JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Abstract

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introduction

القامع الجينات السرطانية، البروتين p53، هو المنظم الأساسي لعدد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج والشيخوخة 1. وهو مسؤول عن الحفاظ على الاستقرار الجيني، وبالتالي من الأهمية بمكان للحفاظ على التوازن من موت الخلايا ونمو الخلايا. الطفرات في البروتين p53 شائعة في حالات السرطان وهي السبب الرئيسي لتعطيل البروتين p53 مما يؤدي إلى الخلايا السرطانية غير المنضبط انتشار 2. ومن المثير للاهتمام، والطفرات في البروتين p53 فقط لحساب ما يقرب من 25٪ من سرطانات الثدي 3، مما يوحي بأن آليات أخرى مسؤولة عن فقدان وظيفة البروتين p53. وقد أظهرت الإسوية البروتين p53 اكتشفت مؤخرا أن overexpressed في عدد من السرطانات البشرية، ويمكن أن تعدل وظيفة البروتين p53 4،5. لقد أظهرنا سابقا أن الإسوي البروتين p53، Δ40p53، هو الإسوي أكثر أعرب غاية في سرطان الثدي، وupregulated بشكل كبير في خلايا سرطان الثدي، بالمقارنة مع TISS المجاور الطبيعيرق 6. وفي أعقاب ذلك، نحن transduced ستابلي خط خلايا سرطان الثدي البشرية MCF-7 إلى بإفراط Δ40p53 باستخدام ليغو-iG2-بورو + ناقلات (GFP +) 7. وقد استخدمت هذه الخلايا للتحقيق إذا عالية التعبير Δ40p53 يزيد معدلات تكاثر الخلايا في خلايا سرطان الثدي.

هناك العديد من الأساليب المباشرة وغير المباشرة لقياس انتشار الخلايا من الخلايا المستزرعة في المختبر 8،9. هذه لا يمكن أن يؤديها إما القياسات المستمرة مع مرور الوقت، أو المقايسات كما نقطة النهاية 10. الأساليب التقليدية لا تزال مفيدة، مثل عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. هذا الاختبار هو التكلفة المنخفضة ومقياسا مباشرا لعدد الخلايا، ولكنها لا تعتمد على عدد الخلايا الكبيرة وتدريب ذوي المهارات العالية لتقليل الخطأ ومستوى كبير الانحرافات من التهم الموجهة إليه. وقد أدت الحاجة إلى إجراء قياسات متوافقة مع صيغ الإنتاجية العالية لتطوير المقايسات multiwell لوحة. هذه المقايسات القائم على التألق قنينةإعادة أعداد الخلايا بناء على إشارة الانارة التي تتناسب مع النشاط الأيضي للخلية 11،12. وفي الآونة الأخيرة، سمحت بإدخال منصات التصوير نسبة عالية فيما يخص الأدوات الجديدة التي تراقب انتشار الخلايا في الوقت الذي توفر جمع البيانات المظهرية الكمي والنوعي، ويتضمن مجموعة متنوعة من أنظمة 13. كل من هذه الأساليب توفير السبل لقياس نمو الخلايا، إما عن طريق قياس أو نقطة النهاية فحوصات مستمرة، وتملك كل مجموعة من المزايا والعيوب فيما يتعلق حساسية، مرت من أعداد العينات، والمعلومات الخلية، والتي يمكن أن يكون وزنه وفقا لذلك اعتمادا على سؤال البحث.

يصف هذا البروتوكول ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في المختبر، مع كل طريقة استخدام نطاقات مختلفة من الحساسية، واستنساخ وصيغ لوحة متعددة أيضا. هذا البروتوكول يهدف إلى المقارنة بين استخدام تشا العد عدادة الكرياتmber، وبقاء الخلية فحص القائم على التألق، وتصوير الخلية، في قياس انتشار الخلايا على دوام 96 ساعة. للقيام بذلك، وتمت مقارنة نمو الخلايا transduced متجه (قدم مكعبة-7-ليغو) إلى خلايا transduced إلى بإفراط Δ40p53 (قدم مكعبة-7-Δ40p53)، وذلك باستخدام ثلاث كثافات مختلفة من الخلايا. وقد تم قياس انتشار الخلايا كل 24 ساعة لمدة تصل إلى 96 ساعة. تم العثور على كل أسلوب لديها مزايا وعيوبه، وهذا يتوقف على الهدف من التجربة، كل ما زالت هي طريقة قيمة لتوفير المعلومات عن معدل انتشار.

