유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

요약

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

초록

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

서문

종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 ^한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 ^증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 ^3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 ^4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE ^(6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 ⁷ Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식​​ 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다.

시험관 ^8,9 배양 세포의 세포 증식을 측정하는 다수의 직접 및 간접 방법이있다. 이러한 시간에 따른 연속 측정 또는 종점 분석법 ¹⁰ 중 수행 될 수있다. 기존의 방법은 혈구를 사용하여 세포 계수로, 여전히 유용하다. 이 분석은 낮은 비용과 셀 번호 직접 측정이지만, 계산에서 오류가 큰 표준 편차를 최소화하기 위해 큰 세포 수 및 숙련 된 훈련에 의존 않는다. 고 스루풋 포맷과 호환 측정을 수행 할 필요가 멀티 웰 플레이트 검정의 개발을 유도 하였다. 이 발광 기반 분석은 measu셀 ^{(11, 12)의} 대사 활동에 비례하는 발광 신호에 기초하여 세포 수를 재. 최근에, 고 함량의 이미징 플랫폼의 도입 양적 및 질적 표현형 데이터 수집을 제공하는 동안 세포 증식을 모니터링 할 수있는 새로운 도구시키고, 시스템 ^(13)의 다양한 종류를 포함하고있다. 이들 방법은 모두 연속적인 측정 또는 종점 분석법에 의해 하나, 세포의 성장을 측정하는 길을 제공하며, 각 따라 적절하게 칭량 할 수 모두 감도에 관해서, 시료 번호의 처리량 및 셀 정보 장단점 범위를 가지고 연구 질문에.

이 프로토콜은 감도, 재현성 및 멀티 웰 플레이트 포맷의 다른 범위를 이용하여 각 방법으로 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 혈구 계수 차의 사용과 비교 대상mber 96 시간의 시간 과정을 통해 세포 증식의 측정에 기반 발광 세포 생존력 분석법 및 세포 이미 저. 이를 위해, 벡터 - 형질 도입 된 세포 (MCF-7 LEGO)의 성장은 세 가지 세포 밀도를 사용 Δ40p53 (MCF-7 Δ40p53)를 과발현하는 형질 도입 된 세포와 비교 하​​였다. 세포 증식은 최대 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다. 각 방법은 자체의 장점 및 단점을 갖는 것으로, 상기 실험의 목적에 따라 각 여전히 증식 속도에 대한 정보를 제공하기위한 유용한 방법 하였다.

프로토콜

대량 살상 무기 확산 시험 법 1. 준비 세포

주 : 각각의 방법은 분석 될 수 있도록 동일한 포맷에 동일하게 종자의 두 세포주를 준비한다.

1. 사용 T에 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 75 ^㎠로 조직 배양 플라스크 75-80% 합류 ⁷ 세포 성장 페놀 레드없는 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (FBS) 200 mM의 L- 글루타민, 2 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 % CO _2, 37 ℃에서 1 μg의 / ml의 퓨로 마이신. 멸균 바이오 안전성 캐비닛 클래스 II의 셀을 처리합니다.
   참고 : 합류로 세포를 성장하는 데 걸리는 시간은 시드 희석에 따라 변한다. 확산 분석을위한 세포를 도금에 대비, 1에서 세포를 시드 : 보충 DMEM 3 희석 및 75~80%의 자랄 때까지 3 일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지한다.
2. 에 미디어를 붓고, 플라스크에서 세포를 제거하려면폐기물 용기. 즉시 예열 배 트립신 2 ㎖의 세포 층을 세척한다. 기음 트립신. 5 % CO _2, 37 ℃에서 5 분 동안 항온 세포층과 장소에 미리 가온 된 트립신의 또이 용액을 추가한다.
   1. 세포가 분리되면, 신선한 DMEM을 보충 따뜻해진 10 ml의 세포를 씻는다. RT에서 5 분 동안 491 XG에 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 조심스럽게 기음과 뜨는 폐기하십시오.
3. 신선한 보충 된 DMEM 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 96- 웰 플레이트에서 세포를 배정하는 정확한 농도를 결정하기 위해 셀 카운트를 수행한다.
   1. 900 ㎕의 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 세포 현탁액 100 ㎕를 희석. 자동 세포 계수기에 새로운 60 μm의 센서를 배치합니다. 플런저를 누른 상태에서 희석 세포 현탁액에 센서를 잠수함. 천천히 셀 카운터에 플런저를 놓습니다. 셀 COU에서 센서를 제거nter 완료 할 때.
      주 : 세포 수는 세포 / ml의 세포 카운터에 표시된다.
4. 20 % 컨 플루 ~에서 96 웰 플레이트 (DMEM)에서 100 μL의 최종 부피에서 종자 세포 3~5일 (표 1 참조)를 통해 증식 세포 증식 측정을위한 공간을 허용한다. 세중의 모든 세포 라인을 시드.
   주 :이 실험을 위해, 세 가지 세포 밀도는 최적의 세포 밀도를 결정하기 위해 평가 하였다. 필요한 세포 수는 표 1에 요약되어있다. 종자 세포를 낮은 밀도보다 장기 성장의 측정이 필요한 경우.
   1. 혈구 및 발광 기반 분석의 경우 (즉, 분석 당 4 판) 시점 당 한 판을 준비합니다. 셀 메이져 분석의 경우, 실험 지속 기간 동안 하나의 플레이트를 준비한다.
5. 24 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 세포를 유지한다.

