乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

要約

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

要約

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

概要

腫瘍抑制遺伝子は、p53は、細胞周期停止、アポトーシス及び老化^1を含む細胞プロセスの多数の重要な調節因子です。これは、ゲノムの安定性を維持する責任があり、したがって、細胞死と細胞増殖のバランスを維持するために重要です。 p53の突然変異は、癌において一般的であり、制御されていない癌細胞の増殖を²につながるp53の不活性化の主な原因です。興味深いことに、p53の中の変異は、唯一の他のメカニズムがp53機能の喪失の原因であることを示唆し、乳癌³の約25％を占めています。最近発見されたp53のアイソフォームは、ヒト癌の多数において過剰発現されることが示されており、p53機能^4,5を調節^することができます。我々は、p53のアイソフォーム、Δ40p53は、乳癌において最も高度に発現されるアイソフォームであることが以前に示されており、正常な隣接TISSと比較した場合に有意に、乳癌細胞において上方制御されますUE ^6。その後、我々は、安定レゴ-IG2-puroを+ベクターを用いΔ40p53（GFP +）の^7を過剰発現するMCF-7ヒト乳癌細胞株を形質導入しました。これらの細胞は高いΔ40p53発現が乳癌細胞の細胞増殖率を増加させるかどうかを調べるために使用しました。

インビトロ ^8,9 で培養した細胞の細胞増殖を測定する多くの直接的及び間接的な方法があります。これらは、時間の経過とともに連続測定として、またはエンドポイントアッセイ¹⁰のいずれかに行うことができます。従来の方法は、血球計数器を用いて細胞計数として、依然として有用です。このアッセイは、低コストと細胞数の直接の尺度であるが、それは数からの誤差と大きな標準偏差を最小にするために大規模な細胞数と高度に熟練した訓練に依存しません。ハイスループットフォーマットと互換性のある測定を行う必要がマルチウェルプレートアッセイの開発につながっています。これらの発光ベースアッセイmeasuセル^11,12の代謝活性に比例する発光シグナルに基づいて、細胞数の再。より最近では、高含量のイメージングプラットフォームの導入は、定量的及び定性的な表現型データ収集を提供しつつ、細胞増殖をモニターする新しいツールを許可し、システム¹³の様々な含まれています。これらの方法の全ては、連続測定またはエンドポイントアッセイのいずれかによって、細胞増殖を測定するための手段を提供し、それぞれの感度、サンプル番号のスループット、およびセル情報に関して利点と欠点の範囲を有し、によって適宜計量することができるすべてが研究の質問に。

このプロトコルは、それぞれの方法は、感度、再現性、およびマルチウェルプレートフォーマットの異なる範囲を用いて、in vitroで細胞増殖を測定するための3つの異なる方法を記載しています。このプロトコルは、茶をカウント血球計数器の使用を比較することを目的としましたmber、96時間の時間経過にわたって細胞増殖の測定における発光に基づく細胞生存率アッセイ、および細胞イメージャ。これを行うには、ベクター形質導入細胞（MCF-7-LEGO）の成長は、3つの異なる細胞密度を使用して、Δ40p53（MCF-7-Δ40p53）を過剰発現するように形質導入​​された細胞と比較しました。細胞増殖は、最大96時間ごとに24時間測定しました。それぞれの方法は、それ自身の利点と欠点を有することが見出され、実験の目的に応じて、各々が依然として増殖の速度についての情報を提供するための有益な方法で行いました。

