Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Özet

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Özet

Nakil yapılan organlarda makrofaj birikimi, allograft reddi 1'in bir özelliği olarak uzun zamandır bilinmektedir. Immunogenic monocytes, transplantasyondan hemen sonra allogrefte infiltre olur, nakledilen organa karşı bir greft reaktif yanıt verir ve organ reddi başlatır ² . Son yıllardaki veriler, baskılayıcı makrofajların başarılı uzun vadeli transplantasyon ^3'ü kolaylaştırdığını ve transplantasyon toleransının indüksiyonu için gerekli olduğunu göstermektedir4. Bu makrofaj fonksiyonunun izolasyonu ve analizi için yeni bir yol haritası isteyen, makrofaj ontogenezi, aktivasyonu ve fonksiyonunun çok boyutlu bir kavramını önermektedir. Makrofajların esnekliği nedeniyle makrofajları doku ortamına bağlı olarak izole etmek ve karakterize etmek için bir metodoloji sağlamak ve fonksiyonlarını farklı senaryolara göre tanımlamak gerekir. İşte, açıklıyoruzGreft sızdıran makrofajların bağışıklık karakterizasyonu için bir protokol olabilir ve CD8 ⁺ T proliferasyonunu inhibe etme ve CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg genleşmesini in vitro teşvik etme kapasitelerini fonksiyonel olarak değerlendirmede kullandığımız yöntemler olabilir .

Giriş

Bu protokol, T hücre yanıtlarını modüle edebilme yeteneklerine göre, kardiyak allograftlardan izole edilen dokuya sızdıran makrofajların fonksiyonunu incelemek için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. Literatürde yaygın olarak tarif edilen floresan hücre izleme boyaları, akış sitometrisiyle kombinasyon halinde, in vitro ve in vivo spesifik hücre tiplerinin baskılayıcı fonksiyonlarını incelemek için güçlü araçlardır . Protokolümüz , in vitro lenfosit proliferasyonunu izlemek için karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE) yöntemini izlemektedir.

Bir CFSE etiketli hücre bölünürse, nesli karboksiflüoresantin ile etiketlenen moleküllerin sayısının yarısını alır ⁶ . Akış sitometresi ile hücre floresanındaki karşılık gelen düşüş, hücre bölünmesini değerlendirmek için, baskılayıcı makrofajların T hücre immün yanıtlarını modüle etme kapasitesini izlemek için kullanılabilir. CFSE floresein bazlı bir boya olduğu için, bir br ile uyumludur.Çok renkli akış sitometrisi için uygun hale getiren, diğer florokromlardan daha geniş bir yelpazede. Fenotipleme için florokromların uygun seçimi, aşırı spektrum örtüşmesini ve özellikle CFSE ⁷ gibi görünür protein boyaları ile antikor pozitif hücrelerin tanınamamasını önlemek açısından önemlidir.

Floresan boyaları, radyoetiketlenmiş timidin (TdR) ⁸ kullanan timidin toplama testi gibi hücre çoğalmasını ölçen alternatif teknikler üzerine kullanmanın birçok avantajı vardır. Bu deney, mitotik hücre bölünmesi sırasında kromozomal DNA'nın yeni iplikçiklerine dahil edilmiş, parçalanmış timidin (3H-TdR) kullanmaktadır. Bu tahlil ile ilgili bir güvenlik endişesi, radyoizotopların kullanılmasıdır, çünkü bir sintilasyon beta-sayacı, hücre bölünmesinin derecesini belirlemek için hücrelerden alınan DNA'daki radyoaktiviteyi ölçmek için kullanılır. Metodolojik olarak, kıyılmış timidin kıçAy, boyama sonrası düşük hücre sayısı ve gecikmiş analiz gibi önemli klinik laboratuvar kısıtlamalarına uyacak kadar esnek değildir. Aksine, CFSE boyamasının hücre proliferasyonunu önlediği ve CD69, HLA-DR ve CD259 gibi kritik aktivasyon belirteçlerine müdahale ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, her bir metodolojinin avantajlarını ve kısıtlamalarını anlamak, özellikle farklı renk türlerini izlemek için birden fazla boyanın kullanıldığı çok renkli çalışmalar için doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada fareler, Birleşik Devletler Tarım Bakanlığı yönergelerine ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Kılavuzu'nun önerileri uyarınca yerleştirildi. Hayvan kullanımını içeren tüm deneysel teknikler, Sina Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin onaylı protokolleri olan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca gerçekleştirildi.

