Сравнение трех различных методов для определения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях

Резюме

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Аннотация

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Введение

Ген - супрессор опухолей р53, является существенным регулятором ряда клеточных процессов, в том числе остановки клеточного цикла, апоптоза и старении ^1. Он отвечает за поддержание стабильности генома, и, следовательно, имеет решающее значение для поддержания баланса гибели клеток и роста клеток. Мутации в p53 являются общими в рак и являются основной причиной инактивации р53 приводит к пролиферации клеток рака неконтролируемое ^2. Интересно отметить , что мутации в р53 составляют лишь около 25% случаев рака молочной железы ^3, предполагая , что другие механизмы ответственны за потерю функции р53. Недавно открытые изоформы р53 , как было показано быть избыточно экспрессируется в ряде злокачественных опухолей человека, и могут модулировать функцию p53 ^4,5. Ранее мы показали, что р53 изоформы, Δ40p53, является самым высоким уровнем экспрессии изоформ при раке молочной железы, а также значительно усиливает свою активность в клетках рака молочной железы, по сравнению с нормальными смежного TISS⁶ уе. Вслед за этим, мы стабильно трансдуцированная человеческой линии клеток рака молочной железы MCF-7 гиперэкспрессией Δ40p53 с использованием Лего-IG2-Puro + вектор (GFP +) ^7. Эти клетки были использованы для исследования, если высокий уровень экспрессии Δ40p53 увеличивает скорость пролиферации клеток в клетках рака молочной железы.

Есть много прямых и косвенных методов измерения клеточной пролиферации культивируемых клеток в пробирке ^8,9. Они могут быть выполнены либо в виде непрерывных измерений с течением времени, или в качестве конечной точки анализов ^10. Обычные методы по-прежнему полезны, например, подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Этот анализ является низкая стоимость и прямой мерой числа клеток, но он полагается на больших кровяных клеток и высококвалифицированной подготовки для минимизации ошибок и больших стандартных отклонений от подсчетов. Необходимость проведения измерений, совместимых с форматами высокой пропускной способности привело к разработке анализов многоямный тарелками. Эти люминесценции на основе анализов колбыRe числа клеток на основе сигнала , люминесцентный , который пропорционален метаболической активности клетки ^11,12. Совсем недавно, введение платформ формирования изображений с высоким содержанием позволило новых инструментов , которые контролируют пролиферацию клеток, обеспечивая количественный и качественный сбор фенотипических данных, и включает в себя множество систем ^13. Все эти методы обеспечивают пути для измерения роста клеток, либо путем непрерывного измерения или конечных точек анализов, и каждый обладает целым рядом преимуществ и недостатков в отношении чувствительности, пропускная способность номера образцов, а также информацию ячейки, все из которых могут быть весила соответствующим образом в зависимости на вопрос исследования.

Этот протокол описывает три различных метода измерения пролиферации клеток в пробирке, с каждым способом , использующим различные диапазоны чувствительности, воспроизводимости и многолуночных форматов пластин. Этот протокол направлен сравнить использование подсчета гемоцитометр CHAmber, жизнеспособность клеток анализ на основе люминесценции, а ячейка тепловизор, при измерении пролиферации клеток с течением времени курс 96 часов. Для этого, рост вектор-трансдуцированных клеток (MCF-7-Лего) сравнивали с клетками трансдуцированных что экспрессия Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), с использованием трех различных плотностей клеток. пролиферации клеток измеряли каждые 24 ч в течение до 96 часов. был найден Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от цели эксперимента, каждый по-прежнему является ценным методом для предоставления информации о скорости пролиферации.

протокол

1. Подготовка Клетки для анализа пролиферации

Примечание: Подготовьте две клеточные линии таким же образом, и семя в том же формате, для каждого метода для анализа.