プロトコル

増殖アッセイのために1.準備細胞

注：各メソッドを分析するために同じ形式で同じ方法及び種子中の2つの細胞株を準備します。

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したフェノールレッドフリーのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いてT 75cm ²の組織培養フラスコ中で75％〜80％コンフルエンスに⁷個^の細胞を、MCF-7、レゴとMCF-7Δ40p53成長、200 mMのL-グルタミン、2 / mlのインスリン、5％CO ₂で37℃を1μg/ mlのピューロマイシン。滅菌安全キャビネットクラスIIで細胞を処理します。
   注：これは、コンフルエンスまで細胞を増殖するのにかかる時間は、播種希釈によって異なり。増殖アッセイのために細胞をプレーティングするための準備では、1で細胞を播種する：補充したDMEM中で3希釈し、75から80までパーセントの集密度になるまで3日間、通常の増殖条件下で維持します。
2. メディアを捨てる、フラスコから細胞を除去するために、廃棄物容器。直ちに予熱2×トリプシン2mlの細胞層を洗浄します。吸引し、トリプシン。 5％CO ₂で37℃で5分間インキュベーター中に細胞層及び場所に予め温めておいたトリプシンのさらに2 mlを加え。
   1. 細胞がデタッチしたら、新鮮な補充DMEMを温め10ミリリットルで細胞を洗浄。室温で5分間、491×gでの滅菌15mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。慎重に吸引し、上清を廃棄。
3. 新鮮な補充したDMEM 5 mlに細胞ペレットを再懸濁します。 96ウェルプレートに細胞を播種するために適切な濃度を決定するために、細胞計数を行います。
   1. 900μlの1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中100μlの細胞懸濁液を希釈します。自動セルカウンターの上に新しい60μmのセンサーを配置します。プランジ​​ャーを押しながら、希釈した細胞懸濁液にセンサーを沈めます。ゆっくりセルカウンターでプランジャーを解放します。細胞COUからセンサーを削除しますNTER完了したとき。
      注：細胞数は、細胞/ mlで細胞計数器に表示されます。
4. 3~5日間にわたって増殖の細胞増殖および測定のための余地を可能にするため〜20％コンフルエントで96ウェルプレート中（DMEM中）を100μlの最終容量で種子細胞（ 表1参照）。三連ですべての細胞株をシード。
   注記：この実験では、三つの異なる細胞密度は、最適な細胞密度を決定するために評価しました。必要な細胞数を表1に要約されている。種子細胞を低密度で、より長期的な成長の測定が必要な場合。
   1. 血球計数器と発光ベースアッセイのために、（ すなわち、アッセイあたり4プレート）の時点ごとに一つのプレートを準備します。細胞イメージャアッセイのために、実験期間中のみ1のプレートを準備します。
5. 24時間、5％CO ₂で37℃で細胞を維持します。

2.決定セルはおカウント血球計数器をる

1. 前加温培地および細胞培養インキュベーター、オーブンもしくは水浴中で37℃でトリプシン両方。廃棄物容器への細胞から培地を吸引は、2倍のトリプシン30μlの1回洗浄し、トリプシンを吸引します。
2. 2倍のトリプシン30μlので再び細胞を洗浄し、37℃で5分間インキュベートします。静かにプレートから細胞を取り除くために、プレートの端をタップします。補充したDMEMの50μlを添加し、細胞を単一細胞懸濁液を形成するまで、ピペッティングにより細胞を混ぜます。
3. 70％エタノールで表面とガラスカバーを洗浄することにより、血球計数器を準備します。
4. 計数室の上にガラスカバースリップを置き、「ニュートンの屈折リングは「カバースリップエッジと血球計数器との間で見ることができるようになるまで貼ります。
   注：これらは、カバースリップが正しく血球計数器に付着したことを示しています。
5. ゆっくり毛管運動によって計数室を埋め、カバースリップの下での細胞懸濁液20μLをピペット。顕微鏡の10倍の倍率で血球計数器を置き、グリッドレイアウト内の計数室を可視化します。
6. グリッドレイアウトの4外側の正方形のセルをカウントします。精度を向上させるために、付加的な外側の正方形の反復回数が必要、またはカウントまで70に達した場合- 100セル^14,15。
   1. 次のように1ml当たり細胞濃度を計算します。正方形のx希釈倍率ごとの平均細胞数（使用する場合）10 ^4を xは
7. 繰り返しは、2.1から2.8まで24時間毎に96時間、播種後の手順。

3.発光ベースのアッセイを用いて細胞増殖を決定します

注：これは、エンドポイントの測定です。試薬が細胞に添加されると、プレートは一度だけ定量することができます。

1. 30分間22℃の水浴中で解凍発光試薬。
2. 静かに均質な混合を得るために、ボトルを反転させることにより、試薬を混ぜます。
3. ステップから（播種した細胞の一方のプレートを平衡化1.5）で30分間室温で。
4. 各ウェルに発光試薬を100μlを追加します。 2分間オービタルシェーカー上のコンテンツを混ぜます。プレートを室温で10分間インキュベートすることができます。
5. マルチモードプレートリーダーソフトウェアを使用して発光実験を設定します。
   1. マルチモードプレートリーダーをオンにして、ソフトウェアを開きます。 「タスクマネージャ」で、「実験」を選択し、ファイル 'new'.Select作成' '側のツールバーからを、そして下の「プロトコル手順を' 'タブを選択」。
   2. 「グルニエ96平底「プレートのタイプを選択し、「使用のふた」チェックボックスをオンにします。 「読み取り方法]ボックスの下の「読み取り」アクションを選択します。 「ルミネセンス」検出方法を選択します。 「OK」をクリックします。
   3. 読み出しステップ]ボックスで、「完全版」タブでスキャンする井戸を選択して、などのブランクウェルとして作用することが井戸を選択します。
   4. （：穴、ミラー：なし例えば 、プラグ、エム）空のフィルタに設定されたフィルタを設定します。にゲインを設定します135、ウェル当たり0.5秒の積分時間6.5ミリのリード高さを有します。発光読み取りのための設定を保存し、「OK」をクリックします。
6. 発光読み取りを実行します
   1. 「計測器制御」タブを選択することにより、プレートホルダーを取り出し、「蓋を確保する上で、プレートホルダーに96ウェルプレートをout'.Placeプレートをクリックしてください。 「計測器制御]タブの[内プレート」をクリックすることで、プレートホルダーを閉じます。発光読み取りを実行するには、ツールバーから「今すぐ読み」をクリックします。
   2. よくさらなる分析のためにスプレッドシートにそれぞれの相対発光単位（RLU）の測定値をエクスポートします。
7. 繰り返しは、細胞を播種した後、増殖を96時間に24時間毎の最大を記録するために3.1から3.6を繰り返します。

