Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Resumo

Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.

Resumo

A acumulação de macrófagos em órgãos transplantados tem sido reconhecida como uma característica da rejeição de aloenxerto ¹ . Os monócitos imunogênicos infiltram o aloenxerto logo após o transplante, montam uma resposta reativa do enxerto contra o órgão transplantado e iniciam a rejeição dos órgãos ² . Dados recentes sugerem que os macrófagos supressivos facilitam o transplante de longo prazo com êxito ³ e são necessários para a indução de tolerância ao transplante ⁴ . Isso sugere um conceito multidimensional de ontogenia, ativação e função de macrófagos, que exige um novo roteiro para isolamento e análise da função de macrófagos ⁵ . Devido à plasticidade dos macrófagos, é necessário fornecer uma metodologia para isolar e caracterizar macrófagos, dependendo do ambiente de tecido, e definir suas funções de acordo com diferentes cenários. Aqui, nós descrevemosSeja um protocolo para a caracterização imune de macrófagos infiltrados por enxerto e os métodos que usamos para avaliar funcionalmente sua capacidade de inibir a proliferação de CD8 ⁺ T e promover a expansão de Treg de CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ in vitro .

Introdução

Este protocolo descreve técnicas in vitro para estudar a função de macrófagos infiltrantes de tecidos isolados de aloenxertos cardíacos, de acordo com sua capacidade de modular as respostas de células T. Amplamente descritos na literatura, corantes de rastreamento de células fluorescentes em combinação com citometria de fluxo, são ferramentas poderosas para estudar a função supressiva de tipos celulares específicos in vitro e in vivo. Nosso protocolo segue o método do éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos in vitro .

Quando uma célula marcada com CFSE se divide, sua progênie adquire metade do número de moléculas marcadas com carboxifluoresceína ⁶ . A diminuição correspondente na fluorescência celular por citometria de fluxo pode ser usada para avaliar a divisão celular, monitorando a capacidade de macrófagos supressivos para modular as respostas imunes das células T. Como o CFSE é um corante à base de fluoresceína, é compatível com um brGama de outros fluorocromos, tornando-o aplicável à citometria de fluxo multicolorida. A escolha apropriada de fluorocromos para fenotípulos também é importante para evitar a sobreposição espectral excessiva e a incapacidade de reconhecer células positivas a anticorpos, particularmente com corantes proteicos visíveis, como o CFSE ⁷ .

Existem muitas vantagens de usar corantes fluorescentes em técnicas alternativas que medem a proliferação celular, como o ensaio de incorporação de timidina, que usa a timidina radiomarcada (TdR) ⁸ . Este ensaio utiliza timidina tritiada (3H-TdR) que é incorporada em novas cadeias de DNA cromossómico durante a divisão de células mitóticas. Uma preocupação de segurança associada a este ensaio é o uso de radioisótopos, uma vez que um contador beta de cintilação é usado para medir a radioatividade no DNA recuperado das células para determinar a extensão da divisão celular. Metodologicamente, o burro de timidina tritiadoAy não é flexível o suficiente para se adequar às importantes restrições de laboratório clínico, como o baixo número de células e a análise tardia após a coloração. Pelo contrário, a coloração com CFSE demonstrou prevenir a proliferação celular e interferir com marcadores críticos de ativação, como CD69, HLA-DR e CD25 ⁹ . Portanto, a compreensão de vantagens e limitações de cada metodologia, particularmente em estudos multicoloridos, onde corantes múltiplos são usados ​​para rastrear diferentes tipos de células, é fundamental para obter resultados precisos e reprodutíveis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Neste estudo, os camundongos são alojados de acordo com as diretrizes do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e as recomendações do Guia do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todas as técnicas experimentais envolvendo uso animal foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Utilização e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) da Faculdade de Medicina Mount Sinai.

1. Preparação de mídia

1. Prepare o meio RPMI 1640 completo com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (10 000 U / mL) usando L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, HEPES 5 mM e 0,05 mM 2 -mercaptoetanol.

2. Isolamento de aloenxerto e suspensão de célula única

NOTA: A técnica de transplante e anastomose da artéria pulmonar e da veia de cava inferior foi inicialmente descrita por Corry e colaboradores e pode ser visualizada em Liu & KangS = "xref"> 10 ^{, 11} ( Figura 1A ).

1. Anestesiar um rato transplantado com 4-5% de isoflurano numa câmara de indução. Sacrifique-o pela luxação cervical.
2. Faça uma incisão abdominal na linha média com tesoura padrão e remova o conteúdo abdominal para localizar a aorta.
   NOTA: O coração transplantado estará no lado direito da aorta abdominal do receptor ( Figura 1B ).
3. Retire o enxerto suavemente usando pinças finas de dentes afiados e coloque-o imediatamente em meio RPMI gelado.
   NOTA: O uso de uma tesoura cirúrgica para separar o enxerto da aorta pode danificar o enxerto e fazer com que algum tecido permaneça aderido ao destinatário.
4. Depois de todos os enxertos terem sido coletados, mova-os para uma capa de cultura estéril para o processamento de tecidos. Coloque o enxerto em uma placa de Petri e corte o tecido em pequenos pedaços (1 mm) usando tesoura de microcirurgia estéril e contundente.
5. Com dentes afiados forcEps, transfira as peças para um tubo de 50 mL com 5 mL de colagenase A (0,1 mg / mL de colagenase em 1x PBS estéril). Incubar durante 1 h em um banho de 37 ° C.
6. Adicione 5 mL de meio RPMI para neutralizar a colagenase e transferir a amostra através de um filtro de 100 μm com a ajuda do êmbolo de uma seringa de 1 ml.
7. Gire a amostra para baixo a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
8. Ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de lise de ACK. Misture bem e incube durante 5 min a 4 ° C.
9. Adicione 1 mL de meio RPMI para neutralizar o tampão de lise e gire a amostra para baixo a 400 xg durante 5 m a 4 ° C.
10. Ressuspender o sedimento celular em 200 μL de meio RPMI e transferi-lo para um tubo redondo de fundo de polipropileno de 5 mL.
    NOTA: Os tubos de polipropileno suportam menos aderência. Além disso, manter as células a baixa temperatura, como 4 ° C, reduz a adesão.

3. Isolamento de macrófagos infiltrantes de enxerto usando células ativadas por fluorescênciaIng

1. Bloqueie a ligação específica indesejada em células mieloides utilizando o mAb de bloqueio do receptor Fc (CD16 / 32 de rato anti-mouse). Adicione 1-2 μL por amostra, 15 min antes da coloração da superfície.
2. Mancha com o CD11b Percp / Cy5.5 anti-mouse (concentração final de 0,6 μg / μL no meio RPMI), APC / eFluor780 anti-mouse (0,6 μg / μL), APC Ly6C anti-mouse (2 μg / μL) E Ly6G Pe / Cy7 anti-mouse (2 μg / μL). Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os anticorpos fluorescentes da luz e incubar os tubos na geladeira a 4 ° C durante 45 min.
   NOTA: Para compensações de manchas únicas, prepare um tubo de controle negativo (sem mancha) e tubos com células rotuladas individualmente com cada um dos fluorocromos. Para ajudar a configurar o portão, os controles do isotipo podem ser usados ​​especialmente para Ly6C (IgG2a) e Ly6G (IgG2b).
3. Lave as células duas vezes com meio RPMI e gire-as a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Conte as células usando azul de tripano e um hemocitomeR e diluí-los em 1 mL de meio RPMI por 1 x 10 ⁶ células. Antes de ordenar, transfira as amostras através de uma tampa de tubo de filtro de células de 5 mL, 70 μm. Adicionar DAPI (1 μg / mL) como marcador de viabilidade celular e proceder a ordenar.
4. Como os macrófagos são células sensíveis e frágeis, defina as condições de classificação para 20 psi e use um tamanho de bico de 100 μm para isolar macrófagos usando um modo de pureza de 4 vias.
5. Prepare tubos de coleta com 1 mL de meio RPMI em um tubo de polipropileno de 5 mL.
6. Usando o software classificador, abra uma nova experiência e selecione uma experiência em branco com um painel em branco para definir as configurações.
7. Configure um gráfico de pontos que exiba a dispersão de frente (FSC) versus (lado a lado) e o portão em todos os leucócitos, excluindo detritos e aglomerados com a menor dispersão para frente e para o lado. A partir deste gate principal, crie um novo gráfico de pontos que exiba SSC vs. DAPI e gate em células DAPI.
   1. Sobre esta população recém-gated, crie anúnciosOt plot que exibe CD11b vs. CD45 e portão em macrófagos e neutrófilos de dois positivos (CD11b ⁺ CD45 ⁺ ).
   2. A partir daqui, crie um traço de pontos final que exiba Ly6C vs. Ly6G e administre as populações desejáveis: Ly6C ^oi Ly6G ^- , Ly6C ^lo Ly6G ^- e Ly6C ^int Ly6G ⁺ ( Figura 2 ).
8. Após a triagem, verifique se há pureza e viabilidade celular (> 90%) e gire os tubos de recolha a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Contar as células usando azul de tripano e um hemocitômetro e ressuspendê-las na concentração desejada ( por exemplo, 1 x 10 ⁶ macrófagos / mL) em meio RPMI completo.
9. Placa 50 x 10 ³ macrófagos por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços com um volume final de 100 μL de meio RPMI completo. Deixe as células inalteradas durante pelo menos 24 h a 37 ° C e 5% de CO ₂ .

