Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Zusammenfassung

Makrophagen sind Plastikzellen des hämatopoetischen Systems, die eine entscheidende Rolle bei der schützenden Immunität und Homöostase haben. In diesem Bericht beschreiben wir optimierte in vitro- Techniken zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von pfropf-infiltrierenden regulatorischen Makrophagen, die sich im transplantierten Organ unter toleranten Bedingungen ansammeln.

Zusammenfassung

Makrophagenakkumulation in transplantierten Organen ist seit langem als ein Merkmal der Allotransplantatabstoßung erkannt worden ¹ . Immunogene Monozyten infiltrieren das Allotransplantat früh nach der Transplantation, pflegen eine pfropfreaktive Reaktion gegen das transplantierte Organ und initiieren die Organabstoßung ² . Jüngste Daten deuten darauf hin, dass unterdrückende Makrophagen eine erfolgreiche Langzeit-Transplantation ³ ermöglichen und für die Induktion der Transplantationstoleranz erforderlich sind ⁴ . Dies deutet auf ein multidimensionales Konzept der Makrophagen-Ontogenese, Aktivierung und Funktion hin, das eine neue Roadmap für die Isolierung und Analyse der Makrophagen-Funktion erfordert. Aufgrund der Plastizität von Makrophagen ist es notwendig, eine Methodik zur Isolierung und Charakterisierung von Makrophagen in Abhängigkeit von der Gewebeumgebung vorzusehen und ihre Funktionen nach verschiedenen Szenarien zu definieren. Hier beschreiben wirEin Protokoll für die Immuncharakterisierung von Transplantat-infiltrierenden Makrophagen und die Methoden, mit denen wir ihre Fähigkeit, die CD8 ⁺ T-Proliferation zu hemmen, funktionell zu bewerten und die CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg-Expansion in vitro zu fördern.

Einleitung

Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die Funktion von Gewebe-infiltrierenden Makrophagen, die aus kardialen Allotransplantaten isoliert wurden, nach ihrer Fähigkeit, T-Zell-Antworten zu modulieren, zu untersuchen. In der Literatur weithin beschrieben, sind fluoreszierende Zellverfolgungsfarbstoffe in Kombination mit Durchflusszytometrie mächtige Werkzeuge, um die suppressive Funktion spezifischer Zelltypen in vitro und in vivo zu untersuchen . Unser Protokoll folgt dem Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) -Verfahren zur Überwachung der Lymphozytenproliferation in vitro .

Wenn eine CFSE-markierte Zelle sich teilt, erhält ihre Nachkommenschaft die Hälfte der Anzahl der Carboxyfluorescein-markierten Moleküle ⁶ . Die entsprechende Abnahme der Zellfluoreszenz durch Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen, wobei die Kapazität der suppressiven Makrophagen überwacht wird, um T-Zell-Immunantworten zu modulieren. Da CFSE ein Fluorescein-basierter Farbstoff ist, ist er mit einem brOad Bereich der anderen Fluorochrome, so dass es für Multi-Farb-Durchflusszytometrie. Die geeignete Wahl der Fluorochrome für die Phänotypisierung ist auch wichtig, um eine übermäßige spektrale Überlappung zu vermeiden und die Unfähigkeit, Antikörper-positive Zellen zu erkennen, insbesondere mit sichtbaren Proteinfarbstoffen wie CFSE ⁷ .

Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen gegenüber alternativen Techniken, die die Zellproliferation messen, wie der Thymidin-Inkorporationstest, der radioaktiv markiertes Thymidin (TdR) ⁸ verwendet. Dieser Assay verwendet tritiiertes Thymidin ( ³ H-TdR), das während der Mitosezellteilung in neue Stränge chromosomaler DNA eingebaut wird. Eine Sicherheitsbedeutung, die mit diesem Assay verbunden ist, ist die Verwendung von Radioisotopen, da ein Szintillationsbeta-Zähler verwendet wird, um die Radioaktivität in der aus den Zellen gewonnenen DNA zu messen, um das Ausmaß der Zellteilung zu bestimmen. Methodisch ist der tritiierte Thymidin assAy ist nicht flexibel genug, um wichtige klinische Laborbeschränkungen wie z. B. niedrige Anzahl von Zellen und verzögerte Analyse nach der Färbung anzupassen. Im Gegenteil wurde gezeigt, dass die CFSE-Färbung die Zellproliferation verhindert und kritische Aktivierungsmarker wie CD69, HLA-DR und CD25 ⁹ stört. Daher ist das Verständnis von Vorteilen und Einschränkungen jeder Methodik, insbesondere bei mehrfarbigen Studien, bei denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, entscheidend für die Erzielung genauer und reproduzierbarer Ergebnisse.