4.セルイメージャーを用いて細胞数を決定します

1. マルチモードセルイメージャー・ソフトウェアを用いた細胞イメージング実験のセットアップ
   1. マルチモードセルイメージャとオープン番目をオンにします電子ソフトウェア。
   2. 「タスクマネージャ」で、「実験」タブを選択し、ファイル 'new'.Onを作成する' 'ツールバー、をクリックして「プロトコル」タブを開いて「プロシージャ' tab.Select「設定温度」アクション。 「ON」にインキュベーターを設定し、37℃に温度を設定し、次のステップ」のボックスを続行する前に、「予熱」を確認してください。設定を保存するには、「OK」をクリックします。
   3. 「読み取り」アクションを選択します。 「画像」検出方法をクリックして「エンドポイント/運動「読み取りタイプと「フィルタ」の光学系のタイプを選択します。フルプレート]タブ」をOK'.Click」をクリックして、画像化されるプレート上のウェルを選択します。設定を保存するには、「OK」をクリックします。
   4. 「目標」オプションのドロップダウンから2.5倍の対物レンズを選択します。 GFP 469、525及びブライトフィールド：「チャンネル」タブで、2つのチャネルを選択します。両方のチャネルは 'auto'で露出を確認し、十分に自動露出を選択します。
   5. AUTを決定するために、Oフォーカスの設定は、「オートフォーカス」を選択し、「オプション」をクリックします。オートフォーカスのオプションについては、「スキャンした後、オートフォーカス」メソッドを選択します。設定を保存するには、「OK」をクリックします。
   6. 水平方向の間隔（μm）で= 2881および垂直方向の間隔（μm）と= 2127で、3×2モンタージュにウェル当たり複数の画像をスキャンする0.Selectするウェル（ミクロン）の中心から水平および垂直方向のオフセットを設定します。手順の設定を保存するには、「OK」をクリックします。
      注：読み取りパラメータについては、 表2を参照してください。
2. 選択されたプレート上で読むの実験を行います
   1. 「機器制御」タブをクリックして、蓋がオンになっている確保し、プレートホルダーでfunction.Place 96ウェルプレートを「プレートアウト」を選択します。 「計測器制御]タブで、関数 'でプレート」を選択します。選択プレートタブから「今読んで」。 96時間後に播種し24時間毎のアップを読んで繰り返します。
3. 用いた細胞数の分析セルイメージャソフトウェア。
   1. 画像を分析するために、画像形成されたプレート上で「データ」タブをクリックし、選択し "画像[GFP 469、525 +明視野] '。よく撮像された上でダブルクリックします。
   2. ロードされた画像をクリックしてください。選択して「分析」と分析するモンタージュの単一のイメージを選択します。 GFP「OK'.Check「クリック」だけチャネル、および表3に概説のように設定したパラメータを。クリックして「画像化された細胞にパラメータを適用するには、START 'を。
   3. 画像あたりの細胞数を決定するために使用される画像化された細胞上に置か細胞計数マスクを観察します。 「変更を適用」と実験を通して撮像された各プレートのために、これらの設定を維持する]をクリックします。
   4. いったん戻って画像形成されたプレートで、「データ」のドロップダウンメニューを選択し「細胞数」をクリックします。これは、ウェル当たりの総細胞数を生成します。
   5. さらなる分析のoには、「エクスポート」タブをクリックすることにより、スプレッドシートにすべてのデータをエクスポートします。ウェル当たり細胞数F。

結果

培養された細胞の増殖を測定する別の方法を研究するために、MCF-7Δ40p53形質導入細胞の細胞増殖は、非形質MCF-7レゴ乳癌細胞株と比較しました。比較された三つの方法-従来の血球計数法、細胞生存率発光アッセイ、及び概略図（ 図1）に概説されている解析-細胞イメージング。それぞれの方法にも長所と短所が正確に時間をかけて細胞計数を測定するこ?...

ディスカッション

このプロトコルでは、培養細胞における細胞増殖を測定する3つの異なる方法を検討しました。それぞれの方法は、96時間にわたる細胞増殖の再現性と正確な測定が可能であった、その結果は（ 図2及び3）試験方法の各々の間で同等でした。発光ベースのアッセイ及び細胞イメージング法の両方が、96時間後の細胞増殖の線形増加を示し、最も堅牢な結果が得られた（ 図

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5