4. IsolatioN de células T usando a classificação celular celular ativada por fluorescência

NOTA: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn é uma linhagem de mouse knock-in segmentada em X que co-marca células que expressam o gene Foxp3 (forkhead box P3) com proteína fluorescente vermelha monomérica (mRFP).

1. Anestesiar e sacrificar ratinhos C57BL / 6 e C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) como descrito anteriormente no passo 2.1. Isolar o baço e os linfonodos (LN: inguinal, lombar, axilar, braquial e cervical) e colocá-los rapidamente em meio RPMI gelado.
2. Para isolar o LN, coloque o mouse em posição supina, faça uma incisão da pele da linha média de baixo para cima, cortando cuidadosamente o peritoneu e espalhando suavemente a pele. Uma vez que todos os LN inguinal, lombar, axilar, braquial e cervical são coletados ( Figura 1C , coloridos em vermelho), cortar o peritoneu e isolar o baço no lado superior esquerdo do intestino.
3. Desagregar o baço e LN usando um filtro de 100 μm colocadoEm cima de um tubo de 50 mL. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL, pressione suavemente o tecido. Enxaguar o filtro com o meio RPMI quantas vezes for necessário até ficar limpo.
   NOTA: LN e baço de cada mouse podem ser agrupados no mesmo tubo.
4. Gire para baixo a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
5. Ressuspender o sedimento em 2 mL de tampão de lise ACK. Misture bem e incube durante 5 min a 4 ° C.
6. Adicione 2 mL de meio RPMI para neutralizar o tampão de lise. Gire para baixo a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
7. Ressuspender o sedimento celular em 200 μL de meio RPMI e transferi-lo para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml.
8. Mancha para APC CD4 anti-mouse (0,6 μg / μL) e / ou CD8 PeCy7 anti-mouse (2 μg / μL). Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os anticorpos fluorescentes da luz e incubar os tubos na geladeira a 4 ° C durante 45 min.
   NOTA: Para compensações de mancha única, prepare um tubo de controle negativo (sem mancha) eTubos com células rotuladas individualmente com cada um dos fluorocromos.
9. Lave as células duas vezes com meio RPMI e gire-as a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Conte as células usando azul de tripano e um hemocitômetro.
   NOTA: O corante CFSE é fornecido como pó de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína normalmente a 50 μg. Adicione 18 μL de DMSO a um frasco de CFSE para uma solução de reserva final de 5 mM e armazene a -20 ° C durante vários meses.
10. Para a marcação CFSE, ressuspenda as células coradas CD8 a uma concentração de até 10 ⁶ células por mL em PBS a uma concentração final de trabalho de 5 μM CFSE da solução de reserva. Incubar em um banho a 20 ° C durante 5 min como descrito anteriormente ⁶ .
    NOTA: (PASSO CRÍTICO) Para células com baixa concentração (≤10 ⁶ por mL), é essencial que as células sejam rotuladas na presença de proteína adicionada para amortecer os efeitos tóxicos do CFSE. Portanto, PBS pode conter 5% de FBS. Note que, se euO dium é usado, os aminoácidos livres podem reduzir a eficiência de rotulagem ao competir pelo CFSE.
11. Neutralize o CFSE com 2 mL de meio RPMI. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Adicione 1 mL de meio RPMI por 1 x 10 ⁶ células T CD8.
12. Antes da triagem, transfira a amostra através de um filtro de células de 70 μm numa tampa de tubo de 5 mL. Adicionar 50 μL de 1x DAPI (1 μg / mL) como marcador de viabilidade celular e proceder à triagem.
    NOTA: 1x significa proporção 1: 1 do reagente em relação a outro constituinte.
13. Defina as condições de classificação a 20 psi e 100 μm do tamanho do bocal para isolar células T CD8 ⁺ CFSE ^{+ de} duplo positivo ( Figura 3A ).
