JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Макрофаги представляют собой пластиковые клетки гемопоэтической системы, которые играют решающую роль в защитном иммунитете и гомеостазе. В этом отчете мы описываем оптимизированные методы in vitro для фенотипической и функциональной характеристики трансплантируемых регуляторных макрофагов, которые накапливаются в трансплантированном органе в условиях толерогенности.

Аннотация

Накопление макрофагов в трансплантированных органах уже давно признано признаком отторжения аллотрансплантата 1 . Иммуногенные моноциты проникают в аллотрансплантат рано после трансплантации, устанавливают реактивный ответ трансплантата против трансплантированного органа и инициируют отторжение органа. Недавние данные свидетельствуют о том, что подавляющие макрофаги облегчают успешную долгосрочную трансплантацию 3 и необходимы для индукции толерантности к трансплантации 4 . Это предполагает многомерную концепцию онтогенеза, активации и функции макрофагов, которая требует новой дорожной карты для изоляции и анализа функции макрофагов 5 . Из-за пластичности макрофагов необходимо предоставить методологию для выделения и характеристики макрофагов в зависимости от тканевой среды и определения их функций в соответствии с различными сценариями. Здесь мы descriБыть протоколом для иммунной характеристики привитых трансплантатом макрофагов и методов, которые мы использовали для функциональной оценки их способности ингибировать пролиферацию CD8 + T и стимулировать экспрессию CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .

Введение

В этом протоколе описаны методы in vitro для изучения функции тканепроникающих макрофагов, выделенных из аллотрансплантатов сердца, в соответствии с их способностью модулировать ответы Т-клеток. Широко описанные в литературе флуоресцентные клеточные следящие красители в сочетании с проточной цитометрией являются мощными инструментами для изучения супрессивной функции конкретных типов клеток in vitro и in vivo. Наш протокол следует методу карбоксифлуоресцеина сукцинимидина (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов in vitro .

Когда клетка с мечеными CFSE делит, ее потомство получает половину числа молекул, меченных карбоксифлуоресцеином 6 . Соответствующее снижение клеточной флуоресценции проточной цитометрией может быть использовано для оценки деления клеток, контроля способности супрессивных макрофагов модулировать Т-клеточные иммунные ответы. Поскольку CFSE представляет собой краситель на основе флуоресцеина, он совместим с brOad ряда других флуорохромов, что делает его применимым к многоцветной проточной цитометрии. Соответствующий выбор флуорохромов для фенотипирования также важен, чтобы избежать чрезмерного спектрального перекрытия и невозможности распознавания антителоположительных клеток, особенно с видимыми белковыми красителями, такими как CFSE 7 .

Существует много преимуществ использования флуоресцентных красителей в отношении альтернативных методов, которые измеряют пролиферацию клеток, таких как анализ включения тимидина, который использует радиоактивно меченный тимидин (TdR) 8 . В этом анализе используют тритированный тимидин ( 3 H-TdR), который вводится в новые нити хромосомной ДНК во время деления митотических клеток. Проблема безопасности, связанная с этим анализом, заключается в использовании радиоизотопов, поскольку сцинтилляционный бета-счетчик используется для измерения радиоактивности ДНК, выделенной из клеток, для определения степени деления клеток. Методологически, тритированная тимидиновая задницаAy не является достаточно гибким, чтобы соответствовать важным клиническим лабораторным ограничениям, таким как небольшое количество клеток и отложенный анализ после окрашивания. Было показано, что окрашивание CFSE предотвращает пролиферацию клеток и вмешивается в критические маркеры активации, такие как CD69, HLA-DR и CD259. Поэтому понимание преимуществ и ограничений каждой методологии, особенно в многоцветных исследованиях, где несколько красителей используются для отслеживания различных типов клеток, имеет решающее значение для получения точных и воспроизводимых результатов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В этом исследовании мышей размещают в соответствии с руководящими принципами Департамента сельского хозяйства Соединенных Штатов и рекомендациями Руководства по обслуживанию и использованию лабораторных животных в Службе общественного здравоохранения. Все экспериментальные методы, связанные с использованием животных, проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институтом по уходу за животными и утилизации (IACUC) в Медицинской школе горы Синай.

1. Подготовка средств массовой информации

  1. Подготовьте полную среду RPMI 1640 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином (10000 U / мл) с использованием 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ незаменимых аминокислот, 5 мМ HEPES и 0,05 мМ 2 меркаптоэтанола.

2. Изоляция аллотрансплантата и одноклеточная суспензия

ПРИМЕЧАНИЕ. Методика трансплантации и анастомоза легочной артерии и нижней впадины кавы первоначально была описана Корри и сотрудниками и может быть визуализирована в Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( рисунок 1A ).

