Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Özet

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Özet

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Giriş

Tümör bastıncı gen p53, hücre döngüsünün durdurulması, apoptoz ve yaşlanma ¹ de dahil olmak üzere hücresel süreçleri, bir dizi önemli bir düzenleyicidir. Bu genomik stabilite bakımından sorumlu olan, ve bu nedenle, hücre ölümü ve hücre büyümesinin dengesini sağlamak için çok önemlidir. P53 mutasyonlar kanser yaygındır ve kontrolsüz kanseri hücre çoğalması ² giden p53 etkisizleştirme başlıca nedenidir. İlginç bir şekilde, p53 mutasyonlar diğer mekanizmalar p53 fonksiyonunun kaybının sorumlu olduğunu göstermektedir, meme kanserlerinin ³ yaklaşık% 25'ini oluşturmaktadır. En son keşfedilen p53 izoformları insan kanserlerinde bir dizi fazla sentezlendiği gösterilmiştir ve p53 fonksiyonunu ^4,5 modüle edebilirler. P53 izoformu Δ40p53, göğüs kanseri en yüksek şekilde tanımlanan izoform olduğu daha önce gösterilmiştir ve normal komşu Tiss karşılaştırıldığında önemli ölçüde, meme kanseri hücrelerinde yukarı-regüle edildiğiniue ^6. Bunu takiben, stabil bir şekilde LEGO'nun-Ig2-Puro + vektörüne (GFP +) ⁷ kullanarak Δ40p53 aşın sunmak için insan göğüs kanseri hücre çizgisi, MCF-7 kalıt. Bu hücreler yüksek Δ40p53 sentezleme göğüs kanseri hücrelerinin hücre proliferasyonu oranlarını arttırır araştırmak için kullanıldı.

In vitro ^8,9 kültürlenen hücrelerin hücre çoğalmasını ölçmek için bir çok, doğrudan ve dolaylı yöntem vardır. Bu süre boyunca sürekli ölçümleri, veya nokta tahlilleri ¹⁰ olarak da gerçekleştirilebilir. Geleneksel yöntemler, bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı olarak, hala yararlıdır. Bu tahlil düşük maliyetli ve hücre sayısının doğrudan ölçüsüdür, ancak sayıları hata ve geniş standart sapma en aza indirmek için büyük hücre sayımları ve çok yetenekli eğitim güvenmek yok. Yüksek verimli biçimleri ile uyumlu ölçümler yapmak için gerekli çukurlu levha tahlillerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu parlaklık bazlı deneyler measuhücre ^11,12 metabolik aktivitesi ile orantılıdır bir lüminesan sinyal göre hücre sayıları yeniden. Daha yakın zamanlarda, yüksek içerik görüntüleme platformları tanıtımı nicel ve nitel fenotipik veri toplama sağlarken hücre çoğalmasını izlemek yeni araçlar için izin verilen ve sistemlerin ¹³ çeşitli içerir olmuştur. Tüm bu yöntemler sürekli ölçüm ya da bitiş noktası deneyleri yoluyla, hücre büyümesini ölçmek için yollar sağlamak ve her bağlı buna göre tartılır olabilir bütün bunlar duyarlılık açısından, örnek numaraları verimi ve hücre bilgileri ile avantaj ve dezavantajları bir dizi sahip araştırma sorusu üzerine.

Bu protokol, hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve çok-yuvalı plaka formatlarında farklı aralıkları kullanılarak, her yöntem ile, in vitro olarak hücre proliferasyonunu ölçmek için üç farklı yöntem tarif eder. Bu protokol hemositometre sayma cha kullanımını karşılaştırmayı amaçladıkmber, 96 saatlik bir süre boyunca, hücre çoğalmasının ölçülmesi bir lüminesans-bazlı hücre canlılığı deneyi ve hücre görüntüleme. Bunu yapmak için, vektör transduse hücreleri (MCF-7-LEGO'nun) büyüme üç farklı hücre yoğunlukları kullanılarak Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53) aşırı ifade etmek için dönüştürülmüş hücrelere karşılaştırılmıştır. Hücre çoğalması kadar 96 saat boyunca her 24 saatte ölçülmüştür. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları var bulundu ve deney amaca bağlı olarak, her hala çoğalması oranı hakkında bilgi veren değerli bir yöntemdir oldu.

