Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Zusammenfassung

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Zusammenfassung

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Einleitung

Der Tumor - Suppressor - Gen, p53, ist ein wesentlicher Regulator von einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz ^1. Es ist verantwortlich für genomische Stabilität beibehalten wird, und ist daher von entscheidender Bedeutung, das Gleichgewicht von Zelltod und Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Mutationen in p53 sind häufig in Krebs und sind die Hauptursache der p53 - Inaktivierung zu unkontrollierter Zellproliferation Krebs führenden ^2. Interessanterweise p53 - Mutationen in machen nur etwa 25% der Brustkrebse ^3, was vermuten lässt , dass andere Mechanismen für den Verlust der p53 - Funktion verantwortlich sind. Die kürzlich entdeckten p53 - Isoformen wurden in einer Reihe von menschlichen Krebsarten überexprimiert gezeigt zu werden, und kann p53 - Funktion ^4,5 modulieren. Wir haben gezeigt, dass die zuvor p53 Isoform, Δ40p53, ist die stark exprimiert Isoform bei Brustkrebs und deutlich in Brustkrebszellen hochreguliert wird, wenn in den normalen benachbarten tiss verglichenue ^6. Im Anschluss daran transduzierten wir stabil den menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7 Δ40p53 mit dem lego-iG2-puro + Vektor (GFP +) ⁷ überexprimiert. Diese Zellen wurden verwendet, um zu untersuchen, ob hohe Δ40p53 Ausdruck erhöht die Zellproliferationsraten in Brustkrebszellen.

Es gibt viele direkte und indirekte Methoden der Zellproliferation von kultivierten Zellen in vitro ^8,9 gemessen wird . Diese können entweder als kontinuierliche Messungen über die Zeit durchgeführt werden, oder als Endpunkt - Assays ^10. Herkömmliche Verfahren sind immer noch nützlich, wie beispielsweise Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieser Assay ist eine kostengünstige und direktes Maß für die Zellzahl, es gibt aber verlassen sich auf große Zellzahlen und hoch qualifizierten Trainingsfehler und großen Standardabweichungen von den Zählungen zu minimieren. Die Notwendigkeit, die Messungen durchführen kompatibel mit Hochdurchsatz-Format hat zur Entwicklung von Multi-Well-Platte-Assays führte. Diese Lumineszenz-basierten Assays Measure Zellzahlen auf einem Leuchtsignal basiert, die auf die Stoffwechselaktivität der Zelle ^11,12 proportional ist. In jüngerer Zeit hat die Einführung von hohen Gehalt Bildgebungsplattformen für neue Werkzeuge erlaubt , die Zellproliferation zu überwachen , während quantitative und qualitative phänotypischen Datenerfassung, und enthält eine Vielzahl von Systemen ^13. Alle diese Verfahren bieten Wege Zellwachstum entweder durch kontinuierliche Messung oder Endpunktassays und besitzen jeweils eine Reihe von Vor- und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, den Durchsatz von Musternummern und Zelleninformation, welche alle entsprechend abgewogen werden je kann zu messen auf die Forschungsfrage.

Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation in vitro, wobei jedes Verfahren verschiedene Bereiche der Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Multi-Well - Plattenformate verwendet. Dieses Protokoll zum Ziel, die Verwendung eines Hämocytometer Zählen cha zu vergleichenmber eine Lumineszenz basierenden Zelllebensfähigkeitstest und Zell Imager, in der Messung der Zellproliferation über einen Zeitverlauf 96 Stunden. Dazu wurde das Wachstum von Vektor-transduzierten Zellen (MCF-7-LeGo) im Vergleich zu Zellen transduziert zu überexprimieren Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), drei unterschiedliche Zelldichten verwenden. Zellproliferation wurde alle 24 Stunden gemessen, bis zu 96 Stunden. Jede Methode wurde gefunden, seine eigenen Vorteile und Nachteile haben, und je nach dem Ziel des Experiments jeweils noch eine wertvolle Methode für Informationen über die Proliferationsrate bereitstellt.

Protokoll

1. Vorbereiten Zellen für Proliferationsassays

Hinweis: Vorbereiten der zwei Zelllinien in der gleichen Weise und Saatgut in demselben Format für jede Methode analysiert werden.

1. Wachsen MCF-7-lego und MCF-7-Δ40p53 ⁷ - Zellen zu 75-80% Konfluenz in T 75 cm ² Gewebekulturflaschen mit Phenolrot-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 200 mM L-Glutamin, 2 & mgr; g / ml Insulin und 1 & mgr; g / ml Puromycin bei 37 ° C mit 5% CO _2. Behandeln Sie Zellen in einem sterilen Biosicherheitsschrank Klasse II.
   Anmerkung: Die Menge der Zeit es braucht, um die Zellen zu Konfluenz wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung. In Vorbereitung für die Plattierung der Zellen für die Proliferationsassays, Samen, die Zellen in einer 1: 3-Verdünnung in DMEM, ergänzt und in normalen Wachstumsbedingungen für 3 Tage, bis 75-80% Konfluenz erhalten.
2. Um die Zellen aus dem Kolben zu entfernen, abgießen, die Medien ineinen Abfallbehälter. Ab sofort waschen Sie die Zellschicht mit 2 ml vorgewärmten 2x Trypsin. Absaugen Trypsin. Fügen eine weitere 2 ml vorgewärmtes Trypsin zu der Zellschicht und in einen Inkubator für 5 min bei 37 ° C mit 5% CO _2.
   1. Sobald die Zellen lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml erwärmter frisches DMEM ergänzt. Übertragen die Zellsuspension in ein steriles 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 491 g für 5 min bei RT. vorsichtig absaugen und entsorgen Überstand.
3. Zellpellet in 5 ml frischem ergänzten DMEM. Durchführen einer Zellzahl die richtige Dichte zu bestimmen, die Zellen in 96-Well-Platten auf Saatgut.
   1. Verdünnte 100 ul der Zellsuspension in 900 ul 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). Legen Sie eine neue 60 & mgr; m-Sensor auf der automatisierten Zellzähler. Halten Sie den Kolben nach unten und tauchen Sie den Sensor in der verdünnten Zellsuspension. Geben Sie langsam den Kolben auf der Zellzähler. Entfernen Sie den Sensor aus der Zelle counter wenn sie abgeschlossen sind.
      Anmerkung: Die Zellzahl wird auf der Zellzähler in Zellen / ml angezeigt.
4. Samenzellen in einem Endvolumen von 100 & mgr; l (in DMEM) in einer 96-Well - Platte bei ~ 20% Konfluenz zu ermöglichen Raum für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über 3-5 Tage (siehe Tabelle 1). Samen alle Zelllinien in dreifacher Ausfertigung.
   Hinweis: Bei diesem Experiment wurden drei verschiedene Zelldichten beurteilt die optimale Zelldichte zu bestimmen. Die erforderlichen Zellzahlen sind in Tabelle 1. Seed - Zellen mit einer geringeren Dichte , wenn die Messung von mehr langfristiges Wachstum zusammengefasst erforderlich.
   1. Für die Hämozytometer und Lumineszenz-basierten Assays, bereiten eine Platte pro Zeitpunkt (dh 4 Platten pro Test). Für die Zell Imager Assay vorbereitet nur eine Platte für die Dauer des Experiments.
5. Pflegen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 24 Std.

2. Festlegung der Zellzahl Using einem Hämocytometer

1. Vorwärmen sowohl mittlere als auch Trypsin bis 37 ° C in einer Zellkultur-Inkubator, Ofen oder Wasserbad. Aspirat Medien von Zellen in einen Abfallbehälter, wäscht einmal mit 30 ul 2x Trypsin und Trypsin die anzusaugen.
2. Wash-Zellen wieder mit 30 ul 2x Trypsin und Inkubation für 5 Minuten bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht Rand der Platte Zellen von der Platte zu entfernen. Zugabe von 50 & mgr; l DMEM, ergänzt und mischen Zellen durch Pipettieren, bis die Zellen eine Einzelzellsuspension zu bilden.
3. Bereiten Sie Hemocytometer durch Oberfläche und Glasabdeckung mit 70% Ethanol reinigen.
4. Legen Sie die Glasdeckglas über Zählkammern und bringen bis "Newtons Refraktion Ringe" werden kann zwischen den Deckglaskanten und der Hemocytometer gesehen.
   Hinweis: Diese zeigen an, dass das Deckglas richtig an den Hemocytometer eingehalten hat.
5. Pipette vorsichtig 20 & mgr; l der Zellsuspension unter dem Deckglas, durch kapillare Bewegung der Zählkammer füllt.Legen Sie Hämozytometer unter 10-facher Vergrößerung eines Mikroskops und visualisieren die Zählkammern im Grid-Layout.
6. Zählen von Zellen in den vier äußeren Plätzen der Grid-Layout. Zur Verbesserung der Genauigkeit, die Anzahl der Wiederholungen von zusätzlichen äußeren Quadrate , falls erforderlich, oder bis der Zählwert hat 70 erreicht - 100 Zellen ^14,15.
   1. Berechnen Zellkonzentration pro ml wie folgt: Durchschnittliche Zellzahl pro x Verdünnungsfaktor Quadrat (falls verwendet) x 10 ⁴
7. Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,8 alle 24 Stunden für 96 Stunden nach der Aussaat.