1. Grow MCF-7-Лего и MCF-7-Δ40p53 ⁷ клеток до 75-80% слияния в Т 75 см ² флаконах для культуры ткани с использованием фенола-красный свободный Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) , , 200 мМ L-глутамина, 2 мкг / мл инсулина и 1 мкг / мл пуромицина при температуре 37 ° с с 5% CO _2. Обрабатывать клетки в стерильный биозащитой класса II.
   Примечание: количество времени, которое требуется, чтобы вырастить клетки до слияния варьирует в зависимости от посевного разведения. В процессе подготовки к металлизации клеток для анализа пролиферации, семенные клетки в отношении 1: 3 разведением в среде DMEM, дополненной и поддерживать в нормальных условиях роста, в течение 3-х дней, пока 75-80% сплошности.
2. Для удаления клеток из колбы, слейте носитель вотходов контейнер. Немедленно промыть слой клеток с 2 мл подогретого 2x трипсина. Отберите трипсина. Добавить еще 2 мл подогретого трипсин к слою клеток и место в термостате в течение 5 мин при температуре 37 ° С с 5% CO _2.
   1. После того, как клетки отделить, промыть клетки с 10 мл утепленные свежей DMEM, дополненной. Передачи клеточной суспензии в стерильный 15 мл пробирку и центрифугируют при 491 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно аспирата и распоряжаться супернатанта.
3. Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл свежей среды DMEM, дополненной. Выполнить подсчет клеток, чтобы определить правильную плотность потомству клеток в 96-луночные планшеты.
   1. Разбавляют 100 мкл суспензии клеток в 900 мкл 1x Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS). Установите новый датчик 60 мкм на автоматизированный счетчик клеток. Удерживая поршень и погрузить датчик в разбавленной клеточной суспензии. Медленно отпустите поршень на прилавке клетки. Извлеките датчик из ячейки CouNTER после их завершения.
      Примечание: Количество клеток будет отображаться на счетчике клеток в клетках / мл.
4. Семенной клетки в конечном объеме 100 мкл (в DMEM) , в 96-луночный планшет при ~ 20% сплошности , чтобы места для роста клеток и измерения пролиферации в течение 3-5 дней (таблица 1). Семенной все клеточные линии, в трех экземплярах.
   Примечание: Для этого эксперимента три разные плотности клеток оценивали для определения оптимальной плотности клеток. Требуемые номера ячеек приведены в таблице 1. Семенной клеток при более низкой плотности , если измерение более долгосрочной роста требуется.
   1. Для гемоцитометра и анализов люминесценции на основе, подготовить одну пластину за каждую единицу времени (т.е. 4 пластин в анализе). Для анализа клеточных тепловизора, готовят только одну пластину, на время эксперимента.
5. Поддерживать клетки при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 24 часов.

2. Определение Cell Count UsING гемоцитометра

1. Предварительно теплой и средней и трипсин до 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур, духовой шкаф или водяную баню. Аспирируйте средств массовой информации из клеток в контейнер для отходов, мыть один раз с 30 мкл 2x трипсина и аспирация трипсина.
2. Промыть клетки снова с 30 мкл 2x трипсина, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Осторожно постучите краем пластины, чтобы вытеснять клетки от пластины. Добавьте 50 мкл среды DMEM, дополненной и смешать клетки пипеткой до тех пор, пока клетки не образуют суспензии отдельных клеток.
3. Подготовка гемоцитометра путем очистки поверхности и стеклянной крышкой с 70% этанола.
4. Поместите стеклянную крышку скольжения над счетных камер и наклейте до тех пор, пока можно увидеть "Ньютона рефракции кольца" между краями крышки проскальзывания и гемоцитометра.
   Примечание: Они указывают, что крышка скользит правильно приклеена к гемоцитометра.
5. Аккуратно пипеткой 20 мкл клеточной суспензии под покровным стеклом, заполняя счетнокамерное с помощью капиллярного движения.Поместите гемоцитометра под 10-кратным увеличением микроскопа и визуализировать счетные камеры в макете сетки.
6. Количество клеток в 4-х внешних квадратов макета сетки. Для повышения точности повторить подсчет дополнительных внешних квадратов , если требуется, или до подсчета не достигнет 70 - 100 клеток ^14,15.
   1. Рассчитать концентрацию клеток на мл следующим образом : Среднее количество клеток на квадратный коэффициент разбавления х (если используется) х 10 ⁴
7. Повторите шаги 2.1-2.8 каждые 24 ч в течение 96 часов после высева.

3. Определение клеточной пролиферации при использовании люминесценция на основе Пробирной

Примечание: Это измерение конечной точки. После того, как реагент добавляют к клеткам, пластина может быть количественно определена только один раз.

1. Оттепели люминесценцию реагента в водяной бане при 22 ° С в течение 30 мин.
2. Аккуратно перемешайте реагент, перевернув бутылку, чтобы получить однородную смесь.
3. Равновесие одну пластину из посеянных клеток (из стадии1,5) при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Добавьте 100 мкл реагента люминесценции в каждую лунку. Смешайте содержимое на орбитальном шейкере в течение 2 мин. Разрешить пластины инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Настройка свечения эксперимент с использованием многомодового программного обеспечения на планшет-ридер.
   1. Включите многорежимный ридере и откройте программное обеспечение. В "диспетчере задач", выберите "эксперименты" и "создать new'.Select 'файл' из боковой панели, а под" протокола "вкладки, выберите« процедура ».
   2. Выберите 'Гренье 96 плоское дно "пластинчатого типа, и установите флажок" Использовать крышку ". Выберите "читать" действия в графе "метод чтения". Выберите метод обнаружения "люминесценции". Нажмите 'OK'.
   3. В ступенчатой ​​коробкой для чтения, выберите лунки, которые будут проверяться на вкладке "полную тарелку" и выберите колодцы, чтобы действовать как пустые скважины.
   4. Установите фильтр установлен на пустой фильтр (например, пробки, Em: отверстие, зеркало: нет). Установить усиление на135, со временем интегрирования 0,5 сек на лунку и для чтения высотой 6,5 мм. Нажмите "OK" для сохранения настроек для чтения люминесценции.
6. Выполнение Люминесцентные Read
   1. Извлечь держатель пластин, выбрав вкладку "Управление прибором" и нажмите на "тарелку out'.Place 96-луночного планшета на держателе, обеспечивая крышку на. Закройте держатель пластины, нажав на "тарелку" на вкладке в разделе "управления прибором". Нажмите на «читать сейчас» из панели инструментов, чтобы выполнить люминесцентный чтения.
   2. Экспорт относительных измерений люминесцентный блок (РОС) для каждой скважины в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
7. Повторите шаги 3.1-3.6 для записи пролиферации каждые 24 ч до 96 ч после посева клеток.