Protocol

1. خلايا التحضير لانتشار فحوصات

ملاحظة: إعداد خطوط الخلايا اثنين بنفس الطريقة والبذور في نفس الشكل لكل منها طريقة لتحليلها.

  1. تنمو قدم مكعبة-7-ليغو وقدم مكعبة-7-Δ40p53 7 الخلايا 75-80٪ التقاء في تي 75 سم قوارير ثقافة 2 النسيج باستخدام الفينول الأحمر مجانا Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 200 مم L-الجلوتامين، 2 ميكروغرام / مل الانسولين و 1 ميكروغرام / مل بوروميسين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. التعامل مع الخلايا في السلامة الأحيائية العقيمة الطبقة مجلس الوزراء الثاني.
    ملاحظة: مقدار الوقت الذي يستغرقه لتنمو الخلايا لالتقاء يختلف تبعا لتخفيف البذر. استعدادا لطلاء الخلايا لفحوصات انتشار البذور، والخلايا في التخفيف 1: 3 في DMEM تستكمل والحفاظ في ظروف النمو الطبيعي لمدة 3 أيام حتى 75-80٪ confluency.
  2. لإزالة الخلايا من القارورة، تخلصي من وسائل الاعلام الىحاوية النفايات. يغسل فورا طبقة الخلايا مع 2 مل من قبل تحسنت التربسين 2X. نضح التربسين. إضافة مزيد من 2 مل من التربسين قبل تحسنت إلى طبقة الخلايا ومكان في حاضنة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    1. مرة واحدة فصل الخلايا، وغسل الخلايا مع حرارة تستكمل الطازجة DMEM 10 مل. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 491 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح بعناية والتخلص من طاف.
  3. resuspend الكرية خلية في 5 مل من DMEM تستكمل جديدة. إجراء تعداد خلايا لتحديد الكثافة الصحيحة البذور الخلايا في لوحات 96-جيدا.
    1. تمييع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 900 ميكرولتر 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS). وضع جهاز استشعار 60 ميكرون الجديد على مكافحة الخلايا الآلي. باستمرار المكبس وغمر استشعار في تعليق خلية المخفف. ببطء الافراج عن الغطاس على العداد الخلية. إزالة الاستشعار من فصول التوجيه الجامعي خليةnter عند اكتماله.
      ملاحظة: سيتم عرض عدد الخلايا على مكافحة الخلايا في خلية / مل.
  4. خلايا البذور في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر (في DMEM) في لوحة 96-جيدا في ~ 20٪ confluency للسماح للغرفة لنمو الخلايا وقياس انتشار أكثر من 3-5 أيام (انظر الجدول 1). البذور جميع خطوط الخلايا في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: للحصول على هذه التجربة، تم تقييم ثلاثة كثافات مختلفة من الخلايا لتحديد كثافة الخلية المثلى. وتتلخص أعداد الخلايا المطلوبة في الجدول 1. خلايا البذور في مناطق ذات كثافة أقل إذا كان مطلوبا قياس مزيد من النمو على المدى الطويل.
    1. لعدادة الكريات والمقايسات القائم على التألق، وإعداد لوحة واحدة في نقطة زمنية (أي 4 لوحات في الفحص). لفحص الخلايا تصوير، وإعداد لوحة واحدة فقط خلال مدة التجربة.
  5. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.

2. عدد تحديد خلية بناجي عدادة الكريات

  1. قبل دافئة التربسين على حد سواء المتوسطة وإلى 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية، فرن أو حمام مائي. وسائل الإعلام نضح من الخلايا في حاوية النفايات، وغسل مرة واحدة مع 30 ميكرولتر من التربسين 2X، ونضح التربسين.
  2. غسل الخلايا مرة أخرى مع 30 ميكرولتر من التربسين 2X، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق حافة لوحة لإزاحة الخلايا من لوحة. إضافة 50 ميكرولتر من DMEM تستكمل ومزيج خلايا قبل pipetting حتى تشكل خلايا تعليق خلية واحدة.
  3. إعداد عدادة الكريات عن طريق تنظيف السطح والغطاء الزجاجي مع 70٪ من الإيثانول.
  4. وضع غطاء زجاجي الانزلاق على غرف عد ويضعوا حتى يمكن رؤية "حلقات الانكسار نيوتن" بين حواف غطاء الانزلاق وعدادة الكريات.
    ملاحظة: هذه إشارة إلى أن تغطية الانزلاق التزمت بشكل صحيح إلى عدادة الكريات.
  5. ماصة بلطف 20 ميكرولتر من تعليق خلية تحت غطاء قابل للانزلاق، وملء غرفة الفرز من قبل الحركة الشعرية.وضع عدادة الكريات تحت التكبير 10x المجهر ووضع تصور لغرف العد والفرز في تخطيط الشبكة.
  6. عدد الخلايا في الساحات الخارجية 4 من تخطيط الشبكة. لتحسين دقة، كرر اتهامات الساحات الخارجية إضافية إذا لزم الأمر، أو حتى العد وصلت 70-100 الخلايا 14،15.
    1. حساب تركيز خلية لكل مليلتر على النحو التالي: متوسط ​​عدد الخلايا في عامل مربع س التخفيف (في حال استخدامها) × 10 4
  7. كرر الخطوات من 2،1-2،8 كل 24 ساعة لمدة 96 ساعة بعد البذر.