2. 결정 세포는 우리를 카운트혈구를 보내고

1. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C까지 사전 따뜻한 두 매체와 트립신, 오븐 또는 물 목욕. 폐기물 용기에 세포를 대기음 매체는 2 배 트립신 30 μl를 한 번 세척하고, 트립신을 대기음.
2. 배 트립신 30 μl를 다시 세포를 씻으, 37 ° C에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 판에서 셀을 제거하기 위해 판의 가장자리를 누릅니다. 보충 된 DMEM 50 μl를 첨가하고 세포를 단일 세포 현탁액을 형성 할 때까지 피펫 팅하여 세포를 혼합한다.
3. 70 % 에탄올로 표면과 유리 커버를 청소하여 혈구를 준비합니다.
4. 계산 챔버 위에 유리 커버 슬립을 놓고 '뉴턴의 굴절 반지'커버 슬립의 가장자리와 혈구 사이에 볼 수있을 때까지 부착합니다.
   참고 :이 커버 슬립 올바르게 혈구에 부착 된 것을 나타냅니다.
5. 부드럽게 모세관 운동에 의해 카운팅 챔버를 채우고, 커버 슬립에 따라 세포 현탁액 20 μL 피펫.현미경의 10 배 배율에서 혈구를 놓고 그리드 레이아웃 계산 실을 시각화.
6. 그리드 레이아웃의 4 바깥 쪽 사각형의 세포를 계산합니다. 정확성을 개선하기 위해 추가로 외부 사각형의 반복 계산이 필요하거나 수까지 70에 도달하면 - 100 세포 ^{14, 15입니다.}
   1. 다음과 같이 ml의 당 세포 농도를 계산 : 사각형의 X 희석 계수 당 평균 세포 수를 (사용 된 경우) 10 ⁽⁴⁾ X
7. 반복 2.1-2.8 매 24 시간 96 시간 동안 후 파종 단계를 반복합니다.

3. 발광 기반 분석법을 이용하여 세포 증식을 결정

참고 :이 엔드 포인트의 측정이다. 시약을 세포에 첨가하면, 플레이트 번만 정량화 할 수있다.

1. 30 분 동안 22 ℃로 물을 욕조에 해동 발광 시약.
2. 부드럽게 균질 혼합물을 얻기 위해 병을 반전시킴으로써 시약을 혼합한다.
3. 단계에서 (시드 세포의 한 판 평형1.5)을 실온에서 30 분 동안.
4. 각 웰에 발광 시약 100 μl를 추가합니다. 2 분 동안 궤도 통에 내용을 섞는다. 플레이트는 실온에서 10 분 동안 배양 할 수 있습니다.
5. 다중 모드 플레이트 판독기 소프트웨어를 사용하여 발광 실험 설정.
   1. 멀티 모드 플레이트 리더를 켜고 소프트웨어를 엽니 다. '작업 관리자'에서 '실험'을 선택하고 파일 'new'.Select 만드는'측 도구 모음에서, 그리고 아래의 '프로토콜 절차'를 '탭을 선택'.
   2. 선택 'Grenier의 96 평평한 바닥'플레이트 유형 및 '사용 뚜껑'확인란을 선택합니다. '읽는 방법'상자에서 '읽기'작업을 선택합니다. '발광'검출 방법을 선택합니다. '확인'을 클릭합니다.
   3. 읽기 단계 상자에서 '전체 판'탭에서 스캔 할 수있는 우물을 선택하고 빈 우물을 행동 우물을 선택합니다.
   4. (: 구멍, 거울 : 없음 예를 들어, 플러그, 엠) 빈 필터 설정 필터를 설정합니다. 에 게인을 설정135 웰 당 0.5 초 적분 시간과 6.5 mm의 높이를 판독. 발광 읽기 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭하십시오.
6. 발광 읽기를 수행
   1. '기기 제어'탭을 선택하여 플레이트 홀더를 꺼내와 '뚜껑을 보장하는 것은 켜져 판 홀더에 96 웰 플레이트를 out'.Place 판을 클릭합니다. 아래 '기기 제어'탭 '에 판'을 클릭하여 판 홀더를 닫습니다. 발광 읽기를 수행하기 위해 도구 모음에서 '지금 읽기'를 클릭합니다.
   2. 또한 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 각각의 상대 발광 장치 (RLU) 측정을 보냅니다.
7. 반복 세포를 파종 한 후 증식에게 96 시간에 매일 24 시간 최대를 기록 할 3.1-3.6 단계를 반복합니다.