1. Medya Hazırlığı

1. 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM zorunlu olmayan amino asitler, 5 mM HEPES ve 0.05 mM 2 kullanarak,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (10,000 U / mL) ile komple RPMI 1640 ortamı hazırlayın. mersaptoetanol.

2. Allograft İzolasyon ve Tek Hücreli Süspansiyon

NOT: Pulmoner arter ve inferior kava veninin transplantasyon ve anastomoz tekniği başlangıçta Corry ve işbirlikçileri tarafından tanımlanmıştır ve Liu ve Kang'da görselleştirilebilirS = "xref"> 10 ^{, 11} ( Şekil 1A ).

1. Bir indüksiyon odasında% 4-5 izofluran içeren bir fare anestezisi. Servikal dislokasyonla onu kurban edin.
2. Standart makasla orta hat abdominal insizyon yapın ve aorta lokalize etmek için abdominal içeriği kaldırın.
   NOT: Transplante kalp, alıcı abdominal aortanın sağ tarafında olacaktır ( Şekil 1B ).
3. İnce keskin dişli forseps kullanarak yavaşça grefti çekin ve hemen buz gibi RPMI ortamına yerleştirin.
   NOT: Grefti aorta ayırmak için bir ameliyat makasının kullanılması grefte zarar verebilir ve bazı dokuların alıcının üzerine yapışmasına neden olabilir.
4. Tüm greftler toplandıktan sonra, doku işleme için steril bir kültür başlığına taşıyın. Grefti bir petri kabına yerleştirin ve steril, kütik, mikrocerrahi makası kullanarak dokuyu küçük parçalara (1 mm) zar atın.
5. Keskin dişli forc ileEps, parçaları 5 mL kollajenaz A (steril 1x PBS'de 0.1 mg / mL kollajenaz) ile 50 mL'lik bir tüpe aktarın. 37 ° C'lik bir banyoda 1 saat inkübe edin.
6. Kollajenazı nötralize etmek için 1 mL'lik bir şırınganın pistonu yardımıyla 100 μm'lik süzgeçle numuneyi aktarmak için 5 mL'lik RPMI ortamı ekleyin.
7. Numuneyi 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 xg'de döndürün.
8. Pelleti 1 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
9. Liziz tamponunu nötralize etmek için 1 mL RPMI ortamı ekleyin ve numuneyi 4 ° C'de 5 m süreyle 400 xg'de aşağı doğru döndürün.
10. RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp aktarın.
    NOT: Polipropilen tüpler daha az yapışmayı destekler. Ayrıca, hücreleri 4 ° C gibi düşük sıcaklıklarda tutmak, yapışmayı azaltır.

3. Fluoresansla aktive edilmiş Hücre Sıralamasını Kullanarak Greftle Sızma Makrofajlarının İzolasyonuing

1. Fc reseptör bloke edici mAb (sıçan anti-fare CD16 / 32) kullanarak miyeloid hücreler üzerindeki istenmeyen spesifik bağlanmayı bloke edin. Yüzey boyamadan 15 dakika önce örnek başına 1-2 μL ekleyin.
2. Anti-fare CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI ortamında 0.6 μg / μL son konsantrasyon), anti-fare CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-fare Ly6C APC (2 μg / μL) Ve anti-fare Ly6G Pe / Cy7 (2 ug / ml). Floresan antikorları ışığa karşı korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika boyunca 4 ° C'de buzdolabında tüpleri inkübe edin.
   NOT: Tek leke dengelemeleri için negatif bir kontrol tüpü (leke yok) ve flokromların her biri ile tek tek etiketlenmiş hücreler içeren tüpler hazırlayın. Kapıyı ayarlamaya yardımcı olmak için, izotip kontrolleri özellikle Ly6C (IgG2a) ve Ly6G (IgG2b) için kullanılabilir.
3. Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürün. Tripan mavisi ve hemositomet kullanarak hücreleri sayın.R ve 1 x 10 ⁶ hücre başına 1 mL RPMI ortamında seyreltin. Sınıflamadan önce, numuneleri 5 mL, 70 μm hücre süzgeç borusu başlığı ile aktarın. Bir hücre yaşayabilirlik markörü olarak DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama yapmaya devam edin.
4. Makrofajlar hassas ve kırılgan hücreler olduğundan, sıralama koşullarını 20 psi'ye ayarlayın ve makrofajları 4 yönlü saflık modu kullanarak izole etmek için 100 μm'lik bir meme boyutu kullanın.
5. Toplama tüplerini 1 mL'lik RPMI ortamı ile 5 mL'lik bir polipropilen tüp içerisinde hazırlayın.
6. Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin.
7. En düşük ileriye ve yan dağılım gösteren döküntüleri ve kümeleri hariç tutarak, tüm lökositlerde ileri (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve kapıyı gösteren bir nokta çizelgesi kurun. Bu ana kapıda, SSC'yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun.
   1. Yeni kontrol edilen bu nüfusta reklam oluşturunCD11b'yi CD45'e ve kapıyı çift-pozitif (CD11b ⁺ CD45 ⁺ ) makrofajları ve nötrofilleri görüntüleyen ot parsel.
   2. Buradan Ly6C - Ly6G görüntüleyen ve istenen popülasyonları gösteren son bir nokta çizelgesi oluşturun: Ly6C ^hi Ly6G ^- , Ly6C ^lo Ly6G ^- ve Ly6C ^int Ly6G ⁺ ( Şekil 2 ).
8. Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (>% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometreyi kullanarak hücreleri sayın ve tam RPMI ortamında istenen konsantrasyonda ( örn., 1 x 10 ⁶ makrofaj / mL) tekrar süspanse edin.
9. 100 uL komple RPMI ortamı ile 96 oyuklu, yuvarlak tabanlı bir plakada oyuk başına 50 x 10 ³ makrofaj. Hücreleri en az 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de rahatsız bırakmayın.