Protokol

Çoğalma Tahliller için hazırlanması 1. Hücreler

Not: her yöntem analiz için aynı biçimde aynı şekilde ve tohum iki hücre çizgileri hazırlamak.

1. T- MCF-7-Lego ve MCF-7-Δ40p53 75 ^cm2 doku kültürü şişeleri 75-80% konfluansa ⁷ hücreleri büyümek kırmızısız fenol,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 ug / ml insülin, ve% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 1 ug / ml Puromisinin. Steril bir biyogüvenlik kabini sınıf II hücreleri anlaştım.
   Not: izdiham hücreleri büyümek için geçen süre tohumlama seyreltme bağlı olarak değişir. Çoğalma denemeleri hücreleri kaplama için hazırlık olarak, 1 hücreleri tohum: takviye edilmiş DMEM içinde 3 seyreltme ve% 75-80 konflüansa kadar 3 gün boyunca normal büyüme koşullarında muhafaza.
2. içine medya dökünüz, şişesi hücreleri çıkarmak içinBir çöp konteyneri. Hemen önceden ısıtılmış 2x tripsin 2 ml hücre tabakası yıkayın. Aspire tripsin. % 5 _CO2 ile 37 ° C de 5 dakika süreyle bir inkübatör hücre tabakası ve yere önceden ısıtılmış tripsin bir 2 ml ilave edilir.
   1. Hücreler ayırmak kez taze DMEM takviye ısıtılan 10 ml hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 491 x g'de, steril bir 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın. Dikkatle aspire ve süpernatant atın.
3. Taze DMEM 5 ml hücre pelletini. 96-delikli plakalardaki hücreler tohum doğru yoğunluğu belirlemek için bir hücre sayımı gerçekleştirin.
   1. 900 ul 1X Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde hücre süspansiyonu 100 ul seyreltilir. otomatik hücre tezgahın üzerine yeni bir 60 mikron sensörünü yerleştirin. pistonu basılı tutun ve seyreltilmiş hücre süspansiyonu sensörü daldırın. Yavaş yavaş hücre tezgahın üzerine pistonu bırakın. Hücre cou gelen sensörünü çıkarınnter Tamamlandığında.
      Not: Hücre sayısı hücre / ml hücre sayacı görüntülenir.
4. % 20 konfluansa ° 'de, bir 96-çukurlu plaka içinde (DMEM), 100 ul'lik bir son hacim tohum hücreleri 3-5 gün (Tablo 1 e bakınız) üzerinden çoğalması, hücre büyümesi ve ölçümü için yer açmak için. üç kez tüm hücre hatları tohumu.
   Not: Bu deney için, üç farklı hücre yoğunlukları en uygun hücre yoğunluğu belirlemek için değerlendirildi. Gerekli hücre sayıları Tablo 1'de özetlenmiştir. Tohum hücreleri düşük yoğunlukta daha uzun vadeli büyüme ölçümü gerekirse.
   1. Hemasitometre ve lüminesans tabanlı deneyleri için, (yani deney başına 4 tabak) zaman noktası başına bir tabak hazırlayın. Hücre görüntüleme deneyi için, deney süresince sadece bir plaka hazırlanması.
5. 24 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de hücreleri korumak.

2. belirlenmesi Hücre Bize güveninHemasitometre ing

1. bir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de önceden sıcak hem de orta ve tripsin, fırında ya da su banyosu. Bir atık kabı içine hücrelerden aspire medya, 2x tripsin 30 ul ile bir kez yıkayın ve tripsin aspire.
2. 2x tripsin 30 ul ile tekrar hücreler yıkanır ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Yavaşça plaka hücreleri çıkarmak için plakanın kenarına dokunun. takviye edilmiş DMEM içinde 50 ul ilave edin ve hücreleri, tek bir hücre süspansiyonu oluşana kadar pipetleme ile hücrelerin karışımı.
3. % 70 etanol ile yüzey ve cam kapağı temizleme hemasitometre hazırlayın.
4. sayma odaları üzerinde cam kapak-slip yerleştirin ve 'Newton kırılma halkaları' kapak kayma kenarları ve hemasitometre arasında görülebilir kadar yapıştırın.
   Not: Bu kapak-slip doğru hemasitometre yapıştırılır işaret etmektedir.
5. Yavaşça kılcal hareketi ile sayma odasını doldurmak, kapak kayma altında hücre süspansiyonu 20 ul pipetle.Bir mikroskop 10x büyütme altında hemasitometre yerleştirin ve ızgara düzeninde sayma odaları görselleştirmek.
6. ızgara düzeni 4 dış meydanlarında hücreleri saymak. Doğruluğu artırmak için ek dış kareler tekrar sayımı gerekli ya da sayısı kadar 70 ulaştıysa - 100 hücre ^14,15.
   1. Aşağıdaki gibi ml başına hücre konsantrasyonunu hesaplayın: kare x seyreltme faktörü başına ortalama hücre sayısını (kullanılıyorsa) 10 ⁴ x
7. Tekrarlayın 2,1-2,8 her 24 saat 96 saat sonrası tohumlama adımları.