  1. Анестезируйте трансплантированную мышь с 4-5% изофлураном в индукционной камере. Пожертвуйте его цервикальной дислокацией.
  2. Сделайте срединный разрез брюшной полости со стандартными ножницами и удалите содержимое брюшной полости, чтобы локализовать аорту.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пересаженное сердце будет на правой стороне абдоминальной аорты реципиента ( рис. 1B ).
  3. Вытяните трансплантат осторожно, используя тонкие пинцеты с острыми зубами, и немедленно поместите его в ледяную среду RPMI.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Использование хирургической ножницы для отделения трансплантата от аорты может повредить трансплантат и привести к тому, что некоторые ткани останутся привязанными к получателю.
  4. После того как все прививки были собраны, переместите их в стерильный культуральный капюшон для обработки тканей. Поместите трансплантат в чашку Петри и нарежьте ткань на мелкие кусочки (1 мм), используя стерильные, тупые ножницы для микрохирургии.
  5. С острыми зубьями forcEps, перенесите кусочки в трубку объемом 50 мл с 5 мл коллагеназы A (0,1 мг / мл коллагеназы в стерильном 1x PBS). Инкубируйте его в течение 1 часа в ванне с температурой 37 ° C.
  6. Добавьте 5 мл среды RPMI, чтобы нейтрализовать коллагеназу и перенести образец через фильтр 100 мкм с помощью плунжера 1 мл шприца.
  7. Прокрутите образец до 400 xg в течение 5 минут при 4 ° C.
  8. Ресуспендируют гранулу в 1 мл буфера для лизиса ACK. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин при 4 ° С.
  9. Добавьте 1 мл среды RPMI для нейтрализации буфера для лизиса и открутите образец до 400 xg на 5 м при 4 ° C.
  10. Ресуспендируют клеточный осадок в 200 мкл среды RPMI и переносят его в 5 мл полипропиленовую круглодонную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Трубы из полипропилена обеспечивают меньшую адгезию. Кроме того, поддержание клеток при низкой температуре, например 4 ° C, снижает адгезию.

3. Выделение макрофагов, проникающих в графт-инфильтрацию, с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клетокИНГ

  1. Блокируйте нежелательное специфическое связывание с миелоидными клетками с помощью блокирующего mAb рецептора Fc (крысиный антимышиный CD16 / 32). Добавьте 1-2 мкл на образец, за 15 мин до окрашивания поверхности.
  2. Пятно с антимышиным CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 мкг / мкл конечной концентрации в среде RPMI), антимышиный CD45 APC / eFluor780 (0,6 мкг / мкл), антимышиный LyCC (2 мкг / мкл) И антимышиной Ly6G Pe / Cy7 (2 мкг / мкл). Накройте трубки алюминиевой фольгой для защиты флуоресцирующих антител от света и инкубируйте трубки в холодильнике при 4 ° C в течение 45 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для однократных компенсаций подготовьте отрицательную контрольную трубку (без пятен) и трубки с ячейками, помеченными отдельно с каждым из флуорохромов. Чтобы помочь настроить ворота, элементы управления изотипами могут использоваться, в частности, для Ly6C (IgG2a) и Ly6G (IgG2b).
  3. Промойте клетки дважды средой RPMI и закрутите их при 400 xg в течение 5 минут при 4 ° C. Подсчитайте клетки с использованием трипанового синего и гемоцитометромR и разбавить их в 1 мл среды RPMI на 1 × 10 6 клеток. Перед сортировкой перенесите образцы через пробирку с фильтром на 5 мл, 70 мкм. Добавьте DAPI (1 мкг / мл) в качестве маркера жизнеспособности клеток и продолжайте сортировку.
  4. Поскольку макрофаги являются чувствительными и хрупкими клетками, установите условия сортировки на 20 фунтов на квадратный дюйм и используйте размер сопла 100 мкм для выделения макрофагов с использованием режима 4-сторонней чистоты.
  5. Подготовьте трубки для сбора с 1 мл среды RPMI в 5 мл полипропиленовой трубке.
  6. Используя программное обеспечение сортировщика, откройте новый эксперимент и выберите пустой эксперимент с пустой панелью, чтобы определить настройки.
  7. Настройте точечный график, который отображает прямой (FSC) против ( против ) боковой разброс (SSC) и ворота на всех лейкоцитах, исключая обломки и комки с самым низким передним и боковым разбросом. Из этого родительского ворот создайте новый график точек, который отображает SSC против DAPI и ворота на DAPI-элементах.
    1. Создайте объявление для этого новообразованного населения.От графика, который отображает CD11b против CD45 и ворота на двухпозитивных (CD11b + CD45 + ) макрофагах и нейтрофилах.
    2. Отсюда создайте конечный участок с изображением Ly6C по сравнению с Ly6G и заставьте желаемые группы: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - и Ly6C int Ly6G + ( рис. 2 ).
  8. После сортировки проверьте чистоту и жизнеспособность клеток (> 90%) и вращайте сборные трубки на 400 xg в течение 5 минут при 4 ° C. Подсчитайте клетки с использованием трипанового синего и гемоцитометра и ресуспендируйте их в желаемой концентрации ( например, 1 × 10 6 макрофагов / мл) в полной среде RPMI.
  9. Плита 50 х 10 3 макрофагов на лунку в 96-луночном круглодонном планшете с конечным объемом 100 мкл полной среды RPMI. Оставьте клетки невозмутимыми в течение не менее 24 часов при 37 ° C и 5% CO 2 .