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Protokoll

In dieser Studie sind Mäuse in Übereinstimmung mit den Vereinigten Staaten Department of Agriculture Leitlinien und die Empfehlungen der Public Health Service Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht. Alle experimentellen Techniken, die den tierischen Gebrauch beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) -approved Protokolle der Mount Sinai School of Medicine durchgeführt.

1. Medienvorbereitung

1. Vorbereiten des vollständigen RPMI 1640-Mediums mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) unter Verwendung von 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES und 0,05 mM 2 -captoethanol

2. Allograft-Isolierung und Einzelzell-Suspension

ANMERKUNG: Die Transplantations- und Anastomosetechnik der Pulmonalarterie und der minderwertigen Cava-Vene wurde zunächst von Corry und Mitarbeitern beschrieben und kann in Liu & Kang visualisiert werdenS = "xref"> 10 ^{, 11} ( Abbildung 1A ).

1. Anästhesieren einer transplantierten Maus mit 4-5% Isofluran in einer Induktionskammer. Opfer es durch zervikale Versetzung.
2. Machen Sie eine Mittellinie Bauch-Inzision mit Standard-Schere und entfernen Sie die Bauch-Inhalte, um die Aorta zu lokalisieren.
   ANMERKUNG: Das transplantierte Herz wird auf der rechten Seite der Empfangsabdominalaorta sein (Abbildung 1B ).
3. Ziehen Sie das Transplantat vorsichtig mit feiner Zigarettenzange heraus und legen Sie es sofort in eiskaltes RPMI-Medium.
   HINWEIS: Mit einer Chirurgie Schere, um das Transplantat von der Aorta zu trennen, kann das Transplantat beschädigen und dazu führen, dass etwas Gewebe an den Empfänger haften bleibt.
4. Nachdem alle Transplantate gesammelt wurden, verschieben Sie sie in eine sterile Kulturhaube für die Gewebeverarbeitung. Legen Sie das Transplantat in eine Petrischale und würfeln Sie das Gewebe in kleine Stücke (1 mm) mit sterilen, stumpfen, mikrochirurgischen Scheren.
5. Mit scharfzähnenEps, transferieren die Stücke in ein 50 ml-Röhrchen mit 5 ml Kollagenase A (0,1 mg / ml Kollagenase in sterilem 1x PBS). Inkubieren Sie es für 1 h in einem 37 ° C Bad.
6. Füge 5 ml RPMI-Medium hinzu, um die Kollagenase zu neutralisieren und die Probe durch ein 100 μm Sieb mit Hilfe des Kolbens einer 1 ml-Spritze zu transferieren.
7. Die Probe bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abtropfen lassen.
8. Das Pellet wird in 1 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert. Gut mischen und 5 min bei 4 ° C inkubieren.
9. Füge 1 ml RPMI-Medium hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren und die Probe bei 400 xg für 5 m bei 4 ° C zu spinnen.
10. Das Zellpellet wird in 200 μl RPMI-Medium resuspendiert und auf ein 5-ml-Polypropylen-Rundbodenrohr überführt.
    HINWEIS: Polypropylenrohre unterstützen weniger Haftung. Auch die Aufrechterhaltung der Zellen bei niedriger Temperatur, wie 4 ° C, verringert die Haftung.

