Comparaison de trois différentes méthodes pour la détermination de la prolifération cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer du sein

Résumé

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Résumé

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introduction

Le gène suppresseur de tumeur, p53, est un régulateur essentiel d'un certain nombre de processus cellulaires, y compris l' arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et la sénescence ^1. Il est responsable du maintien de la stabilité génomique et il est donc essentiel pour le maintien de l'équilibre de la mort cellulaire et la croissance cellulaire. Des mutations dans p53 sont fréquents dans le cancer et sont la principale cause de l' inactivation de p53 menant au cancer de la prolifération cellulaire incontrôlée ^2. Fait intéressant, les mutations dans p53 ne comptent pour environ 25% des cancers du sein ^3, ce qui suggère que d' autres mécanismes sont responsables de la perte de fonction de p53. Les isoformes de p53 récemment découverts ont été révélés être surexprimé dans un certain nombre de cancers humains, et peuvent moduler la fonction de p53 ^4,5. Nous avons précédemment montré que l'isoforme de p53, Δ40p53, est l'isoforme la plus fortement exprimée dans le cancer du sein, et il est fortement régulée positivement dans les cellules du cancer du sein, par rapport à la normale adjacente tissue ^6. Après cela, nous transduites de manière stable la lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7 à surexprimer Δ40p53 utilisant le lego-IG2-puro + vecteur (GFP +) ^7. Ces cellules ont été utilisées pour étudier si l'expression élevée Δ40p53 augmente le taux de prolifération cellulaire dans les cellules cancéreuses du sein.

Il existe de nombreuses méthodes directes et indirectes de la mesure de la prolifération cellulaire des cellules cultivées in vitro ^8,9. Ceux - ci peuvent être effectuées soit en tant que mesures continues dans le temps, ou des essais comme point final ^10. les méthodes classiques sont encore utiles, telles que le comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre. Cet essai est un faible coût et de la mesure directe du nombre de cellules, mais il ne repose sur de grands nombre de cellules et la formation hautement qualifiée pour minimiser les erreurs et un grand écart par rapport aux standards chiffres. La nécessité d'effectuer des mesures compatibles avec les formats à haut débit a conduit au développement d'essais multipuits-plaque. Ces analyses basées sur la luminescence mesure le nombre de cellules en fonction d'un signal luminescent proportionnel à l'activité métabolique de la cellule ^11,12. Plus récemment, l'introduction de la haute teneur des plates - formes d'imagerie a permis de nouveaux outils qui contrôlent la prolifération cellulaire tout en fournissant la collecte quantitative et qualitative des données phénotypiques, et comprend une variété de systèmes ^13. Toutes ces méthodes fournissent des pistes pour mesurer la croissance des cellules, soit par mesure ou finaux des essais continus, et possèdent chacun une gamme d'avantages et des inconvénients en ce qui concerne la sensibilité, le débit des numéros d'échantillons, et des informations de cellules, qui peuvent tous être pesé en conséquence en fonction sur la question de la recherche.

Ce protocole décrit trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire in vitro, avec chaque procédé utilisant des gammes différentes de sensibilité, la reproductibilité et les formats de plaque multi-puits. Ce protocole visait à comparer l'utilisation d'un hémocytomètre comptage chambre, un dosage à base luminescence viabilité cellulaire et d'imagerie cellulaire, dans la mesure de la prolifération cellulaire pendant un décours temporel de 96 heures. Pour ce faire, la croissance des cellules vecteur-transduction (MCF-7-lego) a été comparé à des cellules transduites pour surexprimer Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), en utilisant trois densités cellulaires différentes. La prolifération cellulaire a été mesurée toutes les 24 heures jusqu'à 96 heures. Chaque méthode a été constaté que ses propres avantages et inconvénients, et en fonction du but de l'expérience, chacun est encore une méthode utile pour fournir des informations sur le taux de prolifération.

Protocole

1. Les cellules Préparation pour la prolifération Assays

Note: Préparer les deux lignées cellulaires de la même manière et de la graine dans le même format pour chaque méthode à analyser.

