אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

Summary

מקרופאגים הם תאי פלסטיק של מערכת hematopoietic כי יש תפקיד מכריע בחסינות מגן הומיאוסטזיס. בדו"ח זה, אנו מתארים אופטימיזציה של טכניקות חוץ גופית כדי phenotypically ופונקציונלית לאפיין להשתלשלים מסתננים מקרופאגים תקינה המצטברים באיבר המושתל בתנאים סובלני.

Abstract

הצטברות מקרופאג באיברים המושתלים הוכרה מזה זמן רב כתכונה של דחיית אלוגראפט. מונוציטים אימונוגניים לחדור את האלוגראפט מוקדם לאחר ההשתלה, לעלות תגובה תגובתית שתל נגד האיברים המושתלים, וליזום דחייה איברים ² . נתונים אחרונים מראים כי מקרופאגים מדכאים להקל על השתלות לטווח ארוך מוצלח ³ נדרשים לגירוי של השתלות השתלות ⁴ . דבר זה מצביע על תפיסה רב-ממדית של אוקטוגני מקרופאג, הפעלה ותפקוד, הדורשת מפת דרכים חדשה לבידוד וניתוח של מקרופאג ' ⁵ . בשל הפלסטיות של מקרופאגים, יש צורך במתודולוגיה לבודד ולאפיין מקרופאגים, בהתאם לסביבה רקמות, ולהגדיר את הפונקציות שלהם על פי תרחישים שונים. הנה, אנחנו descriלהיות פרוטוקול אפיון החיסון של מקרופאגים השתל השתוללות ושיטות נהגנו להעריך פונקציונלית יכולתם לעכב התפשטות CD8 ⁺ T ו לקדם CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ הרחבת Treg במבחנה .

Introduction

פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית ללמוד את הפונקציה של מקרופאגים מסתננים רקמות מבודד allografts לב, על פי יכולתם לווסת תגובות תא T. תיאורים נרחבים בספרות, צבעים ניטור פלורסנט תא בשילוב עם cytometry זרימה, הם כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הפונקציה המדכאת של סוגי תאים ספציפיים במבחנה in vivo. פרוטוקול שלנו עוקב אחר השיטה carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לניטור התפשטות לימפוציטים במבחנה .

כאשר תא CFSE שכותרתו מחלק, צאצאיה רוכש חצי מספר של carboxyfluorescein מתויגות מולקולות ⁶ . הירידה המקבילה פלואורסצנטי התא על ידי cytometry הזרימה ניתן להשתמש כדי להעריך את חלוקת התא, ניטור היכולת של מקרופאגים מדכאים כדי לווסת את התגובה החיסונית של תאי T. מאז CFSE הוא צבע פלואורסצנטי מבוסס, הוא תואם עם brOad טווח של fluorochromes אחרים, מה שהופך אותו ישים cytometry זרימה רב צבע. הבחירה הנכונה של fluorochromes פנוטיפינג חשוב גם כדי למנוע חפיפה ספקטרלית מוגזמת וחוסר היכולת לזהות תאים חיוביים נוגדנים, במיוחד עם צבעים חלבונים גלויים כגון CFSE ⁷ .

ישנם יתרונות רבים של שימוש בצבעי פלואורסצנט על טכניקות חלופיות למדידת התפשטות תאים, כגון assay שילוב thymidine, אשר משתמשת thymidine radiolabeled (TdR) ⁸ . Assay זה מנצל thymidine tritiated ( ³ H-TdR), כי הוא משולב לתוך גדילים חדשים של DNA כרומוזומלי במהלך חלוקת התא מיטוטי. דאגה בטיחותית הקשורה assay זה הוא השימוש רדיואיזוטופים, שכן ניטור ביתא scintillation משמש למדידת רדיואקטיביות ב- DNA התאושש מן התאים על מנת לקבוע את מידת חלוקת התא. מתודולוגית, התחת thymidine tritiatedאי הוא לא מספיק גמיש כדי להתאים את האילוצים המעבדה קליניים חשובים כגון מספר נמוך של תאים וניתוח מושהה לאחר מכתים. להיפך, מכתים CFSE הוכח כדי למנוע התפשטות תאים ולהפריע סמנים הפעלה קריטית, כגון CD69, HLA-DR ו CD25 ⁹ . לכן, הבנת היתרונות והמגבלות של כל מתודולוגיה, במיוחד במחקרים רב צבעוניים שבהם צבעים מרובים משמשים כדי לעקוב אחר סוגי תאים שונים, הוא קריטי להשגת תוצאות מדויקות לשחזור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

במחקר זה, עכברים שוכנים על פי הנחיות משרד החקלאות של ארצות הברית ואת ההמלצות של שירות בריאות הציבור מדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. כל הטכניקות הניסוייות שעסקו בשימוש בבעלי חיים בוצעו בהתאם ל"מוסדות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ולשימוש "(IACUC) - פרוטוקולים מאושרים של בית הספר לרפואה של הר סיני.

1. הכנת מדיה

1. הכן להשלים RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (10,000 U / mL) באמצעות 2 מ"מ L- גלוטמין, 1 mM נתרן pyruvate, 0.1 מ"מ חומצות אמינו חיוניות, 5 מ"מ HEPES, ו 0.05 מ"מ -Mercaptoethanol.

2. בידוד allograft ו השעיה תא בודד

הערה: טכניקת ההשתלה והאינפסטומוזיס של העורק הריאתי ווריד הקאווה הנחות תוארה לראשונה על ידי קורי ומשתפי הפעולה וניתן לדמיין אותה ב- Liu & KangS = "xref"> 10 ^{, 11} ( איור 1 א ).

1. להרדים עכבר מושתלים עם isoflurane 4-5% בחדר אינדוקציה. להקריב אותו על ידי נקע צוואר הרחם.
2. הפוך חתך הבטן קו האמצע עם מספריים סטנדרטיים ולהסיר את תוכן הבטן כדי למקם את אבי העורקים.
   הערה: הלב המושתל יהיה בצד ימין של אבי העורקים הבטן המקבל ( איור 1 ב ).
3. משוך את השתל בעדינות באמצעות מלקחיים חדה מלקחיים ומקם אותו מיד לתוך בינוני RPMI קר.
   הערה: באמצעות מספריים הניתוח להפריד את השתל מן אבי העורקים יכול להזיק השתל ולגרום רקמה להישאר להישאר דבקה לנמען.
4. לאחר כל השתלות נאספו, להעביר אותם לתוך מכסה המנוע תרבות סטרילי לעיבוד רקמות. מניחים את השתל בצלחת פטרי לקוביות הרקמה לחתיכות קטנות (1 מ"מ) באמצעות מספריים סטריליים, בוטה, microsurgery.
5. עם שיניים חדותEps, להעביר את החלקים לצינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל של קולגן A (0.1 מ"ג / מ"ל ​​collagenase ב 1x סטרילי PBS). דגירה זה 1 שעה אמבטיה 37 מעלות צלזיוס.
6. הוסף 5 מ"ל של המדיום RPMI לנטרל את collagenase ולהעביר את המדגם באמצעות מסננת 100 מיקרומטר בעזרת הבוכנה של מזרק 1 מ"ל.
7. ספין המדגם למטה ב XG 400 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
8. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ תמוגה ACK. מערבבים היטב דגירה 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
9. הוסף 1 מ"ל של מדיום RPMI לנטרל את המאגר תמוגה לסובב את המדגם למטה ב XG 400 עבור 5 מ 'ב 4 מעלות צלזיוס.
10. Resuspend תא גלולה μL 200 של המדיום RPMI ולהעביר אותו צינור 5 התחתית התחתונה פוליפרופילן מ"ל.
    הערה: צינורות פוליפרופילן תמיכה פחות דבקות. כמו כן, שמירה על התאים בטמפרטורה נמוכה, כגון 4 ° C, מפחית הידבקות.

3. בידוד של מאקרופאגים השתל השתלנות באמצעות תא המופעל פלואורסצנטי מייןING

1. לחסום מחייב ספציפי לא רצוי על תאים מיאלואידים באמצעות קולטן FC חסימת mAb (עכברוש נגד עכבר CD16 / 32). הוסף 1-2 μL לכל מדגם, 15 דקות לפני מכתים פני השטח.
2. (0.6 מיקרוגרם / μL), אנטי עכבר Ly6C APC (2 מיקרוגרם / μL), כתם אנטי-עכבר CD11b, ו אנטי עכבר Ly6G Pe / Cy7 (2 מיקרוגרם / μL). מכסים את צינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על נוגדנים ניאון מן האור דגירה של צינורות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
   הערה: עבור פיצויים כתם יחיד, להכין צינור בקרה שלילי (ללא כתם) וצינורות עם תאים שכותרתו בנפרד עם כל אחד fluorochromes. כדי לעזור להגדיר את השער, בקרות isotype ניתן להשתמש במיוחד עבור Ly6C (IgG2a) ו Ly6G (IgG2b).
3. לשטוף את התאים פעמיים עם בינוני RPMI וסובב אותם ב XG 400 דקות 5 ב 4 ° C. ספירת התאים באמצעות כחול trypan ו hemocytometeR לדלל אותם 1 מ"ל של מדיום RPMI לכל 1 x 10 ⁶ תאים. לפני מיון, להעביר את דגימות באמצעות 5 מ"ל, 70 מיקרומטר תא מסננת צינור מסווה. הוסף DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) כסמן כדאיות התא ולהמשיך למיין.
4. כי מקרופאגים הם תאים רגישים ושבירים, להגדיר את התנאים למיין ל 20 psi ולהשתמש גודל מיקרומטר 100 מיקרומטר לבודד מקרופאגים באמצעות מצב טוהר 4-way.
5. הכן צינורות איסוף עם 1 מ"ל של מדיום RPMI בצינור 5 פוליפרופילן מ"ל.
6. שימוש בתוכנת סדרן לפתוח ניסוי חדש ובחר ניסוי ריק עם פאנל ריק כדי להגדיר את ההגדרות.
7. הגדרת מגרש נקודה המציג את קדימה (FSC) לעומת ( לעומת ) פיזור בצד (SSC) ואת השער על כל leukocytes, למעט פסולת וגושים עם הפיזור הנמוך ביותר קדימה בצד. משער הורה זה, ליצור מגרש נקודה חדשה המציגה SSC לעומת DAPI ושער על תאים DAPI.
   1. על אוכלוסייה חדשה זו שנשלחה, צור מודעהOt העלילה המציגה CD11b לעומת CD45 ושער על כפול חיובי (CD11b ⁺ CD45 ⁺ ) מקרופאגים ונויטרופילים.
   2. מכאן, ליצור העלילה נקודה אחרונה הצגת Ly6C לעומת Ly6G ושער אוכלוסיות רצוי: Ly6C ^היי Ly6G ^- , Ly6C ^lo Ly6G ^- , ו Ly6C ^int Ly6G ⁺ ( איור 2 ).
8. לאחר מיון, לבדוק טוהר תאי הכדאיות (> 90%) וסובב את צינורות איסוף ב XG 400 במשך 5 דקות ב 4 ° C. לספור את התאים באמצעות כחול trypan ו hemocytometer ו resuspend אותם בריכוז הרצוי ( למשל, 1 x 10 ⁶ מקרופאגים / מ"ל) במדיום RPMI מלא.
9. צלחת 50 x 10 ³ מקרופאגים לכל היטב צלחת 96-היטב בתחתית עם נפח סופי של 100 μL של המדיום RPMI מלא. השאירו את התאים ללא הפרעות במשך לפחות 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO ₂ .

4. IsolatioN של תאים T באמצעות פלואורסצנטי מופעל תא מיון

הערה: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn הוא X- ממוקד מקושט זן עכבר אשר שיתוף סימני תאים להביע את Foxbox (P3 תיבת P3) גן עם חלבון פלואורסצנטי אדום מונומריק (mRFP).

1. להרדים ולהקריב C57BL / 6 ו C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) עכברים כפי שתואר לעיל בשלב 2.1. לבודד את הטחול ואת בלוטות הלימפה (LN: מפשעתי, מותני, axillar, brachial, צוואר הרחם) ומיקומם במהירות בינוני RPMI קר.
2. כדי לבודד את LN, במקום את העכבר במצב שכיבה, לעשות חתך העור קו האמצע מלמטה למעלה, בזהירות חיתוך הצפק בעדינות להפיץ את העור בנפרד. לאחר איסוף כל lumar, lumbar, axillary, brachial, צוואר הרחם LN ( איור 1C , בצבע אדום), לחתוך את הצפק לבודד את הטחול בצד השמאלי העליון של המעיים.
3. לפצל את הטחול LN באמצעות מסנן 100 מיקרומטר להציבעל גבי צינור 50 מ"ל. באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל, לחץ בעדינות על הרקמה. יש לשטוף את המסנן עם המדיום RPMI פעמים רבות ככל הנדרש עד שהוא נקי.
   הערה: LN וטחול מכל עכבר ניתן להרכיב יחד באותה צינור.
4. ספין למטה ב XG 400 דקות 5 ב 4 ° C.
5. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה ACK. מערבבים היטב דגירה 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. הוסף 2 מ"ל של מדיום RPMI לנטרל את המאגר תמוגה. ספין למטה ב XG 400 דקות 5 ב 4 ° C.
7. Resuspend תא גלולה μL 200 של המדיום RPMI ולהעביר אותו צינור 5 תחתית פוליסטירן מ"ל התחתונה.
8. כתם עבור עכבר CD4 APC (0.6 מיקרוגרם / μL) ו / או נגד העכבר CD8 PeCy7 (2 מיקרוגרם / μL). מכסים את צינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על נוגדנים ניאון מן האור, דגירה של צינורות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
   הערה: עבור פיצויים כתם יחיד, להכין צינור בקרה שלילית (ללא כתם) וצינורות עם תאים שכותרתו יחיד עם כל אחד fluorochromes.
9. לשטוף את התאים פעמיים עם בינוני RPMI וסובב אותם ב XG 400 דקות 5 ב 4 ° C. ספירת התאים באמצעות כחול trypan ו hemocytometer.
   הערה: צבע CFSE מסופק כמו אבקת carboxyfluorescein אבקת succinimidyl אסתר בדרך כלל ב 50 מיקרוגרם. הוסף 18 DMSO μL לבקבוקון של CFSE לפתרון מלאי הסופי של 5 מ"מ חנות ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
10. עבור תיוג CFSE, resuspend תאים CD8 מוכתם בריכוז של עד ^{6 6} תאים לכל מ"ל PBS ב ריכוז עובד הסופי של CFSE 5 מיקרומטר מהפתרון המניות. דגירה אותם באמבטיה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כפי שתואר לעיל ⁶ .
    הערה: (שלב קריטי) עבור תאים בריכוז נמוך (≤ 10 ⁶ לכל מ"ל), חיוני כי התאים להיות מתויגים בנוכחות של חלבון נוסף למאגר את ההשפעות הרעילות של CFSE. לכן, PBS יכול להכיל 5% FBS. שים לב שאם אנידיום משמש, חומצות אמינו חופשיות עשויות להוריד את יעילות תיוג על ידי מתחרים על CFSE.
11. לנטרל את CFSE עם 2 מ"ל של מדיום RPMI. ספין ב XG 400 דקות 5 ב 4 ° C. הוסף 1 מ"ל של מדיום RPMI לכל 1 x 10 ⁶ תאים CD8 T.
12. לפני מיון, להעביר את המדגם באמצעות מסננת תא 70 מיקרומטר על מכסה צינור 5 מ"ל. הוסף 50 μL של DAPI 1x (1 מיקרוגרם / מ"ל) כסמן הכדאיות התא ולהמשיך למיין.
    הערה: 1x פירושו יחס של 1: 1 של המגיב ביחס למרכיב אחר.
13. קבע את התנאים למיין ב 20 psi ו 100 מיקרומטר גודל נחיר לבודד פעמיים חיוב CD8 ⁺ CFSE ⁺ T תאים ( איור 3 א ).
14. הכן צינורות איסוף עם 1 מ"ל של מדיום RPMI בצינור 5 פוליפרופילן מ"ל ולהמשיך למיין.
15. שימוש בתוכנת סדרן לפתוח ניסוי חדש ובחר ניסוי ריק עם פאנל ריק כדי להגדיר את ההגדרות.
16. עבור בידוד CD4 ⁺ T תא, להגדיר מגרש נקודה כי disמשחק את FSC לעומת SSC ושער על לימפוציטים, למעט פסולת כמו גם תאים גרעיניים גדולים, כגון תאים דנדריטים.
    1. משער הורה זה, ליצור מגרש נקודה חדשה המציגה SSC לעומת DAPI ושער על תאים DAPI.
    2. על אוכלוסייה זו החדש מגודרת, ליצור העלילה נקודה המציג SSC לעומת CD4 לבודד את כל התאים CD4 ⁺ ( איור 3 ב ). לחלופין, anti-CD3 mAb ניתן להשתמש כדי להבטיח בידוד של אוכלוסיות תאים טהור T.
       הערה: חלק קטן של כל תאי CD4 ⁺ T (5-10%) צריך להיות Foxp3 ⁺ mRFP ⁺ .
17. לאחר מיון, לבדוק טוהר תאי הכדאיות (> 90%) וסובב את צינורות איסוף ב XG 400 במשך 5 דקות ב 4 ° C. ספירת התאים באמצעות כחול trypan ו hemocytometer. Resuspend באמצעות 1 מ"ל של המדיום RPMI מלא לכל 2x10 ⁶ תאים T.
18. הגדרת assay דיכוי על ידי תאים culturing T עם מקרופאגים בעבר מיון. לוחית 10 x 10 ⁴ CD4 ⁺ T ו 10 x 10 ⁴ CD8 ⁺ CFSE ⁺ T תאים באותו היטב נפח סופי של 100 μL של המדיום RPMI מלא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 עבור 96 שעות.
    הערה: מקרופאגים ותאי T שימשו יחס של 1: 4.
19. לעורר T חלוקת התא על ידי שטיפת T תא activator CD3 / CD28 חרוזים מגנטיים ב 2 מ"ל של PBS לפני השימוש בהם כדי לנקות את המאגר המכיל אזיד. הוסף 5 μL של עכבר תא תא activator CD3 / CD28 חרוזים לכל טוב.
    הערה: חרוזים מגנטיים דומים בגודל לתאים מציגים אנטיגן והם מצמידים אנטי CD3 ו anti-CD28 mAb, המציע שיטה פשוטה להפעלה והרחבה של תאי T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התוצאות המייצגות מראות את אסטרטגיית ה gating המתוארת בפרוטוקול לעיל. תוצאות גם להציג את ניתוח של פעילות תאים T- התפשטות לאחר שיתוף תרבות עם השתל חדירה מקרופאגים. קיבולת הדיכוי במבחנה של תת מקרופאגים נותח באיור 4 . התוצאות מראות כי Ly6C lo6G Lee

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השיטות נהגנו immunocharacterize השתל-חדירה תת תא מיאלואידי במודל Murine ניסיוני של השתלת לב, אשר חל גם על רקמות אחרות מודלים שונים ניסיוני Murine. תאים בלחץ נמוך מיון ב 20 psi היתה השיטה המועדפת לבודד תשואה טובה של תת תאים טהורים. שמירה על טוהר של כל תת משנה מיאלואיד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Esential amino acids	Corning	25025039
1 M HEPES buffer	Corning	25060CL
100 mM Sodium Pyruvate	ThermoScientific	SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagenese A	Roche	70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)	Corning	21031CV
70 µm Cell strainer	Fisher	22363548
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-bottom plate	Corning	353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Flow Cytometer	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	The Jackson Laboratory	008374
C57BL/6	The Jackson Laboratory	000664
Balb/c	The Jackson Laboratory	000651