3. Lüminesans bazlı analiz kullanılarak hücre çoğalması belirleme

Not: Bu bir bitiş noktası ölçümüdür. Reaktif hücrelere ilave edildikten sonra, levha bir kez belirlenebilir.

1. 30 dakika boyunca 22 ° C su banyosu içinde çözülme lüminesans reajanı.
2. Yavaşça homojen bir karışım elde etmek için şişeyi ters çevirerek reaktifi karıştırın.
3. aşama (tohumlanmış hücrelerin bir plaka dengeye1.5), 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
4. Her bir oyuğa lüminesan reaktif 100 ul ekle. 2 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde içeriği karıştırın. Plaka, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübasyona izin verin.
5. Çok modlu plaka okuyucu yazılımı kullanarak bir parlaklık deney kurma.
   1. Çok modlu plaka okuyucu açın ve yazılımı açın. 'Görev yöneticisi' olarak, 'deney' seçin ve dosya 'new'.Select oluşturmak' 'yan araç çubuğundan ve altında' protokol prosedürü 'sekmesinde,' seçin.
   2. Seç 'Grenier 96 düz dipli' plaka tipi ve 'kullanım kapak' kutusunu işaretleyin. 'Okundu yöntem' kutusunun altında 'okumak' eylemi seçin. 'Lüminesans' algılama yöntemini seçin. 'Tamam' ı tıklatın.
   3. okuma adım kutusunda, 'Tam plakanın' sekmesinin altında taranacak kuyu seçin ve boş kuyu hareket kuyu seçin.
   4. (: Delik, ayna: yok örneğin, fiş, Em) boş filtreye filtre seti ayarlayın. için kazanç ayarlayın135, oyuk başına 0.5 saniyelik bir entegrasyon süresi ve 6.5 mm kadar bir yüksekliğe sahip oku. lüminesans okuma ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
6. Bir Lüminesans Oku Sahne
   1. 'Enstrüman kontrolü' sekmesini seçerek plaka tutucu çıkarın ve 'kapağı sağlamaya, plaka sahibinin üzerine 96-plaka out'.Place plaka üzerine tıklayın. altında 'araç kontrolü' sekmesinin plaka 'tıklayarak plaka yuvasını kapatın. Işıklı okuma gerçekleştirmek için araç çubuğundan 'şimdi okuma' üzerine tıklayın.
   2. iyi daha fazla analiz için bir elektronik tabloya her biri için nispi Işıklı birimi (RLU) ölçümleri ihracat.
7. Tekrarlayın hücrelerin ekim sonra yayılması 96 saat her 24 saat kadar kaydetmek için 3.1-3.6 adımları tekrarlayın.