4. Определение ячеек Count с помощью мобильного тепловизора

1. Настройка эксперимента визуализации клеток с использованием многомодового ячейки Imager программного обеспечения на
   1. Включите томографа ячейки многорежимный и открытой гое программное обеспечение.
   2. В "диспетчере задач", выберите вкладку "Эксперименты" и "создать new'.On на '' панель инструментов, нажмите на" Файл "вкладку и открыть 'протокол процедуры' tab.Select 'заданной температуры' действий. Установить инкубатор 'на' и установить температуру до 37 ° C и проверьте "Прогрев" перед продолжением следующего шага 'коробки. Нажмите "OK" для сохранения настроек.
   3. Выберите "читать" действия. Нажмите на метод обнаружения 'изображения', выберите 'конечной точки / кинетическое' прочитать тип и тип оптики "Фильтры". Нажмите на ссылку "OK'.Click на" вкладке полную тарелку "и выберите лунки на планшете для включения в образ. Нажмите "OK", чтобы сохранить настройки.
   4. Выберите цель 2.5x из выпадающего вариантов "целей". На вкладке "каналы", выберите два канала: 469, GFP 525 и светлом поле. Проверить "Auto" экспозиции для обоих каналов и выбрать автоматическую экспозицию хорошо.
   5. Для определения Autо настройки фокусировки, выберите "автофокус" и нажмите на кнопку "Параметры". Для вариантов автоматической фокусировки, выберите метод "сканирования, а затем автоматической фокусировки '. Нажмите "OK" для сохранения настроек.
   6. Установите горизонтальное и вертикальное смещение от центра скважины (мкм) до 0.Select для сканирования нескольких изображений на лунку в 3 х 2 монтажа с горизонтальным шагом (мкм) = 2,881 и вертикальное расстояние между ними (мкм) = 2,127. Нажмите "OK" для сохранения настроек процедуры.
      Примечание: смотри таблицу 2 для параметров чтения.
2. Выполнение чтения эксперимент по Selected Plate
   1. Нажмите на вкладку "управления прибором" и выберите "осаждаются" function.Place 96-луночного планшета в держателе, обеспечивая крышку на. На вкладке "управления прибором", выберите "тарелку в" функции. Выберите «читать сейчас» на вкладке пластины. Повторите прочитать каждые 24 ч до 96 ч после засева.
3. Анализ клеток графа ИспользованиеCell Imager Программное обеспечение.
   1. Для анализа изображения, нажмите на вкладку "данные" на распечатанных пластине, выберите "картинка [469 GFP, 525 + Светлое поле] '. Двойной щелчок по снятое хорошо.
   2. Нажмите на загруженном изображении. Выберите 'анализ' и выберите одно изображение монтажа для анализа. Нажмите 'OK'.Check на' 'GFP канала только, и установить параметры , как указано в таблице 3. Нажмите кнопку "Start" , чтобы применить параметры к изображаемых клеток.
   3. Обратите внимание на маску подсчета клеток помещается над изображаемых клеток, который используется для определения количества клеток для каждого изображения. Нажмите кнопку "Применить изменения" и сохранить эти настройки для каждой пластины изображаемого на протяжении всего эксперимента.
   4. Однажды в распечатанных пластине, нажмите на падение "данные" вниз меню и выберите "количество клеток". Это будет генерировать общее число клеток на лунку.
   5. Экспорт всех данных в электронную таблицу, нажав на вкладку "Экспорт" для дальнейшего анализа состояне количества клеток на лунку.

Результаты

Изучить различные методы измерения пролиферации культивируемых клеток, пролиферацию клеток в клетках MCF-7-Δ40p53 приемными клетками сравнивали с не-трансдуцированных клеток MCF-7-Лего клеток рака молочной железы линии. Эти три метода , которые сравнивали - обычный метод г?...

Обсуждение

В этом протоколе были рассмотрены три различных метода измерения пролиферации клеток в культуре клеток. Каждый метод был способен воспроизводимые и точные измерения пролиферации клеток в течение 96 часов, а результаты были сравнимы между каждым из методов тестируемых (рис 2 и 3).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5