4. 셀 이미 저를 사용하여 세포 수를 결정

1. 다중 모드 셀 메이져 소프트웨어를 사용하여 세포 이미징 실험 설정
   1. 멀티 모드 셀 이미 저와 오픈 일을 켭니다전자 소프트웨어.
   2. '작업 관리자'에서 '실험'탭을 선택하고 '도구 모음에서 클릭'파일 'new'.On에게 만들기'프로토콜 '탭을 열고'절차 'tab.Select'설정 온도 '조치를. '에'에 인큐베이터를 설정하고 37 ° C로 온도를 설정하고 다음 단계 '상자를 계속하기 전에'예열 '확인합니다. 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
   3. '읽기'작업을 선택합니다. '이미지'검출 방법을 클릭하여 '엔드 포인트 / 운동'읽기 유형과 '필터'광학 유형을 선택합니다. 접시에 전체 판 '탭'에 OK'.Click '를 클릭하고 우물 군데한다. 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
   4. '목표'옵션 드롭 다운에서 2.5 배의 목표를 선택합니다. GFP 469, 525 및 밝은 필드 '채널'탭에서 두 개의 채널을 선택합니다. 두 채널 모두를위한 '자동'노출을 확인하고 잘 자동 노출을 선택합니다.
   5. AUT을 확인하려면오 포커스 설정이 '자동 초점'을 선택하고 '옵션'을 클릭합니다. 자동 초점 옵션의 경우, '다음 자동 초점을 스캔하고'방법을 선택합니다. 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
   6. 설정 수평 및 수평 간격 (μm의) = 2881 및 수직 간격 (μm의) = 2127으로, 3 × 2 몽타주에 잘 당 여러 이미지를 스캔 0.Select하는 것이 아니라 (μm의)의 중심에서 수직 오프셋. 프로 시저 설정을 저장하려면 '확인'을 클릭합니다.
      참고 : 읽기 매개 변수에 대한 표 2를 참조하십시오.
2. 선정 된 플레이트에 대한 읽기 실험을 수행
   1. 뚜껑을 보장하는 것은 켜져의 '장비 제어'탭을 클릭하고 '밖으로 판'function.Place에게 판 홀더 96 웰 플레이트를 선택합니다. '기기 제어'탭에서 함수 '에서 판'를 선택합니다. 선택 판 탭에서 '지금 읽기'. 96 시간의 후 파종 할 때마다 24 시간까지를 읽어 반복합니다.
3. 를 사용하여 세포 수의 분석셀 이미 저 소프트웨어.
   1. 이미지를 분석하기 위해, 이미지화 된 판의 '데이터'탭을 클릭, 선택 '사진 [GFP 469, 525 + 밝은 필드]. 잘 군데 온 두 번 클릭합니다.
   2. 로드 이미지를 클릭하십시오. 선택 '분석'과 몽타주의 단일 이미지 분석을 선택합니다. GFP '를 OK'.Check'클릭 '만 채널 및 표 3에 설명 된대로 설정 매개 변수를. 클릭'이미징 세포 매개 변수를 적용 START '를.
   3. 이미지 당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 이미징 셀 위에 위치하는 셀 카운팅 마스크를 관찰한다. 클릭 실험을하는 동안 몇 군데 각 플레이트에 대해이 설정을 '변경 사항을 적용'을 유지한다.
   4. 일단 다시 이미지화 된 판에, 다운 메뉴에서 '데이터'메뉴를 클릭하고 '세포 수'를 선택합니다. 이것은 물론 당 전체 세포 수를 생성합니다.
   5. 추가 분석 O를위한 '수출'탭을 클릭하여 스프레드 시트에있는 모든 데이터를 내보내기웰 당 세포 수 (F).

결과

배양 된 세포의 증식 - Δ40p53 MCF-7 세포를 형질 도입의 세포 증식을 측정하는 다른 방법을 연구하는 비 형질 MCF-7 레고 유방암 세포주와 비교 하​​였다. 비교 된 세 가지 방법 - 도식에 설명 된 분석 - 종래 방법 혈구 세포 생존력 발광 분석법 및 세포 이미징 (도 1). 각 방법의 장점은 정확하게 시간이 지남에 따라 셀 계수를 측정하는 단점을 가지고 있으며, 가?...

토론

이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) ​​실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5