4. ИзоляцияN T-клеток с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток

ПРИМЕЧАНИЕ. C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn представляет собой X-связанный целевой штампованный штамм мыши, который координирует клетки, экспрессирующие ген Foxp3 (брандмауэр P3) с мономерным красным флуоресцентным белком (mRFP).

  1. Анестезируйте и пожертвуйте мышам C57BL / 6 и C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b), как описано выше на этапе 2.1. Изолируйте селезенку и лимфатические узлы (LN: паховые, поясничные, подмышечные, плечевые и шейные) и быстро размещайте их на ледяной среде RPMI.
  2. Чтобы изолировать LN, поместите мышь в положение лежа на спине, сделайте срединный разрез кожи снизу вверх, тщательно отрезая брюшину и осторожно распределяя кожу. Как только все паховые, поясничные, подмышечные, плечевые и шейные LN собираются ( рис. 1C , окрашены в красный цвет), срезайте брюшину и изолируйте селезенку в верхней левой части кишечника.
  3. Дезагрегируйте селезенку и LN, используя фильтр размером 100 мкмНа верхней части трубки объемом 50 мл. Используя плунжер 1-мл шприца, осторожно нажмите на ткань. Промойте фильтр средой RPMI столько раз, сколько необходимо, пока он не станет чистым.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LN и селезенка от каждой мыши могут объединяться вместе в ту же самую трубку.
  4. Скрутите при 400 × g в течение 5 мин при 4 ° C.
  5. Ресуспендируют гранулу в 2 мл буфера для лизиса ACK. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин при 4 ° С.
  6. Добавьте 2 мл среды RPMI для нейтрализации буфера для лизиса. Скрутите при 400 × g в течение 5 мин при 4 ° C.
  7. Ресуспендируют клеточный осадок в 200 мкл среды RPMI и переносят его в 5-миллилитровую круглодонную трубку из полистирола.
  8. Пятно для антимышиного CD4 APC (0,6 мкг / мкл) и / или антимышиного CD8 PeCy7 (2 мкг / мкл). Накройте трубки алюминиевой фольгой для защиты флуоресцирующих антител от света и инкубируйте трубки в холодильнике при 4 ° C в течение 45 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для однократных компенсаций подготовьте отрицательную контрольную трубку (без пятен) иТрубки с ячейками, помеченными отдельно с каждым из флуорохромов.
  9. Промойте клетки дважды средой RPMI и закрутите их при 400 xg в течение 5 минут при 4 ° C. Подсчитайте клетки с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ. CFSE-краситель поставляется в виде порошка сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина диацетата обычно при 50 мкг. Добавить 18 мкл ДМСО в ампулу CFSE для конечного исходного раствора 5 мМ и хранить при -20 ° С в течение нескольких месяцев.
  10. Для маркировки CFSE ресуспендировать окрашенные CD8 клетки в концентрации до 10 6 клеток на мл в PBS при конечной рабочей концентрации 5 мкМ CFSE из исходного раствора. Инкубируйте их в ванне при 20 ° C в течение 5 минут, как описано ранее 6 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: (КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ) Для клеток с низкой концентрацией (≤10 6 на мл) необходимо, чтобы клетки были помечены в присутствии добавленного белка для буферизации токсических эффектов CFSE. Следовательно, PBS может содержать 5% FBS. Обратите внимание, что если яDium, свободные аминокислоты могут снизить эффективность маркировки, конкурируя за CFSE.
  11. Нейтрализуйте CFSE с помощью 2 мл среды RPMI. Спин при 400 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Добавьте 1 мл среды RPMI на 1 × 10 6 CD8 Т-клеток.
  12. Перед сортировкой перенесите образец через сетчатый фильтр размером 70 мкм на 5 мл колпачок. Добавить 50 мкл 1x DAPI (1 мкг / мл) в качестве маркера жизнеспособности клеток и перейти к сортировке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. 1x означает соотношение 1: 1 реагента по отношению к другому компоненту.
  13. Установите условия сортировки с размером сопла 20 фунтов на квадратный дюйм и 100 мкм для изоляции двухполюсных CD8 + CFSE + Т-клеток ( рисунок 3A ).
  14. Подготовьте трубки для сбора с 1 мл среды RPMI в 5 мл полипропиленовой трубке и продолжайте сортировку.
  15. Используя программное обеспечение сортировщика, откройте новый эксперимент и выберите пустой эксперимент с пустой панелью, чтобы определить настройки.
  16. Для изоляции CD4 + Т-клеток настройте точечный график, которыйИграет FSC против SSC и ворота на лимфоцитах, исключая мусор, а также крупные гранулированные клетки, такие как дендритные клетки.
    1. Из этого родительского ворот создайте новый график точек, который отображает SSC против DAPI и ворота на DAPI-элементах.
    2. На этом недавно заселенном населении создайте точечный график, который отображает SSC и CD4 для выделения всех CD4 + -клеток ( рисунок 3B ). Альтернативно, анти-CD3 mAb можно использовать для обеспечения выделения чистых популяций Т-клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Небольшая часть всех CD4 + T-клеток (5-10%) должна быть Foxp3 + mRFP + .
  17. После сортировки проверьте чистоту и жизнеспособность клеток (> 90%) и вращайте сборные трубки на 400 xg в течение 5 минут при 4 ° C. Подсчитайте клетки с использованием трипанового синего и гемоцитометра. Ресуспендируют, используя 1 мл полной среды RPMI на 2x10 6 Т-клеток.
  18. Настроить анализ подавления путем культивирования Т-клеток с ранее отсортированными макрофагами. Пластина 10 x 10 4 CD4 + T и 10 × 10 4 CD8 + CFSE + Т-клетки в той же лунке в конечном объеме 100 мкл полной среды RPMI. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 96 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Макрофаги и Т-клетки использовали в соотношении 1: 4.
  19. Стимулировать деление Т-клеток путем промывки магнитных шариков CD3 / CD28 с активацией Т-клеток в 2 мл PBS перед их использованием для очистки азидсодержащего буфера. Добавьте 5 мкл шариков CD3 / CD28 мышиных Т-клеток на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Магнитные бусины схожи по размеру с антигенпредставляющими клетками и связаны с анти-CD3 и анти-CD28 mAb, предлагая простой способ активации и расширения Т-клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Репрезентативные результаты показывают стратегию стробирования, описанную в вышеуказанном протоколе. Результаты также показывают анализ активности пролиферации Т-клеток после совместной культуры с трансплантирующими макрофагами. Подавляющая способность in vitro

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает методы, которые мы использовали для иммуноанализа трансплантат-проникающих миелоидных подмножеств на экспериментальной мышиной модели трансплантации сердца, которая также применима к другим тканям в разных экспериментальных моделях мыши. Сортировка ячейки ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы подтверждаем технический вклад проточной цитометрии, микрохирургии и биорезисторных / патологических центров исследовательского мастерства на горе Синай. Эта работа была поддержана COST Action BM1305: действия по фокусировке и ускорению клеточных толерогенных терапий (ФАКТТ), развивающие фонды Института трансплантации горы Синай Реканати / Миллер, министерство здравоохранения и инноваций SAF2013-48834-R и SAF2016-80031-R ДЖО

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10% FBSLife Technologies26140-079
1,000x 2-mercaptoethanolLife Technologies21985023
100x Pen/StrepLife Technologies15140122
100x L-glutamineLife Technologies25030081
100x Non Esential amino acidsCorning25025039
1 M HEPES buffer Corning25060CL
100 mM Sodium PyruvateThermoScientificSH30239.01
Penicilin/StreptavidynThermoScientific15140122
Collagenese ARoche70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)Corning21031CV
70 µm Cell strainerFisher22363548
ACK lysis bufferLife TechnologiesA10492-01
DAPISigma32670-5mg-F
CFSE-FITCInvitrogenC34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28Life Technologies11452D
96 well  U-bottom plateCorning353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APCeBioscience175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7Biolegend127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5eBioscience45011282
anti-CD45-APC/Cy7eBioscience47045182
anti-CD4-APCeBioscience17004181
anti-CD8-P/ Cy7eBioscience25008181
LSRII Flow CytometerBD Bioscience
FACSDiva SoftwareBD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J The Jackson Laboratory008374
C57BL/6The Jackson Laboratory000664
Balb/cThe Jackson Laboratory000651

Ссылки

  1. Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
  2. Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
  3. Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
  4. Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
  5. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
  6. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  7. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287(2012).
  8. Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
  9. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  10. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  11. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238(2007).
  12. Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
  13. Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
  14. Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
  15. Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
  16. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены