الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Summary

توضح هذه الدراسة تقنيات الطبيعية الحيوية، والكيمياء الحيوية والجزيئية لوصف النشاط كوصي من الإشريكية القولونية HdeB في ظل الظروف الحامضية. وقد تم تطبيق هذه الأساليب بنجاح للمرافقين آخرين حامض واقية مثل HdeA ويمكن تعديل للعمل من أجل مرافقين آخرين وظروف الإجهاد.

Abstract

وكثيرا ما تتعرض البكتيريا لتغيرات بيئية، مثل التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وحالة الأكسدة، التعرض للضوء أو القوة الميكانيكية. العديد من هذه الشروط يسبب البروتين تتكشف في الخلية ويكون لها تأثير ضار على بقاء الكائن الحي. وقد أظهرت مجموعة من لا علاقة لها، المحرمين الجزيئي الإجهاد محددة للعب أدوار أساسية في بقاء هذه ظروف الإجهاد. في حين مطوية بالكامل وكوصي غير نشط قبل الإجهاد، وهذه البروتينات تتكشف بسرعة ويصبح-كوصي نشط تحت ظروف الإجهاد محددة. تنشيط مرة واحدة، وهذه مرافقين المختلين مشروط ربط عدد كبير من البروتينات المعرضة للتجميع مختلفة، ومنع تجميع وإما بشكل مباشر أو غير مباشر تسهيل بروتين refolding لدى عودته إلى الظروف غير الإجهاد. النهج الأساسي لاكتساب فهم أكثر تفصيلا حول آلية تفعيل والعميل الاعتراف بها ينطوي على تنقية وsubsequenر توصيف هذه البروتينات باستخدام فحوصات في المختبر كوصي. المتابعة في المقايسات إجهاد الجسم الحي ضرورية للغاية لتأكيد مستقل حصلت في نتائج المختبر.

يصف هذا البروتوكول في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لوصف النشاط كوصي من E. القولونية HdeB، وهو كوصي حمض تفعيلها. واستخدمت القياسات نثر الخفيفة، مريحة للقراءة خارج عن قدرة HdeB لمنع تجميع الناجم عن حمض من البروتين العميل نموذج المعمول بها، مليون درهم، في المختبر. طبقت التجارب تنبيذ فائق التحليلية للكشف عن تشكيل المعقد بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان البروتين عملائها، لتسليط الضوء على مصير البروتينات العميل لدى عودتهم إلى الظروف غير الإجهاد. وأجريت فحوصات النشاط الأنزيمية للبروتينات العميل لرصد آثار HdeB على تعطيل العميل الناجم عن درجة الحموضة وتنشيط. وأخيرا، استخدمت دراسات البقاء على قيد الحياة لرصد ومراقبةص تأثير وظيفة كوصي HdeB في الجسم الحي.

Introduction

والبيئة الطبيعية المشتركة التي مسببات الأمراض الميكروبية تجربة الظروف التي تتكشف البروتين الحمضية التي يسببها هي المعدة الثدييات (المدى درجة الحموضة 1-4)، التي تعد بمثابة حاجز فعال ضد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية ¹ الرقم الهيدروجيني الحمضية. البروتين تتكشف والتجميع، والذي كان سببه الجانب الأحماض الأمينية سلسلة بروتوناتيون، ويؤثر على العمليات الحيوية، والأضرار الهياكل الخلوية ويتسبب في نهاية المطاف موت الخلية ^1،2. منذ الرقم الهيدروجيني للالجبلة المحيطية البكتيرية equilibrates على الفور تقريبا مع درجة الحموضة البيئية بسبب نشر خالية من البروتونات عبر الغشاء الخارجي يسهل اختراقها، بروتينات غشاء محيط بالجبلة والداخلية من البكتيريا سالبة الجرام هي المكونات الخلوية الأكثر ضعفا في ظل الظروف الحمضية من الإجهاد ^3. لحماية بروتيوم محيط بالجبلة ضد الضرر بوساطة حمض السريع، والبكتيريا سالبة الجرام الاستفادة من المحرمين محيط بالجبلة تنشيط حمض HdeA وHdeB. HdeA هو كوصي المختلين مشروط ^{4،5: في الرقم الهيدروجيني محايدة، HdeA غير بوصفها و، ديمر-كوصي غير نشط مطوية. بناء على التحول درجة الحموضة أقل من الرقم الهيدروجيني 3، وظيفة كوصي HdeA وسرعان ما تنشيط 6،7. تفعيل HdeA يتطلب تغييرات عميقة الهيكلية، بما في ذلك الانفصال حيز أحادية، والجزئي تتكشف أحادية 6-8. بمجرد تفعيلها، HdeA ترتبط بالبروتين التي تتكشف في ظل الظروف الحمضية. ويمنع على نحو فعال التجميع على حد سواء خلال حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني، وكذلك على تحييد الحموضة. لدى عودته إلى 7.0 درجة الحموضة، HdeA يسهل refolding من البروتينات عملائها بطريقة ATP مستقلة ويحول مرة أخرى إلى مثنوي، التشكل كوصي خاملا 9 منه. وبالمثل، كوصي HdeB مثلي والوصيفة-نشط أيضا في درجة الحموضة 7.0. على عكس HdeA، ومع ذلك، النشاط كوصي HdeB ويصل الحد الأقصى واضح في الرقم الهيدروجيني 4.0، الظروف التي لا تزال مطوية HdeB إلى حد كبير ومثنوي 10. وعلاوة على ذلك، مما خفض مركز دراسات الرقم الهيدروجينيوفاق لتثبيط HdeB. وتشير هذه النتائج أنه على الرغم من التماثل على نطاق واسع، HdeA وHdeB تختلف في طريقتهم في تفعيل وظيفي والسماح لهم لتغطية مجموعة ودرجة الحموضة واسع مع وظيفة كوصي الحمائية. واحد كوصي الأخرى التي تورطت في مقاومة الأحماض من E. القولونية هو Hsp31 حشوية، والذي يظهر على استقرار البروتينات العميل تكشفت حتى تتم استعادة الظروف محايدة. وضع دقيق للعمل Hsp31، ومع ذلك، ظلت غامضة 12. وبالنظر إلى أن البكتيريا ممرض للأمعاء أخرى مثل السالمونيلا تفتقر إلى الاوبرون hdeAB، فمن المحتمل جدا أن مرافقين محيط بالجبلة بعد مجهولين آخرين قد توجد التي تشارك في مقاومة الأحماض من هذه البكتيريا 11.}

البروتوكولات المعروضة هنا تسمح لمراقبة النشاط كوصي تعتمد على درجة الحموضة من HdeB في التجارب المختبرية والحية ¹⁰ ويمكن تطبيقها للتحقيق مرافقين آخرينمثل Hsp31. بدلا من ذلك، شبكة معقدة من عوامل النسخ التي تتحكم في التعبير عن hdeAB من المحتمل أن يتم التحقيق من قبل في الجسم الحي الإجهاد الفحص. لتوصيف وظيفة كوصي من البروتينات في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على الاجهزة التجريبية المختلفة. طريق واحد هو تطبيق البروتين تتكشف ظروف الإجهاد وظاهريا تميز سلالات متحولة إما بإفراط عن الجينات في المصالح أو تحمل حذف هذا الجين. ويمكن إجراء دراسات البروتين لتحديد أي البروتينات لم يعد مجموع المباراتين تحت ظروف الإجهاد عندما كوصي هو الحاضر، أو تأثير كوصي على انزيم معين يمكن تحديده خلال ظروف الإجهاد باستخدام المقايسات الأنزيمية ^14-16. في هذه الدراسة، اخترنا بإفراط HdeB في سلالة rpoH الحذف، التي تفتقر إلى الصدمة الحرارية عامل سيغما 32. RpoH تسيطر على التعبير عن كل E. كبير مرافقين القولونية وحذفها من المعروف أن زيادة السيناتورitivity لظروف الإجهاد البيئية التي تسبب البروتين تتكشف ^15. تقرر في الجسم الحي النشاط كوصي من HdeB من خلال رصد قدرتها على قمع حساسية الرقم الهيدروجيني للسلالة Δ rpoH. وإجمالا، فإن البروتوكولات المعروضة هنا توفر نهج سريع ومباشر لوصف النشاط من كوصي الحمضية التي تنشط في المختبر وكذلك في سياق في الجسم الحي.

Protocol

1. التعبير وتنقية محيط بالجبلة HdeB

وأعرب عن HdeB في E. ملاحظة: خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB ^10، وتنقيته من الجبلة المحيطية على تحلل بوليميكسين.