3. Bestimmung der Zellproliferation eine Lumineszenz-basierten Assay unter Verwendung von

Anmerkung: Dies ist eine Endpunktmessung. Sobald das Reagens zu den Zellen gegeben wird, kann die Platte nur einmal quantifiziert werden.

1. Auftau Lumineszenzreagenz in einem 22 ° C Wasserbad für 30 min.
2. Vorsichtig mischen Reagenz durch die Flasche Umkehren um eine homogene Mischung zu erhalten.
3. Äquilibrieren einer Platte gesäten Zellen (aus Schritt1.5) bei RT für 30 min.
4. Füge 100 & mgr; l Lumineszenzreagenz zu jeder Vertiefung. Mischungs Inhalt auf einem Orbitalschüttler für 2 min. Lassen Sie Platte für 10 min bei RT inkubiert.
5. ein Lumineszenz-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Plattenleser Software einrichten.
   1. Schalten Sie Multi-Mode-Plattenlesegerät und öffnen Sie die Software. In der "Task-Manager", wählen Sie "Experimente" und Datei "von Seite Symbolleiste, und unter" Protokoll "Registerkarte, wählen Sie 'Verfahren' 'new'.Select schaffen'.
   2. Wählen Sie 'Grenier 96 Flachboden' Plattentyp, und überprüfen Sie die "Verwendung Deckel" Box. Wählen Sie "lesen" Aktion unter "Leseverfahren" ein. Wählen Sie 'Lumineszenz' Nachweisverfahren. Klicken Sie auf "OK".
   3. Im Schritt Feld zu lesen, wählen Sie die Vertiefungen unter der "vollen Teller 'Tab gescannt werden, und wählen Sie Brunnen als leere Brunnen zu handeln.
   4. Stellen Sie den Filter auf leeren Filter (zB Stecker, Em: Loch, Spiegel: keine). Stellen Sie die Verstärkung135, mit einer Integrationszeit von 0,5 sec pro Vertiefung und eine Lese Höhe von 6,5 mm. Klicken Sie auf "OK" Einstellungen für die Lumineszenz Lese zu speichern.
6. Durchführen eines lumineszenten lesen
   1. Auswurfplattenhalter von "Gerätesteuerung" Auswahl der Registerkarte, und klicken Sie auf 'Teller out'.Place 96-Well-Platte auf den Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Schließen Sie den Plattenhalter durch einen Klick auf "Platte in" unter "Gerätesteuerung" Tab. Klicken Sie auf "jetzt" in der Symbolleiste Leuchtlese auszuführen.
   2. Exportieren Sie die relativen Leuchteinheit (RLE) Messungen für jede Vertiefung in eine Tabelle für die weitere Analyse.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 Proliferation alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach dem Aussäen Zellen aufzuzeichnen.