4. Hücre Imager Kullanımı Cep Sayısı belirlenmesi

1. Çok modlu hücre görüntüleyici yazılımı kullanarak bir hücre görüntüleme deney kurma
   1. Çok modlu hücre kamera ve açık th açıne yazılımı.
   2. 'Görev yöneticisi' olarak, 'deneyleri' sekmesini seçin ve 'araç çubuğunu tıklayın' dosyasını 'new'.On oluşturmak' protokol 'sekmesini ve açık' prosedürü 'tab.Select' ayarlanan sıcaklık 'eylem. 'Açık' için inkübatör ayarlayın ve 37 ° C sıcaklığı ayarlamak ve bir sonraki adım 'kutu ile devam etmeden önce' ön ısıtma 'kontrol edin. Ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
   3. 'Okumak' eylemi seçin. , 'Image' algılama yöntemine tıklayın 'son nokta / kinetik' okuma türünü ve 'filtreleri' optik türünü seçin. plaka üzerinde tam plaka 'sekmesinin üzerine OK'.Click' tıklayın ve kuyu yansıması. Ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
   4. 'Amaç' seçenekler açılır menüden 2.5X hedefi seçin. GFP 469, 525 ve Parlak Field: 'kanalların sekmesinin altında, iki kanal seçin. Her iki kanal için 'otomatik' pozlama kontrol edin ve iyice otomatik pozlama seçin.
   5. aut belirlemeko odak ayarları, 'otomatik odaklama' seçin ve 'seçenekleri' üzerine tıklayın. otomatik odaklama seçenekleri için, 'o zaman otomatik odak tarama ve' yöntemini seçin. Ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
   6. Set yatay ve dikey aralığı (um) = 2.881 ve dikey aralık (mikron) = 2.127 ile 3 x 2 montajda kuyu başına birden fazla görüntüleri taramak için 0.Select iyi (um) merkezinden ofset dikey. Prosedür ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
      Not: Okuma parametreleri için Tablo 2'ye bakınız.
2. Seçilen Plate Oku Deneme Sahne
   1. Kapağı sağlanması üzerinde, 'araç kontrolü' sekmesine tıklayın ve 'plaka dışarı' function.Place plaka tutucuya 96-plaka seçin. 'Enstrüman kontrolü' sekmesi altında, fonksiyon 'plaka' seçin. Seçin plaka sekmesinden 'şimdi okuma'. 96 saat sonrası tohumlama için her 24 saat kadar okumak tekrarlayın.
3. Kullanımı Cep Kont AnaliziHücre Görüntüleyici Yazılımı.
   1. Bir görüntüyü analiz etmek, görüntülü plaka üzerinde 'veri' sekmesine tıklayın, seçin 'resim [GFP 469, 525 + Aydınlık alan]'. iyi görüntülü bir çift tıklayın.
   2. Yüklenen bir resmin üzerine tıklayın. Seç 'analiz' ve montajı tek bir görüntü analiz edilecek seçin. GFP 'OK'.Check' Click 'sadece kanal ve Tablo 3'te belirtilen olarak ayarlanmış parametreler. Click' görüntülü hücrelere parametreleri uygulamak için BAŞLAT '.
   3. görüntü başına hücre sayımı belirlemek için kullanılır görüntülü hücrelerin üzerine yerleştirilen hücre sayım maskesi, gözlemleyin. Click Deney boyunca görüntülenmiş her plaka için bu ayarları 'değişiklikleri uygulamak' ve korumak.
   4. Bir kez geri görüntülü plaka, açılan menüden 'veri' damla tıklayın ve 'hücre sayımı' seçeneğini seçin. Bu kuyu başına toplam hücre sayısını oluşturur.
   5. daha fazla analiz için o 'ihracat' sekmesini tıklayarak bir elektronik tabloya tüm veri ihracatoyuk başına hücre sayımı f.

Sonuçlar

kültürlenmiş hücrelerin çoğalmasını,-Δ40p53 MCF-7 hücrelerinin transduse hücre proliferasyon ölçüm farklı yöntemler incelenmesi transdüksiyona MCF-7-LEGO'nun Meme kanseri hücre dizisi ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırıldı üç yöntem - şematik diyagramda özetlenen analizi-alışılmış hemositometre yöntem olup, hücre canlılığı, lüminesans deneyi ve hücre görüntüleme (Şekil 1). Her yöntemin avantajları ve doğru za...

Tartışmalar

Bu protokol, kültürlenmiş hücrelerde hücre çoğalmasını ölçmek için üç farklı yöntem incelenmiştir. Her yöntem 96 saat boyunca hücre çoğalmasının tekrarlanabilir ve hassas ölçümler yeteneğine sahip olduğunu ve sonuçlar (Şekil 2 ve 3) test edilen yöntemlerin her karşılaştırılabilirdir. Lüminesans bazlı analiz ve hücre görüntüleme yöntemi Hem 96 saat sonra, hücre çoğalmasında lineer artış gösteren, en güçlü sonuç (Şekil 2B, C)....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5