Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Resumo

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Resumo

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introdução

O gene supressor do tumor, p53, é um regulador essencial de um número de processos celulares, incluindo a paragem do ciclo celular, apoptose e senescência ^1. Ela é responsável pela manutenção da estabilidade genómica, e é, portanto, crucial para manter o equilíbrio de morte celular e o crescimento celular. As mutações em p53 são comuns no cancro e são a principal causa de inactivação de p53 que conduz à proliferação descontrolada de células de cancro ^2. Curiosamente, as mutações em p53 representam apenas cerca de 25% dos cancros da mama ^3, sugerindo que outros mecanismos são responsáveis ​​pela perda de função de p53. As isoformas p53 recentemente descobertos têm sido mostrados para ser sobre-expresso num certo número de cancros humanos, e são capazes de modular a função de p53 ^4,5. Nós mostramos anteriormente que a isoforma p53, Δ40p53, é a isoforma mais altamente expresso em cancro da mama, e é significativamente regulada positivamente em células de cancro da mama, quando comparado com tiss normal adjacenteue ^6. Após isso, transduzida de forma estável a linha de células do cancro da mama humano MCF-7 para sobre-expressar Δ40p53 usando o LEGO-IG2-Puro + vector (GFP +) ^7. Estas células foram utilizadas para investigar se a expressão elevada Δ40p53 aumenta as taxas de proliferação celular em células de cancro da mama.

Existem muitos métodos diretos e indiretos de medição da proliferação celular de células cultivadas in vitro ^8,9. Estes podem ser realizadas tanto como medições contínuas ao longo do tempo, ou como ensaios de ponto final ^10. Os métodos convencionais são ainda úteis, tais como contagem de células utilizando um hemocitómetro. Este ensaio é um baixo custo e medida direta do número de células, mas não contam com grandes contagens de células e formação altamente qualificada para minimizar desvios de erro e um grande padrão de as contagens. A necessidade de se realizar medidas compatíveis com os formatos de alto rendimento tem levado ao desenvolvimento de ensaios com vários poços de placa. Estes ensaios baseados em luminescência measure número de células com base em um sinal luminescente que é proporcional à actividade metabólica da célula ^11,12. Mais recentemente, a introdução de plataformas de imagem de alta conteúdo tem permitido novas ferramentas que monitoram a proliferação de células, proporcionando a coleta de dados fenotípicos quantitativa e qualitativa, e inclui uma variedade de sistemas ^13. Todos estes métodos fornecem avenidas para medir o crescimento celular, quer por ensaios de medição ou de ponto de extremidade contínuas, e cada um possui uma série de vantagens e desvantagens no que diz respeito à sensibilidade, taxa de transferência dos dados da amostra, e informações de célula, todas as quais podem ser ponderados em conformidade dependendo sobre a questão de pesquisa.

Este protocolo descreve três métodos diferentes para medir a proliferação celular in vitro, com cada método utilizando diferentes gamas de sensibilidade, reprodutibilidade e formatos de placas multi-poços. Este protocolo teve como objetivo comparar a utilização de um cha hemocit�etro contagemmber, um ensaio de luminescência à base de viabilidade celular, e gerador de imagens de células, na medição da proliferação de células ao longo de um curso de tempo de 96 horas. Para fazer isso, o crescimento de células transduzidas por vetores (MCF-7-LEGO) foi comparada com as células transduzidas para sobre-expressar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando três diferentes densidades celulares. A proliferação celular foi medida a cada 24 h durante até 96 h. Cada método verificou-se ter as suas próprias vantagens e desvantagens, e, dependendo do objectivo da experiência, cada um ainda é um método valioso para fornecer informação sobre a taxa de proliferação.

Protocolo

1. Células Preparação para a proliferação Ensaios

Nota: Preparar as duas linhas celulares do mesmo modo e sementes no mesmo formato para cada método a ser analisado.

