השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Summary

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Abstract

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introduction

הגן מדכא גידולים, p53, הוא הרגולטור חיוני של מספר תהליכים תאיים, כולל עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס והזדקנות ^1. הוא אחראי על שמירה על יציבות גנומית, ולכן הוא חיוני בשמירה על האיזון של מוות של תאים וצמיחת תא. מוטציות ב- p53 נפוצים סרטן והם הגורם העיקרי של איון p53 המוביל התפשטות תאים סרטניים בלתי מבוקרת ^2. מעניין, מוטציות ב- p53 רק מהווים כ -25% ממקרי סרטן השד ^3, דבר המצביע על כך מנגנונים אחרים אחראים אובדן תפקוד p53. Isoforms p53 גילה לאחרונה הוכח להיות ביטוי יתר במספר סוגים של סרטן אנושי, והוא יכול לווסת p53 פונקצית ^4,5. הראינו בעבר כי איזופורם p53, Δ40p53, הוא איזופורם הביע הגבוהה ביותר בסרטן השד, והוא upregulated משמעותי בתאי סרטן השד, בהשוואה Tiss נורמלי סמוכיםue ^6. בעקבות זאת, אנחנו transduced הקו הסלולרי סרטן השד האנושי ביציבות MCF-7 כדי overexpress Δ40p53 באמצעות לגו-iG2-פורו + וקטור (+ GFP) ^7. תאים אלו שמשו לחקור אם ביטוי Δ40p53 גבוה מגביר את קצב התפשטות תאים בתאי סרטן השד.

ישנן שיטות ישירות ועקיפות רבות של מדידת תא התפשטות של תאים בתרבית במבחנה ^8,9. אלה יכולים להתבצע גם כמו מדידה רציפה לאורך זמן, או מבחני סיום כמו ^10. בשיטות מקובלות עדיין שימושיות, כגון ספירת תאים באמצעות hemocytometer. assay זוהי עלות נמוכה מדידה ישירה של המספר הסלולרי, אבל זה להסתמך על ספירה תאית גדולה אימון מיומן כדי למזער סטיות שגיאת תקן גדול מן הספירות. הצורך לבצע מדידות תואמות פורמטי תפוקה גבוהה הוביל את הפיתוח של מבחני multiwell צלחת. מבחני הארה מבוססת אלה צפחותמחדש מספרים סלולריים המבוססים על אות זורחת כי היא יחסית את הפעילות המטבולית של התא ^11,12. ולאחרונה, את ההקדמה של פלטפורמות הדמיה תכולה גבוהה אפשרה כלים חדשים אשר לנטר התפשטות תאים תוך מתן איסוף נתונים פנוטיפי כמותיים ואיכותיים, וכולל מגוון רחב של מערכות ^13. כל השיטות האלה לספק אפיקים למדוד צמיחת תאים, בין אם על ידי מבחני מדידה או נקודות קצה רציפים, וכל אחד להחזיק מגוון של יתרונות וחסרונות לגבי רגישות, תפוקה של מספרי מדגם, ומידע תא, כל מה שיכול להישקל בהתאם בהתאם על שאלת המחקר.

פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות שונות למדידת התפשטות תאים במבחנה, עם כל שיטת ניצול טווחים שונים של רגישות, שחזור ותבניות צלחת רבה היטב. פרוטוקול זה נועד להשוות את השימוש של צ'ה ספירת hemocytometermber, assay כדאיות התא מבוססי הארה, וכן imager התא, במדידה של התפשטות תאים על פני מהלך הזמן 96 שעות ביממה. לשם כך, את הצמיחה של תאים transduced וקטור (MCF-7-לגו) הושווה תאים transduced כדי overexpress Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), באמצעות שלוש צפיפויות תאים שונים. התפשטות תאים נמדדה כל 24 שעות עד 96 שעות. לכל שיטה נמצאה יש יתרונות וחסרונות משלו, בהתאם מטרת הניסוי, כל עוד הוא שיטה ערך למתן מידע על קצב הפרוליפרציה.

Protocol

1. תאי הכנות לקראת מבחני הפצת נשק

הערה: הכן שתי שורות תאים באותו אופן וזרעי במתכונת זהה עבור כל שיטה כדי להיות מנותח.