4. Bestimmung Zellzahl unter Verwendung eines Zell-Imager

1. Einrichten eines Cell-Imaging-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Zelle Imager Software
   1. Schalten Sie Multi-Mode-Zelle-Imager und offen the Software.
   2. In der "Task-Manager", wählen Sie "Experimente" Tab und "erstellen new'.On 'Datei' Symbolleiste, klicken Sie auf" Protokoll "Registerkarte und offene" Verfahren "tab.Select" Soll-Temperatur "Aktion. Set Inkubator 'auf' und setzen die Temperatur auf 37 ° C und prüfen 'vorwärmen', bevor mit dem nächsten Schritt "Box weiter. Klicken Sie auf "OK" die Einstellungen zu speichern.
   3. Wählen Sie "lesen" Aktion. Klicken Sie auf "Bild" Erkennungsmethode, wählen Sie 'Endpunkt / kinetische' lesen Art und 'Filter' Optik-Typ. Klicken Sie auf "OK'.Click auf" Vollplatte "Menü und wählen Sie Vertiefungen auf der Platte abgebildet werden. Klicken Sie auf "OK", um die Einstellungen zu speichern.
   4. Wählen Sie das 2.5X Ziel aus dem Dropdown "Ziele" Optionen. Unter Registerkarte "Kanäle", wählen Sie zwei Kanäle: GFP 469, 525 und dem Hellfeld. Überprüfen Sie 'auto' Belichtung für beide Kanäle und wählen Sie die automatische Belichtung gut.
   5. Um zu bestimmen, auto Fokuseinstellungen, wählen Sie "Autofokus" und klicken Sie auf "Optionen". Für die Autofokus-Optionen, wählen Sie die "Scan und dann Autofokus" -Methode. Klicken Sie auf "OK" die Einstellungen zu speichern.
   6. Stellen Sie die horizontalen und vertikalen Versatz von der Mitte des gut (um) bis 0.Select mehrere Bilder pro Vertiefung in einem 3 x 2 Montage, mit horizontalen Abstand (um) = 2881 und vertikalen Abstand (um) = 2127 zu scannen. Klicken Sie auf "OK" -Verfahren Einstellungen zu speichern.
      Hinweis: Siehe Tabelle 2 für den Leseparameter.
2. Performing lesen Experiment zu ausgewählten Platte
   1. Klicken Sie auf "Gerätesteuerung" Menü und wählen Sie die "plate out" function.Place 96-Well-Platte in Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Unter der Registerkarte "Gerätesteuerung", wählen Sie die "Platte in" Funktion. Wählen Sie "jetzt" von der Platte Registerkarte. Wiederholen Sie alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach der Aussaat lesen.
3. Die Analyse der Zellzahl unter Verwendung derHandy Imager Software.
   1. Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf den "Daten" auf die Registerkarte bebilderte Platte, wählen Sie 'Bild [GFP 469, 525 + Hellfeld]'. Klicken Sie doppelt auf ein gut abgebildet.
   2. Klicken Sie auf ein geladenes Bild. Wählen Sie "analysieren" und wählen Sie ein einzelnes Bild der Montage analysiert werden. Klicken Sie auf "OK'.Check die" GFP "Kanal nur, und Parameter wie in Tabelle 3 dargestellt. Klicken Sie auf" START "Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden.
   3. Beobachten der Zellzählung Maske über den abgebildeten Zellen gegeben, die verwendet wird, um die Zellzahl pro Bild zu bestimmen. Klicken Sie auf "Änderungen übernehmen" und halten Sie diese Einstellungen für jede Platte während des gesamten Experiments abgebildet.
   4. Wieder zurück auf der bebilderte Platte, klicken Sie auf den Drop 'data' down-Menü und wählen Sie "Zellzahl". Dadurch wird die Gesamtzellzahl pro Vertiefung erzeugen.
   5. Exportieren Sie alle Daten in eine Tabelle auf der "Export" Register für die weitere Analyse o durch einen Klickf die Zellzahl pro Vertiefung.

Ergebnisse

Zur Untersuchung der verschiedenen Methoden, die Proliferation von kultivierten Zellen zu messen, die Zellproliferation von MCF-7-Zellen transduziert Δ40p53 wurde im Vergleich zu den nicht-transduzierten MCF-7-LeGo Brustkrebszelllinie. Die drei Verfahren , die verglichen wurden , - das herkömmliche Verfahren Hämozytometer, die Lebensfähigkeit der Zellen Lumineszenz - Assay und Zellabbildungs ​​Auswertung- in der schematischen Darstellung (Abbildung 1) beschrieben...

Diskussion

In diesem Protokoll drei verschiedene Methoden der Zellproliferation in kultivierten Zellen Messung untersucht. Jede Methode der Lage war, reproduzierbare und genaue Messungen der Zellproliferation über 96 h, und die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen jedem der Verfahren getestet (Abbildung 2 und 3). Sowohl die Lumineszenz basierenden Assays und Zellbildgebungsverfahren erzeugt die robusteste Ergebnisse, linearen Anstieg der Zellproliferation nach 96 h zeigt , (2b, c).

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5