4. İzolatioFloresansla Etkinleştirilmiş Hücre Ayırma Kullanan T Hücrelerinin n

NOT: C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / Jn, Foxp3 (forkhead kutusu P3) genini monomerik kırmızı flüoresan proteini (mRFP) ile birlikte işaretleyen hücrelere işaret eden, X bağlantılı hedeflenmiş bir kapanmış fare suşudur.

1. Adım 2.1'de daha önce anlatıldığı gibi C57BL / 6 ve C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / J (H-2b) farelerini anestezikle ve feda edin. Dalak ve lenf düğümlerini (LN: kasık, lomber, aksiller, brakiyal ve servikal) izole edin ve onları hızlıca buz gibi soğuk RPMI ortamına yerleştirin.
2. LN'yi izole etmek için fareyi yatay bir pozisyona getirin, alttan üste doğru orta hat cilt insizyonu yapın, dikkatli bir şekilde periton keserek cildi hafifçe dışarıya yayın. Tüm inguinal, bel, aksiller, brakiyal ve servikal LN toplandığında ( Şekil 1C , kırmızı renklidir), periton kesilir ve bağırsağın sol üst tarafındaki dalağı izole eder.
3. Dalak ve LN'yi 100 μm'lik bir filtre yerleştirerek ayırın.50 mL'lik bir tüpün üstünde. 1 mL'lik şırınganın pistonu kullanarak, dokuyu hafifçe bastırın. Filtreyi temizleyene kadar RPMI ortamı ile gerektiği kadar çalkalayın.
   NOT: Her fareden alınan LN ve dalaklar, aynı tüp içerisinde bir araya getirilebilir.
4. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün.
5. Pelleti 2 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
6. Liziz tamponunu nötralize etmek için 2 mL RPMI ortamı ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün.
7. RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp aktarın.
8. Anti-fare CD4 APC (0.6 μg / μL) ve / veya anti-fare CD8 PeCy7 (2 μg / μL) için boyayın. Floresan antikorları ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika süreyle 4 ° C'de buzdolabında tüpleri inkübe edin.
   NOT: Tek lekeli telafi için negatif bir kontrol tüpü hazırlayın (leke yoktur) veFlorokromların her biri ile tek tek etiketli hücreler içeren tüpler.
9. Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
   NOT: CFSE boya, genellikle 50 ug'de karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester tozu olarak sağlanır. 5 mM son stok solüsyonu için bir CFSE şişesine 18 uL DMSO ekleyin ve birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.
10. CFSE etiketi için, CD8 lekeli hücreleri, stok çözeltisinden 5 μM CFSE'nin nihai bir çalışma konsantrasyonunda PBS içinde mL başına 10 ⁶ hücreye kadar bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon haline getirin. Daha önce tarif edildiği gibi 5 dakika süreyle 20 ° C'de bir banyoda inkübe edin ⁶ .
    NOT: (ÖNEMLİ ADIM) Düşük konsantrasyonda (≤10 ⁶ / mL) hücreler için, hücrelerin, CFSE'nin toksik etkilerini tamponlamak için ilave protein varlığında etiketlenmesi gereklidir. Bu nedenle, PBS% 5 FBS içerebilir. Unutmayın ki benDiom kullanılırsa, serbest amino asitler CFSE için rekabet ederek etiketleme verimliliğini düşürebilir.
11. CFSE'yi 2 mL RPMI ortamı ile nötralize edin. 400 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürün. 1 x 10 ⁶ CD8 T hücre başına 1 mL RPMI orta ekleyin.
12. Sınıflamadan önce, numuneyi 5 mL'lik tüp kapakta 70 μm'lik hücre süzgeci ile aktarın. Bir hücre canlılığı markörü olarak 50 μL 1x DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama devam edin.
    NOT: 1x, reaktifin diğer bileşene göre 1: 1 oranı anlamına gelir.
13. Çifte pozitif CD8 ⁺ CFSE ⁺ T hücrelerini izole etmek için sıralama koşullarını 20 psi ve 100 μm nozul boyutunda ayarlayın ( Şekil 3A ).