1. לגדול MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 ⁷ התאים מפגש 75-80% ב T 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות רקמות באמצעות פנול אדום חינם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) L- גלוטמין, 200 מ"מ, 2 מיקרוגרם / מ"ל ו אינסולין 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2. לטפל בתאים בכיתה ארון biosafety סטרילי השנייה.
   הערה: משך הזמן שנדרש כדי לגדל את תאי המפגש משתנה בהתאם דילול הזריעה. לקראת ציפוי התאים עבור מבחני שגשוג, זרע התאים ב דילול 1: 3 DMEM בתוספת ולתחזק בתנאים צמיחה נורמלית במשך 3 ימים עד 75-80% confluency.
2. כדי להסיר את התאים מהבקבוק, לשפוך את התקשורת לתוךמיכל פסולת. מיד לשטוף את שכבת התאים עם 2 מ"ל של טריפסין 2x מחומם מראש. לשאוב טריפסין. הוסף 2 מיליליטר נוסף של טריפסין מחומם מראש ל שכבת התאים והמקום באינקובטור במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   1. ברגע שהתאים לנתק, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל חימם השלימו טרי DMEM. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל סטרילי ב 491 XG במשך 5 דקות ב RT. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant.
3. Resuspend התא גלול ב 5 מיליליטר של DMEM בתוספת הטריה. בצע ספירת תאים כדי לקבוע את הצפיפות הנכונה זרע התאים 96-גם צלחות.
   1. לדלל 100 μl של ההשעיה תא 900 μl בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS). מניח חיישן 60 מיקרומטר חדש על דלפק התא האוטומטי. החזק את הבוכנה ואת להטביע את חיישן השעית התא המדולל. לאט לשחרר את הבוכנה על דלפק התא. הסר את החיישן מן cou התאnter כאשר הושלם.
      הערה: ספירת תאי יוצג על הדלפק של תאים תאים / מ"ל.
4. תאי זרע בווליום סופי של 100 μl (ב DMEM) בצלחת 96-היטב confluency ~ 20% כדי לאפשר מקום צמיחת תאים ומדידה של התפשטות על פני 3-5 ימים (ראה טבלה 1). זרעים כל שורות תאים בשלושה עותקים.
   הערה: לצורך ניסוי זה, שלוש צפיפויות תאים שונות הוערכו כדי לקבוע את צפיפות התא האופטימלית. המספרים התא נדרש מסוכמים בטבלה 1. תאי זרע בצפיפות נמוכה אם המדידה של צמיחה לטווח ארוך יותר נדרש.
   1. עבור hemocytometer מבחני מבוססי הארה, להכין צלחת אחת לכל נקודת זמן (כלומר 4 צלחות לכל assay). עבור assay תרמי התא, להכין רק צלחת אחת למשך הניסוי.
5. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך 24 שעות.

2. תא קביעת סופרים אותנוing hemocytometer

1. טרום חם הוא בינוני טריפסין עד 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים, תנור או באמבט מים. לשאוב מדיה מתאי לתוך מיכל פסולת, לשטוף פעם אחת עם 30 μl של טריפסין 2x, לשאוב טריפסין.
2. שטפו תאים שוב עם 30 μl של טריפסין 2x, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטפוח בעדינות קץ הצלחת כדי לסלק תאים מן הצלחת. הוסף 50 μl של DMEM בתוספת ומערבבים התאים על ידי pipetting עד שהתאים ליצור ההשעיה תא בודד.
3. כן hemocytometer על ידי ניקוי פני שטח מכסה זכוכית עם 70% אתנול.
4. מניח את המכסה להחליק זכוכית מעל התאי לספור להדביק עד 'הטבעות השבירות של ניוטון' ניתן לראות בין קצות כיסוי החלקים ואת hemocytometer.
   הערה: אלו מעידים כי החלקת הכיסוי דבקה כהלכה hemocytometer.
5. בעדינות פיפטה 20 μl של השעית תא בחסות החלקה, מילוי תא הספירה לפי תנועה נימי.מניחים hemocytometer בהגדלה 10x של מיקרוסקופ ולדמיין לתאי הספירה של פריסת רשת.
6. ספירת תאים ב 4 הריבועים החיצוניים של פריסת הרשת. כדי לשפר את דיוק, ספירות חוזרות של ריבועים חיצוניים נוספים במידת הצורך, או עד לספור יש הגיעו לגיל 70 - 100 תאים ^14,15.
   1. חישוב ריכוז התאים לכל מ"ל כדלקמן: ספירת תאי ממוצע גורם לדילול x מרובע (אם משתמשים בו) x 10 ⁴
7. חזור על שלבי 2.1-2.8 כל 24 שעות למשך 96 שעות שלאחר זריעה.