1. Crescer células MCF-7 e MCF-LEGO-7-Δ40p53 ⁷ células a 75-80% de confluência em T de 75 cm ² frascos de cultura de tecidos utilizando fenol-vermelho livre de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) , 200 mM de L-glutamina, 2 ug / ml de insulina e 1 ug / ml de puromicina a 37 ° C com 5% de CO _2. Lidar com células em uma biossegurança estéril classe gabinete II.
   Nota: A quantidade de tempo que leva para crescer as células até à confluência varia dependendo da diluição semeadura. Na preparação para o plaqueamento das células para os ensaios de proliferação, as células de semente a uma diluição de 1: 3 em meio DMEM suplementado e manter em condições normais de crescimento durante 3 dias, até 75-80% de confluência.
2. Para remover as células do frasco, deitar fora os meios de comunicação emum recipiente de resíduos. Imediatamente lavar a camada de células com 2 ml de tripsina 2x pré-aquecido. Aspirar tripsina. Adicionar mais 2 ml de tripsina pré-aquecido para a camada de células e colocar numa incubadora durante 5 min a 37 ° C com 5% de CO _2.
   1. Uma vez que as células de separar, lavar as células com 10 ml de DMEM fresco suplementado aquecido. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 491 xg durante 5 min à TA. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
3. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de DMEM suplementado fresco. Executar uma contagem de células para determinar a densidade correcta para propagar as células em placas de 96 poços.
   1. Dilui-se 100 ul da suspensão de células em 900 ul de 1x Dulbecco salina tamponada com fosfato (DPBS). Coloque um novo sensor de 60 mm para o contador de células automatizado. Segurar o êmbolo para baixo e submergir o sensor na suspensão diluída de células. Lentamente, liberte o êmbolo no balcão da célula. Remova o sensor do cou celularnter quando concluído.
      Nota: A contagem das células será exibida no contador de células em células / ml.
4. Semear as células em um volume final de 100 ul de DMEM (em) numa placa de 96 cavidades, com ~ 20% de confluência para permitir espaço para o crescimento de células e a medição da proliferação ao longo de 3-5 dias (ver Tabela 1). Semente todas as linhas de células em triplicado.
   Nota: Para esta experiência, três densidades celulares diferentes foram avaliados para determinar a densidade celular ideal. Os números de células necessários encontram-se resumidos na Tabela 1. Semear as células a uma densidade mais baixa, se é necessária a medição de crescimento mais longo prazo.
   1. Para o hemocitómetro e ensaios à base de luminescência, preparar uma placa por ponto de tempo (isto é, 4 placas por ensaio). Para o ensaio de células Imager, preparar uma única placa para a duração da experiência.
5. Manter as células a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 24 horas.

2. Determinar celular Contagem Using um hemocitômetro

1. Pré-aquecido tanto médio e tripsina a 37 ° C numa incubadora de cultura de células, forno ou banho-maria. media aspirado de células em um recipiente de resíduos, lave uma vez com 30 mL de tripsina 2x, e aspire a tripsina.
2. Lave as células mais uma vez com 30 ul de tripsina 2x, e incubar durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente borda da placa para desalojar as células da placa. Adicionar 50 ul de DMEM suplementado e misturar as células por pipetagem até que as células formam uma suspensão de célula única.
3. Prepare hemocitômetro por superfície e tampa de vidro limpeza com etanol 70%.
4. Coloque a tampa do deslizamento de vidro sobre câmaras de contagem e apor até 'de Newton anéis refração' pode ser visto entre as bordas da tampa-derrapante eo hemocitômetro.
   Nota: Estes indicam que a tampa-derrapante tem corretamente aderido à hemocitômetro.
5. Gentilmente pipeta 20 ul de suspensão de células sob a tampa-derrapante, enchendo a câmara de contagem pelo movimento capilar.Coloque hemocit�etro em 10x de um microscópio e visualizar as câmaras de contagem no layout grid.
6. Contagem de células do 4 quadrados exteriores da disposição da grade. Para melhorar a precisão, número de repetições de quadrados exteriores adicionais, se necessário, ou até a contagem atingiu 70 - 100 células ^14,15.
   1. Calcule a concentração de células por mL, como se segue: Média da contagem de células por factor de diluição x quadrado (se usado) x 10 ⁴
7. Repita os passos de 2,1-2,8 a cada 24 horas para 96 ​​horas pós-semeadura.

3. determinando a proliferação celular utilizando um ensaio à base de luminescência

Nota: Esta é uma medida endpoint. Uma vez que o reagente é adicionado às células, a placa só pode ser quantificada uma vez.

1. reagente de luminescência Thaw em um 22 ° C banho de água durante 30 minutos.
2. Misturar suavemente reagente, invertendo o frasco para se obter uma mistura homogénea.
3. Equilibrar uma placa de células semeadas (da etapa1,5) à temperatura ambiente durante 30 min.
4. Adiciona-se 100 ul de reagente de luminescência de cada poço. Misturar o conteúdo em um agitador orbital durante 2 min. Permitir que a placa a incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
5. A criação de um experimento de luminescência utilizando o software leitor de placas multi-modo.
   1. Ligue leitor de placas multi-modo e abrir o software. No 'gerenciador de tarefas ", selecione" experiências "e" criar new'.Select' file 'da barra de ferramentas lateral, e sob "protocolo" guia, selecione "Procedimento".
   2. Selecione 'Grenier 96 fundo plano "tipo de placa, e marque a caixa" uso tampa'. Selecione a ação "ler" sob a caixa "método lidas '. Selecione método de detecção de "luminescência". Clique em 'OK'.
   3. Na caixa de etapa ler, selecione os poços a serem digitalizados na guia "prato cheio", e selecione poços de agir poços como em branco.
   4. Definir o conjunto de filtros para filtrar vazio (por exemplo, plugue, Em: buraco, espelho: nenhum). Definir o ganho para135, com um tempo de integração de 0,5 s por poço e uma altura de 6,5 mm ler. Clique em "OK" para salvar as configurações para a leitura de luminescência.
6. Executando uma luminescentes Leia
   1. Ejectar suporte da placa, selecionando guia 'controle de instrumentos' e clique em 'placa out'.Place placa de 96 poços no suporte da placa, assegurando a tampa está ligado. Feche o suporte da placa, clicando em 'placa em' Guia sob 'controle de instrumentos. Clique em 'leia agora "na barra de ferramentas para executar leitura luminescente.
   2. Exportar as medições relativas unidade luminescente (RLU) de cada poço para uma folha de cálculo para análise posterior.
7. Repita os passos de 3,1-3,6 para gravar a proliferação cada 24 horas até 96 horas após a semeadura células.