14. Toplama tüplerini 1 mL'lik RPMI ortamı ile 5 mL polipropilen tüp içerisinde hazırlayın ve sıralamaya devam edin.
15. Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin.
16. CD4 ⁺ T hücre izolasyonu için,Dendritik hücreler gibi büyük taneli hücrelerin yanı sıra enkaz hariç, FSC'yi SSC ve kapı lenfositlerini çalar.
    1. Bu ana kapıda, SSC'yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun.
    2. Bu yeni kapılı popülasyonda, tüm CD4 ⁺ hücrelerini izole etmek için SSC'ye CD4'ü gösteren bir nokta çizelgesi oluşturun ( Şekil 3B ). Alternatif olarak saf T hücre popülasyonlarının izolasyonunu sağlamak için bir anti-CD3 mAb kullanılabilir.
       NOT: Tüm CD4 ⁺ T hücrelerinin küçük bir fraksiyonu (% 5-10) Foxp3 ⁺ mRFP ⁺ olmalıdır.
17. Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (>% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 2x10 ⁶ T hücre başına 1 mL eksiksiz RPMI ortamı kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin.
18. Daha önceden sıralanmış makrofajlar ile T hücrelerini kültürleyerek bastırma tahlilini oluşturun. Plaka 10 x 10 ⁴ CD4 ⁺ T ve 10 x 10 ⁴ CD8 ⁺ CFSE ⁺ T hücrelerinin aynı oyukta 100 ul tamamlanmış RPMI ortamında eklendi. 96 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
    NOT: Makrofajlar ve T hücreleri 1: 4 oranında kullanılmıştır.
19. Azid içeren tamponu temizlemek için bunları kullanmadan önce T hücre bölünmesini T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 manyetik boncuklarını 2 mL PBS içinde yıkayarak stimüle edin. Her göz başına 5 μL fare T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 boncuk ekleyin.
    NOT: Manyetik boncuklar, antijen sunan hücrelere benzer boyuttadır ve anti-CD3 ve anti-CD28 mAb ile birleşir ve T hücrelerinin aktivasyonu ve genişletilmesi için basit bir yöntem sunar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Temsili sonuçlar yukarıdaki protokolde açıklanan geçiş stratejisini göstermektedir. Sonuçlar, greftle sızdıran makrofajlar ile birlikte kültürden sonra T-hücresi çoğalma aktivitesinin analizini de göstermektedir. Makrofaj alt gruplarının in vitro baskılayıcı kapasitesi Şekil 4'te analiz edilmiştir. Sonuçlar, toleranslı alıcılardan elde edilen Ly6C ^lo Ly6G ^- makrofajların baskılayıcı olduğunu göstermekted...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, farklı murin deneysel modellerindeki diğer dokular için de geçerli olan, deneysel bir mürin kalp transplantasyon modelinde greft infiltre eden miyeloid hücre alt gruplarını immüno-karakterize eden yöntemleri tanımlamaktadır. 20 psi'de düşük basınç hücreli sıralama, saf hücre alt gruplarının iyi bir verimliliğini izole etmek için tercih edilen yöntemdi. Her bir miyeloid alt kümesinin saflığını muhafaza etmek, farklı miyeloid popülasyonlar arasındaki baskılayıcı kapasit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Esential amino acids	Corning	25025039
1 M HEPES buffer	Corning	25060CL
100 mM Sodium Pyruvate	ThermoScientific	SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagenese A	Roche	70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)	Corning	21031CV
70 µm Cell strainer	Fisher	22363548
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-bottom plate	Corning	353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Flow Cytometer	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	The Jackson Laboratory	008374
C57BL/6	The Jackson Laboratory	000664
Balb/c	The Jackson Laboratory	000651