3. קביעת התפשטות תאים באמצעות Assay הארה מבוססת

הערה: זוהי מדידת סיום. לאחר המגיב מתווסף התאים, הצלחת ניתן לכמת רק פעם אחת.

1. מגיב הארת הפשרה באמבט מי C ° 22 למשך 30 דקות.
2. לערבב בעדינות מגיב על ידי היפוך הבקבוק להשיג תערובת הומוגנית.
3. לאזן צלחת אחת של תאים שנזרעו (משלב1.5) בשעה RT למשך 30 דקות.
4. הוספת 100 μl של מגיב הארה היטב כל אחד. מערבבי תוכן על שייקר מסלולית במשך 2 דקות. אפשר צלחת כדי לדגור במשך 10 דקות ב RT.
5. הגדרת ניסוי הארה באמצעות תוכנת קורא צלחת מצב מרובה.
   1. הפעל קורא צלחת מצב מרובה ולפתוח את התוכנה. ב 'מנהל המשימות', בחר 'ניסויים' ו 'ליצור new'.Select' קובץ 'מסרגל הכלים בצד, ותחת' פרוטוקול 'כרטיסייה, בחר' נוהל ".
   2. בחירה 'גרנייה 96 תחתית שטוחה' סוג הצלחת, וסמן את התיבה 'שימוש מכסה'. בחר פעולה "לקרוא" תחת תיבת "שיטה לקרוא '. 'הארה' בחר שיטת הזיהוי. לחץ על 'אישור'.
   3. בתיבת הדו הצעד לקרוא, בחר את הבארות לסריקה תחת הלשונית "הצלחת המלאה", ובחר בארות לפעול בארות ריקות כמו.
   4. הגדר את המסנן מוגדר מסנן ריק (למשל, תקע, Em: חור, ראי: ללא). קבע את הרווח כדי135, עם זמן אינטגרציה של 0.5 שניות לעמוד היטב לגובה לקרוא של 6.5 מ"מ. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות על לקרוא הארה.
6. ביצוע קריאת פלורסנט
   1. הוצא בעל צלחת על ידי בחירת הכרטיסייה 'מכשיר בקרה' ולחץ על 'צלחת out'.Place צלחת 96-היטב על בעל צלחת, הבטחת המכסה על. סגור את מחזיק צלחת על ידי לחיצה על "הצלחת" הכרטיסייה תחת "מכשיר הבקרה '. לחץ על "לקרוא עכשיו 'מסרגל הכלים לבצע קריאה זורחת.
   2. לייצא יחידת זורח יחסית (RLU) מדידות עבור כל טוב לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
7. חזור על שלבי 3.1-3.6 להקליט התפשטות כל 24 שעות עד 96 שעות לאחר זריעת תאים.