1. Cultivez MCF-7-lego et MCF-7-Δ40p53 ⁷ cellules à 75-80% de confluence dans T 75 cm ² flacons de culture tissulaire en utilisant du phénol rouge libre milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) , 200 mM de L-glutamine, 2 pg / ml d' insuline et 1 pg / ml de puromycine à 37 ° C avec 5% de CO _2. Manipuler les cellules dans une biosécurité stérile classe armoire II.
   Remarque: La quantité de temps qu'il faut pour faire croître les cellules jusqu'à la confluence varie en fonction de la dilution de l'ensemencement. En préparation pour le plaquage des cellules pour les analyses de prolifération, ensemencer les cellules à une dilution de 1: 3 dans du DMEM supplémenté et maintenir dans des conditions normales de croissance pendant 3 jours jusqu'à ce que 75-80% de confluence.
2. Pour éliminer les cellules du flacon, verser les médias enun conteneur de déchets. Laver immédiatement la couche de cellules avec 2 ml de trypsine 2x préchauffé. Aspirer trypsine. Ajouter encore 2 ml de trypsine préchauffée à la couche de cellules et les placer dans un incubateur pendant 5 min à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   1. Une fois que les cellules se détachent, laver les cellules avec 10 ml réchauffé frais complété DMEM. Transférer la suspension cellulaire à un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 491 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant.
3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de DMEM frais complété. Effectuer une numération cellulaire pour déterminer la densité correcte pour ensemencer les cellules dans des plaques à 96 puits.
   1. Diluer 100 ul de la suspension de cellules dans 900 ul de solution saline tamponnée phosphate 1x Dulbecco (DPBS). Placez un nouveau capteur de 60 um sur le compteur de cellules automatisé. Maintenez le piston et immerger le capteur dans la suspension cellulaire diluée. Relâchez doucement le piston sur le compteur de cellules. Retirer le capteur du cou cellulairenter une fois rempli.
      Note: Le nombre de cellules sera affiché sur le compteur de cellules en cellules / ml.
4. Cellules de semences à un volume final de 100 pi (en DMEM) dans une plaque à 96 puits à ~ 20% de confluence pour laisser place à la croissance cellulaire et la mesure de la prolifération sur 3-5 jours (voir le tableau 1). Graine toutes les lignées cellulaires en triple exemplaire.
   Remarque: Pour cette expérience, trois densités cellulaires différentes ont été évaluées pour déterminer la densité cellulaire optimale. Les nombres de cellules nécessaires sont résumés dans le tableau 1. Cellules de semences à une densité plus faible si la mesure de plus de croissance à long terme est nécessaire.
   1. Pour l'hémocytomètre et des analyses basées sur la luminescence, préparer une plaque par point de temps (4 plaques par essai). Pour le dosage d'imagerie cellulaire, préparer une seule plaque pendant toute la durée de l'expérience.
5. Maintenir les cellules à 37 ° C avec 5% de _CO2 pendant 24 heures.