3. تحديد انتشار خلية باستخدام الفحص على أساس التلألؤ

ملاحظة: هذا قياس نقطة النهاية. حالما يتم إضافة كاشف للخلايا، لا يمكن إلا أن يكون كميا لوحة واحدة.

  1. كاشف التلألؤ ذوبان في 22 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
  2. المزيج بلطف كاشف كتبها قلب الزجاجة للحصول على مزيج متجانس.
  3. تتوازن لوحة واحدة من خلايا المصنف (من الخطوة1.5) في RT لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف التلألؤ على كل جانب. خلط محتويات على شاكر المداري لمدة 2 دقيقة. تسمح لوحة لاحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. إعداد تجربة التلألؤ باستخدام متعددة وضع برنامج لوحة القارئ.
    1. تشغيل متعدد الأوضاع قارئ لوحة وفتح البرنامج. في "إدارة المهام"، حدد "تجارب" و "إنشاء new'.Select 'الملف' من شريط الأدوات الجانبي، وتحت عنوان" بروتوكول "علامة التبويب، حدد" الإجراء ".
    2. اختر 'جرينير 96 مسطحة القاع "نوع لوحة، والتحقق من مربع" استخدام غطاء ". تحديد العمل 'قراءة' تحت خانة "طريقة قراءة '. اختر 'التلألؤ "طريقة الكشف. انقر فوق "موافق".
    3. في مربع خطوة قراءة، تحديد الآبار التي يتم مسحها ضوئيا ضمن علامة التبويب "لوحة كاملة، وتحديد الآبار للعمل الآبار كما فارغة.
    4. تعيين عامل التصفية لتعيين مرشح فارغة (على سبيل المثال، والمكونات، إم: حفرة، المرآة: لا شيء). تعيين مكسب ل135، مع الوقت التكامل من 0.5 ثانية لكل بئر وارتفاع قراءة من 6.5 مم. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات للقراءة التلألؤ.
  6. أداء الفلورسنت مقروءة
    1. إخراج حامل لوحة عن طريق اختيار علامة التبويب "السيطرة أداة 'ثم اضغط على" لوحة out'.Place وحة 96 جيدا على حامل لوحة، وضمان غطاء على. إغلاق حامل لوحة بالضغط على "لوحة في" علامة التبويب تحت "السيطرة أداة". انقر على "قراءة الآن" من شريط الأدوات لأداء القراءة الانارة.
    2. تصدير القياسات النسبية وحدة الانارة (RLU) لكل بئر إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
  7. كرر الخطوات من 3،1-3،6 لتسجيل انتشار كل 24 ساعة تصل إلى 96 ساعة بعد البذر الخلايا.