3. Isolierung von Graft-infiltrierenden Makrophagen mit Fluoreszenz-aktivierter Zell-SortierungIng

1. Blockieren Sie unerwünschte spezifische Bindung an myeloiden Zellen unter Verwendung von Fc-Rezeptor-blockierenden mAb (Ratten-anti-Maus CD16 / 32). Füge 1-2 μl pro Probe hinzu, 15 min vor der Oberflächenfärbung.
2. Flecken mit anti-Maus CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL Endkonzentration im RPMI-Medium), anti-Maus CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μL), anti-Maus Ly6C APC (2 μg / μL) Und anti-Maus Ly6G Pe / Cy7 (2 & mgr; g / & mgr; l). Decken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie ab, um die fluoreszierenden Antikörper vor Licht zu schützen und die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C für 45 min zu inkubieren.
   HINWEIS: Für Einmal-Kompensationen, bereiten Sie ein negatives Kontrollrohr (kein Fleck) und Röhrchen mit Zellen, die einzeln mit jedem der Fluorochrome markiert sind. Um das Tor einzurichten, können Isotyp-Kontrollen besonders für Ly6C (IgG2a) und Ly6G (IgG2b) verwendet werden.
3. Die Zellen zweimal mit RPMI-Medium waschen und bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem HämocytometeR und verdünnen sie in 1 ml RPMI-Medium pro 1 x 10 ⁶ Zellen. Vor der Sortierung die Proben durch eine 5 ml, 70 μm Zelle Siebschlauchkappe überführen. Füge DAPI (1 μg / mL) als Zell-Lebensfähigkeitsmarker hinzu und gehe weiter.
4. Weil Makrophagen empfindliche und zerbrechliche Zellen sind, setzen Sie die Sortierbedingungen auf 20 psi und verwenden eine 100 μm Düsengröße, um Makrophagen mit einem 4-Wege-Reinheitsmodus zu isolieren.
5. Bereiten Sie Sammelröhrchen mit 1 ml RPMI-Medium in einem 5-ml-Polypropylen-Rohr vor.
6. Mit der Sortierersoftware öffnen Sie das neue Experiment und wählen das Leer-Experiment mit einem leeren Panel aus, um Einstellungen zu definieren.
7. Richten Sie einen Punkt-Plot ein, der die Vorwärts- (FSC) versus ( vs. ) Seitenstreuung (SSC) anzeigt und auf alle Leukozyten, ohne Schutt und Klumpen mit der niedrigsten Vorwärts- und Seitenstreuung, Von diesem übergeordneten Gate, erstellen Sie eine neue Punkt-Diagramm, das SSC vs. DAPI und Gate auf DAPI-Zellen zeigt.
   1. Auf dieser neu geschalteten Bevölkerung erstellen Sie adOt-Plot, das CD11b gegen CD45 und Gate auf doppelt-positiven (CD11b ⁺ CD45 ⁺ ) Makrophagen und Neutrophilen zeigt.
   2. Von hier aus schaffen Sie ein endgültiges Punktdiagramm, das Ly6C vs. Ly6G anzeigt und die wünschenswerten Populationen lügt: Ly6C ^hi Ly6G ^- , Ly6C ^lo Ly6G ^- und Ly6C ^int Ly6G ⁺ (Abbildung 2 ).
8. Nach der Sortierung auf Reinheit und Zelllebensfähigkeit (> 90%) prüfen und die Sammelröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer und resuspendieren sie in der gewünschten Konzentration ( z. B. 1 x 10 ⁶ Makrophagen / ml) in komplettem RPMI-Medium.
9. Platte 50 x 10 ³ Makrophagen pro Vertiefung in einer 96-Well-Rundbodenplatte mit einem Endvolumen von 100 & mgr; l vollständigem RPMI-Medium. Lassen Sie die Zellen für mindestens 24 h bei 37 ° C und 5% CO ₂ ungestört.

4. isolatioN von T-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung

HINWEIS: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn ist ein X-verknüpfter, gezielter Knock-in-Maus-Stamm, der Zellen markiert, die das Foxp3 (Gabelkopf-Kasten-P3) -Gen mit monomerem rotem fluoreszierendem Protein (mRFP) exprimieren.