2. Cellule Détermination Count Using un hémocytomètre

1. Préchauffer les deux moyennes et de la trypsine à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire, d'un four ou un bain d'eau. Aspirer le milieu de cellules dans un conteneur à déchets, laver une fois avec 30 pl de 2x trypsine, et aspirer la trypsine.
2. Laver les cellules à nouveau avec 30 pi de 2x trypsine, et on incube pendant 5 minutes à 37 ° C. Tapoter doucement bord de la plaque pour déloger les cellules de la plaque. Ajouter 50 pi de DMEM supplémenté et mélanger les cellules par pipetage jusqu'à ce que les cellules forment une suspension cellulaire unique.
3. Préparer hémocytomètre par la surface et le couvercle en verre de nettoyage avec 70% d'éthanol.
4. Placez le verre lamelle sur les chambres de comptage et apposer jusqu'à ce que 'réfraction anneaux de Newton »peut être vu entre les bords lamelle et l'hémocytomètre.
   Note: Ceux-ci indiquent que la lamelle a correctement adhéré à l'hémocytomètre.
5. pipette doucement 20 pi de suspension cellulaire sous la lamelle, le remplissage de la chambre de comptage par le mouvement capillaire.Placez hémocytomètre sous un grossissement de 10x d'un microscope et de visualiser les chambres de comptage dans la mise en page de la grille.
6. Nombre de cellules dans les 4 carrés externes de la configuration de la grille. Pour améliorer la précision, le nombre de répétitions de carrés extérieurs supplémentaires si nécessaire, ou jusqu'à ce que le nombre a atteint 70 - 100 cellules ^14,15.
   1. Calculer la concentration de cellules par ml comme suit: nombre moyen de cellules par facteur carré x de dilution (si elle est utilisée) x 10 ⁴
7. Répétez les étapes 2,1-2,8 toutes les 24 heures pendant 96 heures après l'ensemencement.

3. Détermination de la prolifération des cellules en utilisant un dosage à base de Luminescence-

Note: Ceci est une mesure de point de terminaison. Une fois que le réactif est ajouté aux cellules, la plaque ne peut être quantifié d'une fois.

1. réactif de luminescence Thaw dans un bain d'eau à 22 ° C pendant 30 min.
2. Mélanger délicatement réactif en inversant la bouteille pour obtenir un mélange homogène.
3. Equilibrer une plaque de cellules ensemencées (de l'étape1,5) à température ambiante pendant 30 min.
4. Ajouter 100 ul de réactif de luminescence dans chaque puits. Mélanger le contenu sur un agitateur orbital pendant 2 min. Laisser la plaque à incuber pendant 10 min à température ambiante.
5. Mise en place d'une expérience de luminescence en utilisant le logiciel de lecteur de plaque multi-mode.
   1. Allumez multi-mode lecteur de plaque et ouvrez le logiciel. Dans le «gestionnaire de tâches», sélectionnez «expériences» et «créer new'.Select 'file' de barre d'outils, et sous« protocole »onglet, sélectionnez« procédure ».
   2. Sélectionnez 'Grenier 96 fond plat «type de plaque, et cochez la case' utilisation du couvercle. Sélectionnez l'action «lire» sous la case «méthode read '. Sélectionnez la méthode de détection de «luminescence». Cliquez sur 'OK'.
   3. Dans la zone étape de lecture, sélectionnez les puits à analyser sous l'onglet 'assiette pleine', et sélectionnez puits d'agir comme puits vides.
   4. Réglez le filtre mis à filtre vide (par exemple, la fiche Em: trou, miroir: none). Réglez le gain sur135, avec un temps d'intégration de 0,5 sec par puits et une hauteur de 6,5 mm lire. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres pour la lecture de luminescence.
6. Exécution d'une luminescentes Lire
   1. Ejecter support de plaque en sélectionnant l'onglet «contrôle de l'instrument» et cliquez sur «plaque out'.Place plaque de 96 puits sur le support de plaque, assurer le couvercle est en marche. Fermez le support de plaque en cliquant sur 'plaque' onglet sous «contrôle de l'instrument». Cliquez sur 'lire maintenant "de la barre d'outils pour effectuer lecture luminescent.
   2. Exporter les unité luminescente (ULR) des mesures relatives à chaque puits à une feuille de calcul pour une analyse ultérieure.
7. Répétez les étapes 3,1-3,6 pour enregistrer la prolifération toutes les 24 heures jusqu'à 96 heures après l'ensemencement des cellules.

