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Method Article
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Der Tumor - Suppressor - Gen, p53, ist ein wesentlicher Regulator von einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 1. Es ist verantwortlich für genomische Stabilität beibehalten wird, und ist daher von entscheidender Bedeutung, das Gleichgewicht von Zelltod und Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Mutationen in p53 sind häufig in Krebs und sind die Hauptursache der p53 - Inaktivierung zu unkontrollierter Zellproliferation Krebs führenden 2. Interessanterweise p53 - Mutationen in machen nur etwa 25% der Brustkrebse 3, was vermuten lässt , dass andere Mechanismen für den Verlust der p53 - Funktion verantwortlich sind. Die kürzlich entdeckten p53 - Isoformen wurden in einer Reihe von menschlichen Krebsarten überexprimiert gezeigt zu werden, und kann p53 - Funktion 4,5 modulieren. Wir haben gezeigt, dass die zuvor p53 Isoform, Δ40p53, ist die stark exprimiert Isoform bei Brustkrebs und deutlich in Brustkrebszellen hochreguliert wird, wenn in den normalen benachbarten tiss verglichenue 6. Im Anschluss daran transduzierten wir stabil den menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7 Δ40p53 mit dem lego-iG2-puro + Vektor (GFP +) 7 überexprimiert. Diese Zellen wurden verwendet, um zu untersuchen, ob hohe Δ40p53 Ausdruck erhöht die Zellproliferationsraten in Brustkrebszellen.
Es gibt viele direkte und indirekte Methoden der Zellproliferation von kultivierten Zellen in vitro 8,9 gemessen wird . Diese können entweder als kontinuierliche Messungen über die Zeit durchgeführt werden, oder als Endpunkt - Assays 10. Herkömmliche Verfahren sind immer noch nützlich, wie beispielsweise Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieser Assay ist eine kostengünstige und direktes Maß für die Zellzahl, es gibt aber verlassen sich auf große Zellzahlen und hoch qualifizierten Trainingsfehler und großen Standardabweichungen von den Zählungen zu minimieren. Die Notwendigkeit, die Messungen durchführen kompatibel mit Hochdurchsatz-Format hat zur Entwicklung von Multi-Well-Platte-Assays führte. Diese Lumineszenz-basierten Assays Measure Zellzahlen auf einem Leuchtsignal basiert, die auf die Stoffwechselaktivität der Zelle 11,12 proportional ist. In jüngerer Zeit hat die Einführung von hohen Gehalt Bildgebungsplattformen für neue Werkzeuge erlaubt , die Zellproliferation zu überwachen , während quantitative und qualitative phänotypischen Datenerfassung, und enthält eine Vielzahl von Systemen 13. Alle diese Verfahren bieten Wege Zellwachstum entweder durch kontinuierliche Messung oder Endpunktassays und besitzen jeweils eine Reihe von Vor- und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, den Durchsatz von Musternummern und Zelleninformation, welche alle entsprechend abgewogen werden je kann zu messen auf die Forschungsfrage.
Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation in vitro, wobei jedes Verfahren verschiedene Bereiche der Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Multi-Well - Plattenformate verwendet. Dieses Protokoll zum Ziel, die Verwendung eines Hämocytometer Zählen cha zu vergleichenmber eine Lumineszenz basierenden Zelllebensfähigkeitstest und Zell Imager, in der Messung der Zellproliferation über einen Zeitverlauf 96 Stunden. Dazu wurde das Wachstum von Vektor-transduzierten Zellen (MCF-7-LeGo) im Vergleich zu Zellen transduziert zu überexprimieren Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), drei unterschiedliche Zelldichten verwenden. Zellproliferation wurde alle 24 Stunden gemessen, bis zu 96 Stunden. Jede Methode wurde gefunden, seine eigenen Vorteile und Nachteile haben, und je nach dem Ziel des Experiments jeweils noch eine wertvolle Methode für Informationen über die Proliferationsrate bereitstellt.
1. Vorbereiten Zellen für Proliferationsassays
Hinweis: Vorbereiten der zwei Zelllinien in der gleichen Weise und Saatgut in demselben Format für jede Methode analysiert werden.
2. Festlegung der Zellzahl Using einem Hämocytometer
3. Bestimmung der Zellproliferation eine Lumineszenz-basierten Assay unter Verwendung von
Anmerkung: Dies ist eine Endpunktmessung. Sobald das Reagens zu den Zellen gegeben wird, kann die Platte nur einmal quantifiziert werden.
4. Bestimmung Zellzahl unter Verwendung eines Zell-Imager
Zur Untersuchung der verschiedenen Methoden, die Proliferation von kultivierten Zellen zu messen, die Zellproliferation von MCF-7-Zellen transduziert Δ40p53 wurde im Vergleich zu den nicht-transduzierten MCF-7-LeGo Brustkrebszelllinie. Die drei Verfahren , die verglichen wurden , - das herkömmliche Verfahren Hämozytometer, die Lebensfähigkeit der Zellen Lumineszenz - Assay und Zellabbildungs Auswertung- in der schematischen Darstellung (Abbildung 1) beschrieben...
In diesem Protokoll drei verschiedene Methoden der Zellproliferation in kultivierten Zellen Messung untersucht. Jede Methode der Lage war, reproduzierbare und genaue Messungen der Zellproliferation über 96 h, und die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen jedem der Verfahren getestet (Abbildung 2 und 3). Sowohl die Lumineszenz basierenden Assays und Zellbildgebungsverfahren erzeugt die robusteste Ergebnisse, linearen Anstieg der Zellproliferation nach 96 h zeigt , (2b, c).
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
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