1. Anästhesieren und Opfern von C57BL / 6 und C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) Mäusen, wie zuvor in Schritt 2.1 beschrieben. Isoliere die Milz und Lymphknoten (LN: Leisten-, Lenden-, Axillar-, Brachial- und Gebärmutterhalskrebs) und platziere sie schnell in eiskaltes RPMI-Medium.
2. Um das LN zu isolieren, platziere die Maus in eine Rückenlage, mache einen Mittellinie Hautschnitt von unten nach oben, sorgfältig schneiden das Bauchfell und sanft Ausbreitung der Haut auseinander. Sobald alle Leisten-, Lenden-, Achsel-, Brachial- und Zervix-LN gesammelt werden (Abbildung 1C , in Rot gefärbt), schneiden Sie das Peritoneum und isolieren die Milz an der oberen linken Seite des Darms.
3. Dispergieren der Milz und LN mit einem 100 μm Filter platziertOben auf einem 50 mL Rohr. Mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze das Gewebe vorsichtig drücken. Spülen Sie den Filter mit RPMI-Medium so oft wie nötig, bis es sauber ist.
   ANMERKUNG: LN und Milz von jeder Maus können zusammen in der gleichen Tube zusammengefasst werden.
4. Bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abreiben.
5. Das Pellet wird in 2 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert. Gut mischen und 5 min bei 4 ° C inkubieren.
6. Füge 2 ml RPMI-Medium hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren. Bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abreiben.
7. Das Zellpellet wird in 200 & mgr; l RPMI-Medium resuspendiert und auf ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr gegeben.
8. Fleck für anti-Maus CD4 APC (0,6 μg / μL) und / oder anti-Maus CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Bedecken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie, um die fluoreszierenden Antikörper vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C für 45 min.
   HINWEIS: Für Einmal-Kompensationen, bereite ein Negativ-Kontrollrohr (kein Fleck) undRöhrchen mit einzeln markierten Zellen mit jedem der Fluorochrome.
9. Die Zellen zweimal mit RPMI-Medium waschen und bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer.
   ANMERKUNG: CFSE-Farbstoff wird als Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester-Pulver gewöhnlich bei 50 & mgr; g bereitgestellt. Füge 18 μL DMSO zu einer Ampulle von CFSE für eine endgültige Stammlösung von 5 mM hinzu und lag bei -20 ° C für mehrere Monate.
10. Für die CFSE-Markierung werden CD8-gefärbte Zellen in einer Konzentration von bis zu 10 ⁶ Zellen pro ml in PBS bei einer Endarbeitskonzentration von 5 μM CFSE aus der Stammlösung resuspendiert. Inkubieren sie in einem Bad bei 20 ° C für 5 min wie zuvor beschrieben ⁶ .
    HINWEIS: (CRITICAL STEP) Für Zellen mit einer niedrigen Konzentration (≤10 ⁶ pro ml) ist es wesentlich, dass die Zellen in Gegenwart von Protein markiert werden, um die toxischen Effekte von CFSE zu puffern. Daher kann PBS 5% FBS enthalten. Beachten Sie, dass wenn ichDium verwendet wird, können freie Aminosäuren die Markierungseffizienz durch Konkurrenz für CFSE senken.
11. Neutralisieren des CFSE mit 2 ml RPMI-Medium. Spin bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Füge 1 ml RPMI-Medium pro 1 x 10 ⁶ CD8 T-Zellen hinzu.
12. Vor der Sortierung die Probe durch ein 70 μm Zellsieb auf eine 5 mL Röhrchenkappe überführen. Füge 50 μl 1x DAPI (1 μg / mL) als Zelllebensfähigkeitsmarker hinzu und gehe zur Sortierung vor.
    HINWEIS: 1x bedeutet 1: 1 Verhältnis des Reagenzes gegenüber anderen Bestandteilen.
13. Stellen Sie die Sortierbedingungen auf 20 psi und 100 μm Düsengröße ein, um doppelt-positive CD8 ⁺ CFSE ⁺ T-Zellen zu isolieren (Abbildung 3A ).
14. Bereiten Sie Sammelröhrchen mit 1 ml RPMI-Medium in einem 5-ml-Polypropylen-Röhrchen vor und gehen Sie weiter.
15. Mit der Sortierersoftware öffnen Sie das neue Experiment und wählen das Leer-Experiment mit einem leeren Panel aus, um Einstellungen zu definieren.
16. Für CD4 ⁺ T-Zell-Isolation, richten Sie ein Punkt-Diagramm, dass disSpielt den FSC gegen SSC und Gate auf Lymphozyten, ohne Schutt sowie große körnige Zellen, wie dendritische Zellen.
    1. Von diesem übergeordneten Gate, erstellen Sie eine neue Punkt-Diagramm, das SSC vs. DAPI und Gate auf DAPI-Zellen zeigt.
    2. Auf dieser neu geschalteten Population erstellen Sie ein Punktdiagramm, das SSC vs. CD4 anzeigt, um alle CD4 ⁺ Zellen zu isolieren (Abbildung 3B ). Alternativ kann ein anti-CD3-mAb verwendet werden, um die Isolierung von reinen T-Zellpopulationen zu gewährleisten.
       HINWEIS: Ein kleiner Bruchteil aller CD4 ⁺ T-Zellen (5-10%) sollte Foxp3 ⁺ mRFP ^{+ sein} .
17. Nach der Sortierung auf Reinheit und Zelllebensfähigkeit (> 90%) prüfen und die Sammelröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer. Resuspend unter Verwendung von 1 ml vollständigem RPMI-Medium pro 2 × 10 ⁶ T-Zellen.
18. Einstellen des Suppressionstests durch Kultivierung von T-Zellen mit zuvor sortierten Makrophagen. Teller 10 x 10 ⁴ CD4 ⁺ T und 10 x 10 ⁴ CD8 ⁺ CFSE ⁺ T-Zellen in der gleichen Vertiefung in einem Endvolumen von 100 & mgr; l vollständigem RPMI-Medium. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 96 h.
    HINWEIS: Makrophagen und T-Zellen wurden im Verhältnis 1: 4 verwendet.
19. Stimulieren der T-Zellteilung durch Waschen von T-Zell-Aktivator CD3 / CD28-Magnetperlen in 2 ml PBS, bevor sie verwendet werden, um den Azid-haltigen Puffer zu entfernen. Füge 5 μl Maus-T-Zell-Aktivator CD3 / CD28 Perlen pro Vertiefung hinzu.
    HINWEIS: Magnetperlen sind ähnlich wie Antigen-präsentierende Zellen und sind mit anti-CD3 und anti-CD28 mAb gekoppelt und bieten ein einfaches Verfahren zur Aktivierung und Erweiterung von T-Zellen.