4. Déterminer le comte de cellule en utilisant un imageur portable

1. Mettre en place une expérience d'imagerie cellulaire en utilisant le logiciel d'imagerie cellulaire multimode
   1. Allumez multi-mode imageur cellulaire et e ouvertelogiciels e.
   2. Dans le «gestionnaire de tâches», sélectionnez l'onglet 'expériences de et «créer new'.On la' 'barre d'outils, cliquez sur' file 'onglet ouvert et« protocole procédure température de consigne' action 'tab.Select'. Set incubateur pour 'on' et régler la température à 37 ° C et vérifier «préchauffage» avant de continuer à l'étape suivante box '. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres.
   3. Sélectionnez l'action «lire». Cliquez sur la méthode de détection 'image', sélectionnez 'extrémité / cinétique »lire le type et le type de l'optique" Filtres. Cliquez sur 'OK'.Click sur' onglet pleine plaque »et sélectionner des puits sur la plaque à imager. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres.
   4. Sélectionnez l'objectif 2.5X dans la liste déroulante options 'objectifs de. Sous l'onglet 'canaux de sélectionner deux canaux: GFP 469, 525 et Bright Champ. Vérifiez l'exposition 'auto' pour les deux canaux et sélectionnez bien l'auto-exposition.
   5. Pour déterminer auto les paramètres de mise au point, sélectionnez «auto-focus» et cliquez sur «options». Pour les options d'auto-focus, sélectionnez la méthode «numériser et mise au point automatique. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres.
   6. Réglez le décalage horizontal et vertical du centre de bien (um) à 0.Select pour numériser plusieurs images par puits dans un montage 3 x 2, avec un espacement horizontal (um) = 2,881 et de l'espacement vertical (pm) = 2127. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres de la procédure.
      Note: Voir le tableau 2 pour les paramètres de lecture.
2. Exécution Lire Expérience sur la planche sélectionnée
   1. Cliquez sur l'onglet «contrôle de l'instrument» et sélectionnez le function.Place 'assiette sur' plaque de 96 puits dans le support de plaque, assurer le couvercle est en marche. Sous l'onglet «contrôle de l'instrument", sélectionnez la «plaque» fonction. Sélectionnez «lire maintenant» dans l'onglet de la plaque. Répétez lire tous les 24 heures jusqu'à 96 heures après l'ensemencement.
3. Analyse du Cell Count Utilisation de laCellule Imager Software.
   1. Pour analyser une image, cliquez sur l'onglet «données» sur la plaque imagée, 'image [GFP 469, 525 + Fond clair]' select. Double-cliquez sur un bien imagé.
   2. Cliquez sur une image chargée. Sélectionnez 'analyser' et sélectionner une seule image du montage à analyser. Cliquez sur 'OK'.Check la «GFP» seul canal, et les paramètres fixés comme indiqué dans le tableau 3. Cliquez sur "START" pour appliquer des paramètres aux cellules imagées.
   3. Observer le masque de comptage de cellules placées sur les cellules imagées, qui est utilisé pour déterminer le nombre de cellules par image. Cliquez sur "appliquer les modifications 'et maintenir ces paramètres pour chaque plaque imagée pendant toute l'expérience.
   4. Une fois de retour à la plaque imagée, cliquez sur le menu «données» dans le menu déroulant et sélectionnez «nombre de cellules. Ceci générera le nombre total de cellules par puits.
   5. Exporter toutes les données sur une feuille de calcul en cliquant sur l'onglet «d'exportation» pour une analyse plus approfondie of le nombre de cellules par puits.

Résultats

Pour étudier les différentes méthodes de mesure de la prolifération des cellules mises en culture, la prolifération cellulaire des cellules MCF-7-Δ40p53 cellules transduites a été comparée à la MCF-7-lego non transduites lignée cellulaire de cancer du sein. Les trois méthodes qui ont été comparés - la méthode d'imagerie hémocytomètre classique, le dosage de luminescence de la viabilité des cellules et la cellule analyse- sont décrites dans le schéma (Figu...

Discussion

Dans ce protocole trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire dans les cellules cultivées ont été examinées. Chaque procédé est capable de mesures reproductibles et précis de la prolifération cellulaire pendant 96 heures, et les résultats étaient comparables entre chacune des méthodes testées (figure 2 et 3). À la fois le dosage à base de luminescence et un procédé d'imagerie de cellules ont produit des résultats les plus robustes, montrant une augmentatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5