4. קביעת ספירת תאים באמצעות Imager נייד

1. הגדרת ניסוי הדמיה תא באמצעות תוכנת תרמי התא מצב מרובה
   1. הפעל תרמי תא רב-מצבים ה הפתוחהתוכנת דואר.
   2. ב 'מנהל המשימות', בחר בכרטיסייה 'הניסויים' ו 'ליצור new'.On את' 'בסרגל הכלים, לחץ על' קובץ 'כרטיסייה ופתוח' פרוטוקול נוהל "פעולת טמפרטורת הסט 'tab.Select'. גדר חממה 'על' ולהגדיר טמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס, לבדוק 'מחממים' לפני שתמשיך עם תיבה 'לשלב הבא. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות.
   3. בחר פעולה "לקרוא". הקישו על שיטת הזיהוי 'תמונה', בחר 'קצה / התנועתיות" לקרוא סוג וסוג אופטיקה' מסננים '. לחץ על 'OK'.Click ב'כרטיסיית מלאת צלחת' ובחר בארות על הצלחת להיות צלמו. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות.
   4. בחר את המטרה פי 2.5 מן הנפתחת אפשרויות 'מטרות'. תחת לשונית 'הערוצים', בחר בשני ערוצים: GFP 469, 525 ו מואר שדה. בדוק חשיפה 'אוטומטית' עבור שני הערוצים ובחר את-החשיפה אוטומטית גם.
   5. כדי לקבוע AUTo הגדרות פוקוס, בחרו 'פוקוס אוטומטי' ולחצו על 'אפשרויות'. עבור אפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר בשיטת 'לסרוק ולאחר מכן פוקוס אוטומטי'. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות.
   6. הגדר את אופקי ואנכי לקזז ממרכז היטב (מיקרומטר) כדי 0.Select לסרוק מספר רב של תמונות לכל היטב מונטאז 3 x 2, עם מרווח אופקי (מיקרומטר) = 2881 ואת המרווח האנכי (מיקרומטר) = 2,127. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את הגדרות הליך.
      הערה: ראה טבלה 2 עבור פרמטרים לקריאה.
2. ביצוע ניסוי המשך לקרוא פלייט נבחר
   1. לחץ על כרטיסיית 'בקרת מכשיר' ובחר את הצלחת 'צלחת החוצה' function.Place 96-היטב בעל צלחת, הבטחת המכסה על. בכרטיסייה 'בקרת מכשיר', בחר 'הצלחת' פונקציה. בחר "לקרוא עכשיו 'חוצץ צלחת. חזור לקרוא כל 24 שעות עד 96 שעות שלאחר זריעה.
3. ניתוח של ספירת כדוריות שימושCell Imager תוכנה.
   1. כדי לנתח תמונה, לחץ על הכרטיסייה 'הנתונים' על הצלחת ההדמיה, בחר 'תמונה [GFP 469, 525 + מואר שדה]'. לחץ לחיצה כפולה על צלם גם.
   2. לחץ על תמונה טעונה. בחירה 'לנתח' ובחר תמונה אחת של מונטאז להיות מנותחת. לחץ על 'OK'.Check את' GFP 'הערוץ היחיד, ופרמטרים להגדיר כפי שמתואר בטבלה 3. לחץ על' START 'ליישם פרמטרים לתאי הדמיה.
   3. שים את המסכה ספירת תאים ממוקם מעל התאים צילמו, אשר משמש כדי לקבוע את ספירת התאים לכל תמונה. לחץ על "החל שינויים" ולשמור הגדרות אלה עבור כל צלחת צילמו לאורך הניסוי.
   4. לאחר חזרה לעבר הצלחת הדמיה, לחץ על התפריט 'נתונים' הנפתח ובחר "ספירת תאי '. זה יפיק את ספירת תאים הכוללת לכל טוב.
   5. לייצא את כל הנתונים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על הכרטיסייה 'יצוא' עבור o ניתוח נוסףf ספירת תאים לכל טוב.

תוצאות

כדי ללמוד שיטות שונות למדידת ההתפשטות של תאים בתרבית, התפשטות התאים של MCF-7-Δ40p53 transduced תאים הושווה MCF-7-לגו הלא transduced שורת תאי סרטן השד. השלוש השיטות שהושוו - את assay ההארה הקונבנציונלית hemocytometer שיטה, תא כדאיות, והדמית תא אנליזה מתוארת בתרשים סכמטי (אי...

Discussion

בפרוטוקול זה בשלוש שיטות שונות של מדידת התפשטות תאים בתאים בתרבית נבדקו. לכל שיטה הייתה מסוגלת מדידות לשחזור המדויקות של התפשטות תאים מעל 96 שעות, והתוצאות היו דומות בין כל אחת מהשיטות שנבדקו (איור 2 ו -3). הן assay ושיטת הדמית תא מבוסס ההארה הפיקו את התוצאות החזקו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5