellules à faible concentration (≤10 ⁶ par mL), il est essentiel que les cellules soient marquées en présence de protéines ajoutées pour tamponner les effets toxiques du CFSE. Par conséquent, PBS peut contenir 5% de FBS. Notez que si moiLe dium est utilisé, les acides aminés libres peuvent réduire l'efficacité de l'étiquetage en faisant concurrence pour le CFSE.
11. Neutralisez le CFSE avec 2 mL de milieu RPMI. Tourner à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Ajouter 1 ml de milieu RPMI pour 1 x 10 ⁶ cellules CD8 T.
12. Avant le tri, transférez l'échantillon à travers une crépine cellulaire de 70 μm sur un capuchon de tube de 5 mL. Ajouter 50 μL de 1x DAPI (1 μg / mL) comme marqueur de viabilité cellulaire et procéder au tri.
    REMARQUE: 1x signifie 1: 1 rapport du réactif par rapport à un autre constituant.
13. Réglez les conditions de tri à 20 psi et à la taille de la buse de 100 μm pour isoler les cellules T CD8 ⁺ CFSE ⁺ à double positif ( Figure 3A ).
14. Préparer des tubes de collecte avec 1 ml de milieu RPMI dans un tube de polypropylène de 5 ml et procéder à la tri.
15. L'utilisation du logiciel du trieur ouvre une nouvelle expérience et sélectionne une expérience vide avec un panneau vierge pour définir les paramètres.
16. Pour l'isolation des cellules T CD4 ⁺ , configurez un espace de points que disJoue le FSC vs SSC et la porte sur les lymphocytes, à l'exclusion des débris ainsi que des grandes cellules granulaires, comme les cellules dendritiques.
    1. À partir de cette porte parentale, créez un nouveau tracé de points qui affiche SSC vs DAPI et la porte sur les cellules DAPI.
    2. Sur cette population nouvellement fermée, créez un diagramme de points qui affiche SSC vs CD4 pour isoler toutes les cellules CD4 ⁺ ( Figure 3B ). Alternativement, un mAb anti-CD3 peut être utilisé pour assurer l'isolement des populations de cellules T pur.
       NOTE: Une petite fraction de toutes les cellules T CD4 ⁺ (5-10%) devrait être Foxp3 ⁺ mRFP ⁺ .
17. Après le tri, vérifier la pureté et la viabilité cellulaire (> 90%) et faire tourner les tubes de collecte à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du trypan bleu et un hémocytomètre. Remettre en suspension en utilisant 1 mL de milieu RPMI complet par 2 cellules de cellules T de ⁶ x ¹⁰ .
18. Mettre en place un test de suppression en cultivant des lymphocytes T avec des macrophages préalablement triés. Plaque 10 x 10 ⁴ CD4 ⁺ T et 10 x 10 ⁴ cellules CD8 ⁺ CFSE ⁺ dans le même puit dans un volume final de 100 μL de milieu RPMI complet. Incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 96 h.
    NOTE: Les macrophages et les lymphocytes T ont été utilisés dans un rapport 1: 4.
19. Stimuler la division des lymphocytes T en lavant des billes magnétiques CD3 / CD28 activatrices de cellules T dans 2 ml de PBS avant de les utiliser afin d'éliminer le tampon contenant de l'azide. Ajouter 5 μL de billes CD3 / CD28 de cellules T souris par puits.
    REMARQUE: Les billes magnétiques sont de taille similaire aux cellules présentant des antigènes et sont couplées aux mAb anti-CD3 et anti CD28, offrant une méthode simple pour l'activation et l'expansion des cellules T.

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Résultats

Les résultats représentatifs montrent la stratégie de verrouillage décrite dans le protocole ci-dessus. Les résultats montrent également l'analyse de l'activité de prolifération des lymphocytes T après la co-culture avec des macrophages infiltrant le greffon. La capacité suppressive in vitro des sous-ensembles de macrophages a été analysée à la figure 4 . Les résultats indiquent que Ly6C ^lo Ly6G ^- macrophages obtenus ...

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Discussion

Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour immuno-caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes infiltrantes de greffe dans un modèle murin expérimental de transplantation cardiaque, qui s'applique également à d'autres tissus dans différents modèles expérimentaux murins. Le triage cellulaire à basse pression à 20 psi était la méthode préférée pour isoler un bon rendement de sous-ensembles de cellules pures. Le maintien de la pureté de chaque sous-ensemble myéloïde est essentie...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Esential amino acids	Corning	25025039
1 M HEPES buffer	Corning	25060CL
100 mM Sodium Pyruvate	ThermoScientific	SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagenese A	Roche	70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)	Corning	21031CV
70 µm Cell strainer	Fisher	22363548
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-bottom plate	Corning	353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Flow Cytometer	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	The Jackson Laboratory	008374
C57BL/6	The Jackson Laboratory	000664
Balb/c	The Jackson Laboratory	000651