4. Determinar contagem de células utilizando um gerador de imagens celular

1. A criação de um experimento de imagens de células usando o software gerador de imagens de células multi-mode
   1. Ligue imager célula multi-modo e th abertae software.
   2. No 'gerenciador de tarefas', selecione a aba 'experimentos' e 'criar new'.On o' 'da barra de ferramentas, clique em' arquivo 'guia e aberto' protocolo de procedimento de ajuste de temperatura ação "tab.Select ''. Definir incubadora para 'on' e ajustar a temperatura para 37 ° C e verificar "pré-aquecimento" antes de continuar com a caixa próximo passo '. Clique em "OK" para salvar as configurações.
   3. Selecione a ação 'ler'. Clique no método de detecção de 'imagem', selecione 'endpoint / cinético "ler tipo e tipo de óptica" Filtros ". Clicar em 'OK'.Click em "guia prato cheio' e selecione poços na placa a ser trabalhada. Clique em "OK" para salvar as configurações.
   4. Selecione o objetivo 2.5X no menu suspenso opções «objectivos». Sob a aba "canais", selecione dois canais: GFP 469, 525 e Campo brilhante. Verificar a exposição 'auto' para ambos os canais e selecione o auto-exposição bem.
   5. Para determinar auto ajustes de foco, selecione "auto-foco" e clique em "Opções". Para as opções de foco automático, selecione o método de "digitalizar e foco automático '. Clique em "OK" para salvar as configurações.
   6. Defina o deslocamento horizontal e vertical do centro de bem (im) para 0.Select para digitalizar várias imagens por poço em uma montagem 3 x 2, com espaçamento horizontal (mm) = 2.881 e espaçamento vertical (mm) = 2.127. Clique em "OK" para salvar as configurações do procedimento.
      Nota: Consulte a Tabela 2 para os parâmetros de leitura.
2. Realizando Leia Experiment na placa Selecionado
   1. Clique na aba 'controle de instrumentos' e selecione o 'prato out' function.Place placa de 96 poços no suporte da placa, assegurando a tampa está ligado. No separador 'controle de instrumentos ", selecione a opção' placa em 'função. Selecione 'ler agora "a partir do separador placa. Repita ler cada 24 horas até 96 horas após a semeadura.
3. Análise da contagem celular utilizando oCelular Software Imager.
   1. Para analisar uma imagem, clique na guia "Dados" na placa com imagens, 'imagem [GFP 469, 525 + campo Bright] "select. Dê um duplo clique em um bem trabalhada.
   2. Clique em uma imagem carregada. Selecione "Analisar" e selecionar uma única imagem da montagem a ser analisado. Clique em 'OK'.Check o "GFP" canal só, e definir os parâmetros, conforme descrito na Tabela 3. Clique em' Start 'para aplicar os parâmetros para as células fotografada.
   3. Observar a máscara contagem das células colocadas sobre as células fotografadas, que é usado para determinar a contagem de células por imagem. Clique em "Aplicar alterações" e manter essas configurações para cada placa fotografada durante todo o experimento.
   4. Depois de voltar à placa com imagens, clique sobre a queda de 'dados' no menu suspenso e selecione 'contagem de células'. Isto irá gerar a contagem total de células por poço.
   5. Exportar todos os dados para uma planilha, clicando na guia "exportação" para posterior análise of as contagens de células por poço.

Resultados

Para estudar diferentes métodos de medição da proliferação de células em cultura, a proliferação de células de MCF-7-Δ40p53 células transduzidas foi comparado com o MCF-7-LEGO não transduzidas linha celular de cancro da mama. Os três métodos que foram comparados - o método de imagiologia hemocitómetro convencional, ensaio de luminescência a viabilidade das células, e células Análisis- são descritas no diagrama esquemático (Figura 1). Cada método te...

Discussão

Neste protocolo foram examinados três diferentes métodos de medição da proliferação celular em células em cultura. Cada método foi capaz de medições reprodutíveis e precisos de proliferação de células durante 96 h, e os resultados foram comparáveis ​​entre cada um dos métodos testadas (Figura 2 e 3). Tanto o ensaio à base de luminescência e método de imagem de células produzido os resultados mais robustos, mostrando um aumento linear na proliferação de células após 96 horas <...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5