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Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die im obigen Protokoll beschriebene Gating-Strategie. Die Ergebnisse zeigen auch die Analyse der T-Zell-Proliferationsaktivität nach der Co-Kultur mit pfropf-infiltrierenden Makrophagen. Die in vitro- suppressive Kapazität von Makrophagen-Teilmengen wurde in Abbildung 4 analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus tolerierten Empfängern gewonnenen Ly6C ^lo Ly6G ^- Makrophagen unterdrückend sind. ...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, mit denen wir pfropf-infiltrierende myeloide Zelluntergruppen in einem experimentellen Mausmodell der Herztransplantation immunocharakterisieren, was auch für andere Gewebe in verschiedenen murinen experimentellen Modellen gilt. Die Niederdruckzellsortierung bei 20 psi war die bevorzugte Methode, um eine gute Ausbeute an reinen Zelluntergruppen zu isolieren. Die Aufrechterhaltung der Reinheit jeder myeloiden Teilmenge ist entscheidend, um schlüssige Ergebnisse der Unterdrücku...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Esential amino acids	Corning	25025039
1 M HEPES buffer	Corning	25060CL
100 mM Sodium Pyruvate	ThermoScientific	SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagenese A	Roche	70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)	Corning	21031CV
70 µm Cell strainer	Fisher	22363548
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-bottom plate	Corning	353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Flow Cytometer	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	The Jackson Laboratory	008374
C57BL/6	The Jackson Laboratory	000664
Balb/c	The Jackson Laboratory	000651