4. تحديد عدد الخلايا باستخدام جهاز التصوير خلية

  1. إعداد تجربة التصوير الخلية باستخدام متعددة وضع البرامج خلية تصوير
    1. تشغيل متعدد الأوضاع تصوير الخلية وعشر مفتوحةبرنامج البريد.
    2. في "إدارة المهام"، حدد علامة التبويب "تجارب" و "إنشاء new'.On على" ملف "شريط الأدوات، انقر على '' علامة التبويب وفتح 'بروتوكول الإجراء" tab.Select "مجموعة درجات الحرارة' العمل. تعيين حاضنة ل'على' وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وتحقق "سخن" قبل المتابعة مع مربع الخطوة التالية ". انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات.
    3. تحديد العمل 'قراءة'. انقر على 'صورة' طريقة الكشف، اختر 'نقطة النهاية / الحركية "قراءة نوع ونوع البصريات" مرشحات ". انقر على "OK'.Click على 'علامة التبويب لوحة كاملة' وحدد الآبار على طبق من ذهب إلى أن تصوير. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات.
    4. حدد الهدف 2.5X من القائمة المنسدلة خيارات "الأهداف". ضمن علامة التبويب "قنوات"، حدد قناتين: GFP 469، 525 والميدان مشرق. تحقق "السيارات" التعرض لكل من القنوات وتحديد التعرض السيارات أيضا.
    5. لتحديد التسليمس ضبط التركيز، اختر 'التركيز التلقائي "وانقر على" خيارات ". لخيارات التركيز التلقائي، حدد "مسح ثم التركيز التلقائي" الأسلوب. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات.
    6. ضبط الأفقي والرأسي تعويض من مركز جيد (ميكرون) إلى 0.Select لمسح عدة صور لكل بئر في المونتاج 3 × 2، مع التباعد الأفقي (ميكرون) = 2881 والتباعد العمودي (ميكرون) = 2127. انقر فوق "موافق" لحفظ إعدادات الإجراء.
      ملاحظة: انظر الجدول رقم 2 للمعلمات القراءة.
  2. أداء مقروءة تجربة على لوحة مختارة
    1. انقر على علامة التبويب "السيطرة أداة 'وحدد" لوحة خارج' function.Place لوحة 96-جيدا في حامل لوحة، وضمان غطاء على. ضمن علامة التبويب "السيطرة أداة"، حدد "لوحة في" وظيفة. اختر 'قراءة الآن "من علامة التبويب لوحة. تكرار قراءة كل 24 ساعة تصل إلى 96 ساعة بعد البذر.
  3. تحليل عدد خلايا باستخدامخلية تصوير البرنامج.
    1. تحليل صورة، انقر فوق علامة التبويب "البيانات" على لوحة المصورة، حدد "الصورة [GFP 469، 525 + الحقل مشرق] '. انقر مرتين على تصويرها بشكل جيد.
    2. انقر على الصورة المحملة. اختر 'تحليل' وحدد صورة واحدة من المونتاج ليتم تحليلها. انقر على "OK'.Check على" GFP "قناة فقط، وتعيين المعلمات على النحو المبين في الجدول 3. انقر على" ستارت "لتطبيق المعلمات إلى الخلايا المصورة.
    3. مراقبة قناع عد الخلايا وضعت على الخلايا المصورة، والذي يستخدم لتحديد عدد الخلايا في صورة. انقر على "تطبيق التغييرات" والحفاظ على هذه الإعدادات لكل لوحة تصوير كافة مراحل التجربة.
    4. مرة واحدة إلى الوراء في لوحة المصورة، انقر على انخفاض "البيانات" من القائمة المنسدلة واختر 'خلايا'. هذا وسوف تولد خلايا الكلي لكل بئر.
    5. تصدير جميع البيانات إلى جدول بيانات عن طريق النقر على علامة التبويب "تصدير" لمزيد من التحليل سو عدد الخلايا لكل بئر.

النتائج

لدراسة أساليب مختلفة لقياس انتشار الخلايا المستزرعة، وتكاثر الخلايا من قدم مكعبة-7-Δ40p53 خلايا transduced وبالمقارنة مع غير transduced-قدم مكعبة-7-ليغو سرطان الثدي خط الخلية. الطرق الثلاثة التي تم مقارنة - التصوير طريقة عدادة الكريات التقليدية، بقاء الخلية الت...

Discussion

في هذا البروتوكول تم فحص ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في الخلايا المستزرعة. كان كل طريقة قادرة على قياسات متكررة ودقيقة من تكاثر الخلايا أكثر من 96 ساعة، وكانت النتائج مماثلة بين كل من طرق اختبار (الشكل 2 و 3). كلا الفحص القائمة على التألق وطريقة التصوي?...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-redThermoFisher Scientific21063-045Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)ThermoFisher Scientific25030-081
Insulin solution humanSigma-AldrichI9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)Bovogen BiologicalsSFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochlorideSigma-AldrichP9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)ThermoFisher Scientific15400-054Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)ThermoFisher Scientific30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth areaGreiner Bio-One658175
Scepter 2.0 Cell CounterMerck MilliporeAutomated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottomNunc167008
Improved Neubauer HemocytometerBOECO GermanyBOE 01
Olympus IX51 inverted microscopeOlympusIX51
CellTiter-Glo 2.0 AssayPromegaG9242Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBioTekPlate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis SoftwareBioTekGEN5

References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
  12. . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
  14. Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
  15. Bastidas, O. . , (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved