이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

요약

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

초록

이식 장기의 대 식세포 축적은 동종 이식 거부 ¹ 의 특징으로 오래 동안 인식되어왔다. 면역 원성 단핵구는 이식 후 조기에 동종 이식종에 침투하고, 이식 장기에 대한 이식편 반응 반응을 일으키며 장기 거부 반응을 시작합니다 ² . 최근 데이터는 억제 성 대 식세포가 장기 이식 성공을 촉진하고 이식 내성의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. 이것은 macrophage 기능의 분리 및 분석을위한 새로운 로드맵을 요구하는 macrophage ontogeny, activation 및 function의 다차원 개념을 제안합니다. 대 식세포의 소성 때문에 조직 환경에 따라 대 식세포를 분리하고 특성화하는 방법론을 제공하고 여러 시나리오에 따라 기능을 정의해야합니다. 여기, 우리는 descri이식편 침윤성 대 식세포의 면역 특성 규명 및 우리가 기능적으로 CD8 ⁺ T 증식을 억제 하고 체외에서 CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg 확장을 촉진시키는 능력을 기능적으로 평가하는 데 사용한 방법이 될 수 있습니다.

서문

이 프로토콜은 T 세포 반응을 조절하는 능력에 따라 심장 동종 이식으로부터 격리 된 조직 침윤성 대 식세포의 기능을 연구하기위한 시험 관내 기술을 기술한다. 문헌에 널리 기술되어 있듯이, 형광 세포 추적 염료는 유세포 분석과 함께 체외 및 특정 생체 내 특정 세포 유형 의 억제 기능을 연구하는 강력한 도구 입니다. 우리의 프로토콜 은 체외에서 림프구 증식을 모니터링하기 위해 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 방법을 따른다.

CFSE로 표지 된 세포가 분열하면 그 자손은 카르복시 플루 오레 신 표지 분자의 수의 절반을 얻습니다. 유동 세포 계측법에 의한 세포 형광의 감소는 T 세포 면역 반응을 조절하는 억제 성 대 식세포의 능력을 모니터링하는 세포 분열을 평가하는데 사용될 수있다. CFSE는 플루 오레 신계 염료이기 때문에 br다량의 유동 세포 계측법에 적용 할 수있는 다른 형광 크로마토 그래피의 범위를 제공합니다. phenotyping을위한 fluorochromes의 적절한 선택은 과도한 스펙트럼의 중복과 항원 양성 세포, 특히 CFSE ⁷ 와 같은 가시 단백질 염료를 인식하지 못하는 것을 피하기 위해서도 중요합니다.

방사성 표지 된 티미 딘 (TdR) ⁸ 을 사용하는 티미 딘 도입 분석과 같은 세포 증식을 측정하는 대체 기술에 비해 형광 염료를 사용하면 많은 이점이 있습니다. 이 분석은 mitotic 세포 분열 동안 염색체 DNA의 새로운 가닥에 통합되는 삼중 티미 딘 ( ³ H-TdR)을 이용한다. 이 분석과 관련된 안전 문제는 방사성 동위 원소의 사용이다. 왜냐하면 신틸레이션 베타 계수기가 세포 분열 정도를 결정하기 위해 세포에서 회수 된 DNA의 방사능을 측정하기 때문이다. 방법 론적으로, 삼중 수소 티미 딘 엉덩이ay는 세포 수가 적고 염색 후 지연된 분석과 같은 중요한 임상 실험실 제약 조건에 맞을만큼 유연하지 않습니다. 반대로, CFSE 염색은 세포 증식을 예방하고 CD69, HLA-DR 및 CD25와 같은 중요한 활성화 마커를 방해하는 것으로 나타났습니다. 따라서 각 방법론의 장점과 한계를 이해하는 것은 특히 여러 염료를 사용하여 여러 세포 유형을 추적하는 다색 연구에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.

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프로토콜

이 연구에서 쥐는 미국 농무성 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 보건 서비스 안내서의 권고에 따라 보관됩니다. 동물 실험과 관련된 모든 실험 기술은 Mount Sinai School of Medicine의 IACUC (Institutional Animal Care and Utilization Committee) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 미디어 준비

1. 2 MM L - 글루타민, 1 MM 나트륨 피루 베이트, 0.1 MM 비 필수 아미노산, 5 MM HEPES 및 0.05 MM 2를 사용하여 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (10,000 U / ML)와 완전한 RPMI 1640 매체를 준비 - 머 캅토 에탄올.

2. 동종 이식 및 단일 세포 현탁액

참고 : 폐동맥과 하대 정맥 정맥의 이식 및 문합 기법은 Corry와 공동 작업자에 의해 처음 설명되었으며 Liu & Kang에서 시각화 할 수 있습니다s = "xref"> 10 ^{, 11} ( 그림 1A ).

1. 유도 챔버에서 4-5 % isoflurane으로 이식 마우스를 마취. 자궁 경관 탈구로 희생하십시오.
2. 정형 가위로 정중선을 절개하고 대동맥을 국소화하기 위해 복부 내용물을 제거하십시오.
   참고 : 이식 된 심장은 복부 대동맥의 오른쪽에 있습니다 ( 그림 1B ).
3. 미세한 날카로운 이빨 집게로 이식편을 부드럽게 당겨 즉시 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오.
   참고 : 수술 가위를 사용하여 대동맥에서 이식편을 분리하면 이식재가 손상되고 일부 조직이 수혜자에게 달라 붙을 수 있습니다.
4. 모든 이식편을 수거 한 후 조직 처리를 위해 멸균 된 문화 후드로 옮깁니다. 페트리 접시에 이식을 배치하고 무균, 무딘, microsurgery 가위를 사용하여 작은 조각 (1mm)로 조직을 주사위.
5. 날카로운 이빨을 가진 forc로eps, collagenase A (멸균 1x PBS에 0.1 MG / ML collagenase) 5 ML와 50 ML 튜브에 조각을 전송. 37 ° C 조에서 1 시간 동안 배양한다.
6. 콜라게나 제를 중화하기 위해 RPMI 배지 5 mL를 넣고 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 100 μm 스트레이너로 시료를 옮긴다.
7. 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 샘플을 회전 시키십시오.
8. 펠릿을 ACK 용해 버퍼 1 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라.
9. 용해 완충액을 중화하기 위해 RPMI 배지 1 ML을 추가하고 4시 5 분 400 XG에서 샘플을 회전 ° C.
10. RPMI 배지 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다.
    참고 : 폴리 프로필렌 튜브는 접착력이 적습니다. 또한 4 ° C와 같은 저온에서 세포를 유지하면 접착력이 감소합니다.

3. 형광 활성화 된 세포를 이용한 이식편 - 침윤성 대 식세포의 분리보내는

1. Fc 수용체 차단 단클론 항체 (rat ant-mouse CD16 / 32)를 사용하여 골수 세포에서 원하지 않는 특이 적 결합을 차단합니다. 표면 얼룩 15 분 전에 샘플 당 1-2 μL를 추가합니다.
2. anti-mouse CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-mouse Ly6C APC (2 μg / μL), anti-mouse CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI 배지에서 0.6 μg / μL 최종 농도) 항 마우스 Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μL). 형광등 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ℃에서 냉장고에 튜브를 잠복니다.
   참고 : 단일 얼룩 보정의 경우 네거티브 컨트롤 튜브 (얼룩이 없음)와 각 형광 색소가있는 라벨이 붙은 튜브가있는 튜브를 준비하십시오. 문을 세우는 것을 돕기 위해 isotype 컨트롤은 특히 Ly6C (IgG2a)와 Ly6G (IgG2b)에 사용될 수 있습니다.
3. RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. 트리 판 블루 (trypan blue) 및 혈구 세포 (hemocytomete)를 사용하여 세포를 센다.1x10 ⁶ 세포 당 RPMI 배지 1 ML에서 희석. 분류하기 전에 샘플을 5 mL, 70 μm 셀 여과기 튜브 캡으로 옮깁니다. 세포 생존률 마커로 DAPI (1 μg / ML)를 추가하고 정렬로 진행합니다.
4. 대 식세포는 민감하고 깨지기 쉬운 세포이기 때문에 정렬 조건을 20 psi로 설정하고 100 μm 노즐 크기를 사용하여 4 방향 순도 모드를 사용하여 대 식세포를 분리합니다.
5. 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에서 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비합니다.
6. 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다.
7. 전방 및 측면 산란이 가장 적은 부스러기와 덩어리를 제외한 모든 백혈구의 전방 (FSC) 대 측면 (side) 산란 (SSC) 및 게이트를 표시하는 도트 플롯을 설정합니다. 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다.
   1. 새롭게 문을 열 인구에 광고 작성CD11b 대 CD45 및 이중 양성 (CD11b ⁺ CD45 ⁺ ) 대 식세포 및 호중구의 게이트를 나타내는 플롯.
   2. 여기에서 Ly6C 대 Ly6G를 표시하는 최종 도트 플롯을 만들고 Ly6C ^hi Ly6G ^- , Ly6C ^lo Ly6G ^- , Ly6C ^int Ly6G ⁺ 와 같은 바람직한 개체군을 게이트하십시오 ( 그림 2 ).
8. 분류 후, 순도와 세포 생존률 (> 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan 블루와 hemocytometer를 사용하여 세포를 세고 완전한 RPMI 매체에서 원하는 농도 ( 예 : 1 × 10 ⁶ macrophages / ML)에 그들을 resuspend.
9. 완전한 RPMI 배지 100 μL의 최종 부피가있는 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 플레이트 50 x 10 ^{3 개의 대} 식세포. 37 ° C와 5 % CO ₂ 에서 적어도 24 시간 동안 세포를 방해하지 마십시오.

4. Isolatio형광 활성화 된 셀 정렬을 이용한 T 세포의 수

참고 : C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn은 Foxp3 (포크 헤드 박스 P3) 유전자를 표현하는 세포를 단량체 적색 형광 단백질 (mRFP)과 공동 표지하는 X- 연결된 표적 노크 - 인 마우스입니다.

1. 전에 2.1 단계에서 설명한대로 C57BL / 6 및 C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H - 2b) 마우스를 마취하고 희생. 비장과 림프절 (LN : 사타구니, 요추, 축삭, 상완, 자궁 경부)을 분리하고 신속하게 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오.
2. LN을 분리하기 위해 마우스를 앙와위에 놓고 정중선 피부를 아래에서 위로 절개하고주의 깊게 복막을 잘라 부드럽게 피부를 벌리십시오. 모든 사타구니, 요추, 겨드랑, 상완, 그리고 자궁 경부 LN ( 그림 1C , 붉은 색)가 수집되면, 복막을 자르고 창자의 왼쪽 상단에서 비장을 분리.
3. 배치 된 100 μm 필터를 사용하여 비장 및 LN 분리50 mL 튜브 위에 올려 놓습니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 조심스럽게 누릅니다. 필요할 때까지 RPMI 배지로 필터를 깨끗이 헹굽니다.
   참고 : 각 마우스의 LN과 비장은 동일한 튜브에 모아 둘 수 있습니다.
4. 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운.
5. 펠릿을 ACK 용해 버퍼 2 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라.
6. 용해 버퍼를 중화하기 위해 2 ML RPMI 매체를 추가합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운.
7. RPMI 매체 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다.
8. 항 마우스 CD4 APC (0.6 μg / μL) 및 / 또는 항 마우스 CD8 PeCy7 (2 μg / μL)에 대한 염색. 빛으로부터 형광 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ° C에서 냉장고에 튜브를 품어 라.
   참고 : 단일 얼룩 보정의 경우, 음성 대조 튜브 (얼룩 없음)를 준비하고튜브는 형광 염료의 각각으로 단독으로 라벨이 붙어있다.
9. RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다.
   참고 : CFSE 염료는 일반적으로 50 μg에서 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester powder로 제공됩니다. CFSE의 유리 병에 18 μL DMSO를 넣어 최종 보관 용액 5 mM에 저장하고 -20 ° C에 보관하십시오.
10. CFSE 라벨을 위해, 주식 솔루션에서 5 μm의 CFSE의 최종 작업 농도에서 PBS에 ML 당 10 ⁶ 세포의 농도로 resuspend CD8 염색 세포. 앞서 설명한대로 20 ° C에서 5 분간 배양하십시오.
    주의 사항 : (CRITICAL STEP) 저농도 (㎖ 당 ≤10 ⁶ ) 인 세포의 경우 CFSE의 독성 효과를 완충시키기 위해 단백질이 첨가 된 상태에서 세포를 표지해야한다. 따라서, PBS는 5 % FBS를 함유 할 수있다. 나에게dium이 사용되면 유리 아미노산은 CFSE와 경쟁하여 표지 효율을 낮출 수 있습니다.
11. 2 mL의 RPMI 배지로 CFSE를 중성화하십시오. 4 ° C에서 5 분간 400 xg에서 스핀. 1 x 106 CD8 T 세포 당 1 mL의 RPMI 배지를 첨가한다.
12. 분류하기 전에 샘플을 5 μm 튜브 캡에서 70 μm 셀 여과기로 옮깁니다. 세포 생존 마커로 1xDAPI (1 μg / ML) 50 μL를 추가하고 정렬로 진행합니다.
    참고 : 1x는 다른 구성 요소에 대한 시약의 1 : 1 비율을 의미합니다.
13. 정렬 조건을 20 psi 및 100 μm 노즐 크기로 설정하여 이중 양성 CD8 ⁺ CFSE ⁺ T 세포를 분리합니다 ( 그림 3A ).
14. 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비하고 정렬로 진행합니다.
15. 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다.
16. CD4 ⁺ T 세포 분리의 경우,수지상 세포와 같은 큰 과립 세포뿐만 아니라 잔해물을 제외한 FSC 대 SSC 및 림프구 게이트를 재생합니다.
    1. 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다.
    2. 새롭게 문이 열어 진 인구에서 모든 CD4 ⁺ 세포를 분리하기 위해 SSC 대 CD4를 나타내는 도트 플롯을 만듭니다 ( 그림 3B ). 대안으로, 항 -CD3 단클론 항체를 사용하여 순수한 T 세포 집단의 분리를 보장 할 수있다.
       참고 : 모든 CD4 ⁺ T 세포의 작은 부분 (5-10 %)은 Foxp3 ⁺ mRFP ⁺ 이어야합니다.
17. 분류 후, 순도와 세포 생존률 (> 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 2x10 ⁶ T 세포 당 1 ML의 완전한 RPMI 매체를 사용하여 Resuspend.
18. 이전에 정렬 된 macrophages와 T 세포를 배양하여 억제 분석을 설정합니다. 플레이트 10 x 10 ⁴ CD4 ⁺ T 및 10 × 10 ⁴ CD8 ⁺ CFSE ⁺ T 세포를 100 μl의 최종 RPMI 배지에 넣었다. 96 시간 동안 37 ° C 및 5 % CO ₂ 에서 배양하십시오.
    참고 : 대 식세포와 T 세포는 1 : 4 비율로 사용되었습니다.
19. 아 지드 함유 완충액을 제거하기 전에 T 세포 활성제 CD3 / CD28 자석 구슬을 PBS 2mL로 세척하여 T 세포 분열을 자극합니다. 우물 당 마우스 T 세포 - 활성화 CD3 / CD28 비즈 5 μL를 추가합니다.
    참고 : Magnetics beads는 항원 제시 세포와 크기면에서 유사하며 T 세포의 활성화와 확장을위한 간단한 방법을 제공하는 항 -CD3 및 항 -CD28 mAb에 결합됩니다.

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결과

대표적인 결과는 위의 프로토콜에 설명 된 게이팅 전략을 보여줍니다. 결과는 또한 이식편 - 침투 대 식세포와의 공 - 배양 후 T- 세포 증식 활성의 분석을 나타낸다. 그림 4 에서 대 식세포 하위 집합의 체외 억제 능력을 분석했습니다. 결과는 용인 된 수용자로부터 얻은 Ly6C ^lo Ly6G ^- 대 식세포가 억압 적이라는 것을 나타낸다. 결과는 또?...

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토론

이 프로토콜은 심장 이식의 실험 쥐 모델에서 이식편 - 침윤 골수 세포 서브 세트를 면역화하는 데 사용한 방법을 기술하며, 이는 다른 쥐 실험 모델의 다른 조직에도 적용 가능합니다. 20 psi에서의 저압 셀 분류는 순수한 셀 하위 집합의 좋은 수율을 격리하는 데 선호되는 방법이었습니다. 각 골수 하위 집합의 순도를 유지하는 것은 다른 골수 집단 사이의 억제 능력의 결정적인 결과를 확립하는 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Esential amino acids	Corning	25025039
1 M HEPES buffer	Corning	25060CL
100 mM Sodium Pyruvate	ThermoScientific	SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagenese A	Roche	70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)	Corning	21031CV
70 µm Cell strainer	Fisher	22363548
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-bottom plate	Corning	353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Flow Cytometer	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	The Jackson Laboratory	008374
C57BL/6	The Jackson Laboratory	000664
Balb/c	The Jackson Laboratory	000651