14. Prepare tubos de coleta com 1 mL de meio RPMI em um tubo de polipropileno de 5 mL e proceda a ordenar.
15. Usando o software classificador, abra uma nova experiência e selecione uma experiência em branco com um painel em branco para definir as configurações.
16. Para o isolamento de células T CD4 ⁺ , configure um gráfico de pontos que sejaToca o FSC vs. SSC e o portão em linfócitos, excluindo detritos, bem como grandes células granulares, como células dendríticas.
    1. A partir deste gate principal, crie um novo gráfico de pontos que exiba SSC vs. DAPI e gate em células DAPI.
    2. Sobre esta população recém-gated, crie um gráfico de pontos que exiba SSC vs. CD4 para isolar todas as células CD4 ⁺ ( Figura 3B ). Alternativamente, um mAb anti-CD3 pode ser usado para garantir o isolamento de populações de células T puras.
       NOTA: Uma pequena fração de todas as células T CD4 ⁺ (5-10%) deve ser Foxp3 ⁺ mRFP ⁺ .
17. Após a triagem, verifique se há pureza e viabilidade celular (> 90%) e gire os tubos de recolha a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Conte as células usando azul de tripano e um hemocitômetro. Ressuspender usando 1 mL de meio RPMI completo por 2 células de células T ⁶ .
18. Configure o teste de supressão cultivando células T com macrófagos previamente classificados. Placa 10 x 10 ⁴ CD4 ⁺ T e 10 x 10 ⁴ CD8 ⁺ células CFSE ⁺ T no mesmo poço em um volume final de 100 μL de meio RPMI completo. Incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 96 h.
    NOTA: Macófagos e células T foram utilizados em uma proporção de 1: 4.
19. Estimule a divisão de células T por lavagem de esferas magnéticas CD3 / CD28 activadoras de células T em 2 mL de PBS antes de usá-las para limpar o tampão contendo azida. Adicione 5 μL de células CD3 / CD28 de células T de mouse por poço.
    NOTA: Os grânulos de magnetismo são de tamanho semelhante às células apresentadoras de antígeno e são acoplados a mAb anti-CD3 e anti-CD28, oferecendo um método simples para a ativação e expansão de células T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Os resultados representativos mostram a estratégia de bloqueio descrita no protocolo acima. Os resultados também exibem a análise da atividade de proliferação de células T após a co-cultura com macrófagos infiltrados por enxerto. A capacidade supressiva in vitro de subconjuntos de macrófagos foi analisada na Figura 4 . Os resultados indicam que o Ly6C ^lo Ly6G ^- macrófagos obtidos de receptores tolerados são supressivos. Os result...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Este protocolo descreve os métodos que usamos para imuno-caracterizar subconjuntos de células mieloides infiltradas por enxerto em um modelo experimental murino de transplante cardíaco, que também é aplicável a outros tecidos em diferentes modelos experimentais murinos. A classificação de células de baixa pressão a 20 psi foi o método preferido para isolar um bom rendimento de subconjuntos de células puras. Manter a pureza de cada subconjunto mielóide é fundamental para estabelecer resultados conclusivos d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Esential amino acids	Corning	25025039
1 M HEPES buffer	Corning	25060CL
100 mM Sodium Pyruvate	ThermoScientific	SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagenese A	Roche	70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium)	Corning	21031CV
70 µm Cell strainer	Fisher	22363548
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-bottom plate	Corning	353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Flow Cytometer	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	The Jackson Laboratory	008374
C57BL/6	The Jackson Laboratory	000664
Balb/c	The Jackson Laboratory	000651