1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من E. خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB ¹⁰ في 30 مل LB تحتوي على 200 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (LB _{الأمبير).} تطعيم أربعة 1 الثقافات L من LB _{الأمبير} وتنمو لهم عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى يتم التوصل إلى OD _{ل 600Nm} من 0.7. ثم، إضافة 300 ميكرومتر IPTG للحث على التعبير عن HdeB وانخفاض درجة حرارة النمو إلى 30 درجة مئوية.
2. بعد 5 ساعة التعبير البروتين عند 30 درجة مئوية، حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. غسل بيليه الخلية مع 100 مل العازلة ألف (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وأجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 8000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
4. وفي وقت لاحق، و resuspendبيليه الخلية في 80 مل العازلة A، التي تحتوي على 1 ملغ / مل سلفات بوليميكسين. لتعطيل الفعال للغشاء الخارجي، وإثارة بلطف تعليق لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
5. لإزالة جزء حشوية والحطام الخلوي، الطرد المركزي تعليق لمدة 20 دقيقة في 15000 x ج في 4 درجات مئوية. وهذا يؤدي إلى ~ 60 مل طاف تحتوي على HdeB قابل للذوبان.
6. Dialyze طاف التي تحتوي على مستخلص محيط بالجبلة بين عشية وضحاها ضد حجم 150X العازلة ب (20 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 0.5 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) باستخدام غشاء غسيل الكلى مع 6 كيلو دالتون ميغاواط من قطع. تركيز البروتينات إلى 15 مل باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 3 كيلو دالتون. تصفية حل البروتين باستخدام فلتر 0.2 ميكرون المسام.
7. تطبيق البروتين على عمود الصرف أنيون اللوني (حجم العمود 5 مل) التي تم معايرتها مع 5 أحجام العمود B العازلة مع معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة. مرة واحدة يتم تحميل البروتين على العمود، وغسل العمود مع العازلة B لمدة 10 دقيقة فيمعدل تدفق 2.5 مل / دقيقة. أزل HdeB مع الانحدار الخطي 0-0،5 M كلوريد الصوديوم في B العازلة على مدى فترة زمنية قدرها 50 دقيقة مع معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة ^6.
8. تحديد الكسور التي تحتوي HdeB باستخدام 15٪ SDS-PAGE. مزيج 20 عينة ميكرولتر مع 5 ميكرولتر 5X خفض العازلة تحميل SDS. تحميل 10 ميكرولتر على جل وتشغيل العازلة في تريس، جليكاين (14.4 غرام / لتر الجلايسين، 2.9 جم / لتر تريس، 1 غرام / لتر دوديسيل كبريتات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.3). تشغيل هلام في 150 V حتى ترحيل الفرقة برموفينول بالقرب من الجزء السفلي من هلام (~ 45 دقيقة).
9. تجمع كل الأجزاء HdeB التي تحتوي على، dialyze في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة تخزين HdeB (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0)، وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 300 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 3 كيلو دالتون. تحديد تركيز HdeB في 280 نانومتر باستخدام انقراض معامل ε _280nm = 15595 م ^-1 سم ^-1. إعداد 100 مكل وخالية من فلاشزي وقسامات في النيتروجين السائل.
   ملاحظة: يمكن تخزين HdeB في -70 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.

2. الوصيفة آخر الفحص عن طريق حراريا تتكشف مالات هيدروجيناز (مليون درهم)

ملاحظة: تأثير HdeB تنقيته على تجميع تتكشف حراريا الخنازير نازعة مالات الميتوكوندريا (مليون درهم) في قيم الرقم الهيدروجيني مختلفة تم رصدها على النحو المبين أدناه. جميع التركيزات البروتين المدرجة تشير إلى تركيز مونومر.

1. لإعداد مليون درهم، dialyze مليون درهم في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة C (50 ملي فوسفات البوتاسيوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 100 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 30 كيلو دالتون.
   ملاحظة: مطلوب غسيل الكلى الدقيق مليون درهم كما يتم تسليم مليون درهم كما محلول كبريتات الأمونيوم.
2. لإزالة الركام، الطرد المركزي البروتين لمدة 20 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز مليون درهم من قبل الامتصاصية في 280 نانومتر (ε <فرعية> 280 نانومتر = 7950 م ^-1 سم ^-1). تجهيز 50 مكل من مليون درهم وفلاش تجميد قسامات للتخزين.
3. ضع 1 مل الكوارتز كوفيت إلى معمل مضان مجهزة درجة الحرارة للرقابة أصحاب العينة والنمام. تعيين _السابق λ _{/ م} إلى 350 نانومتر.
4. إضافة وحدات مناسبة من قبل تحسنت (43 ° C) عازلة D (150 ملي فوسفات البوتاسيوم، 150 مم كلوريد الصوديوم) في القيم المطلوبة درجة الحموضة (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0، ودرجة الحموضة 5.0) إلى كفيت ومجموعة درجة الحرارة في حامل كوفيت إلى 43 درجة مئوية. الحجم الكلي هو 1000 ميكرولتر.
5. إضافة 12.5 ميكرومتر HdeB (أو بدلا من نفس الحجم من العازلة التخزين HdeB لمراقبة عازلة) إلى المخزن المؤقت، تليها إضافة مليون درهم 0.5 ميكرومتر. تبدأ رصد تشتت الضوء. احتضان رد فعل ل 360 ثانية للسماح كافية تتكشف مليون درهم.
6. رفع درجة الحموضة إلى 7 بإضافة 0،16-0،34 حجم 2 M K غير مصقول ₂ هبو ₄ ومواصلة إعادةحبال تشتت الضوء على 440 ثانية أخرى.
7. تعيين حد لتجميع مليون درهم التي يتم تسجيلها في غياب كوصي عند نقطة زمنية محددة بعد تحييد (هنا بعد 500 ثانية، وعندما لوحظ القصوى تشتت الضوء من مليون درهم) إلى 100٪. تطبيع النشاط HdeB إلى إشارة ضوئية تناثر مليون درهم في غياب HdeB في كل قيمة الرقم الهيدروجيني المشار إليها.

3. الكشف عن HdeB-LDH تشكيل مجمع كتبها التحليلية تنبيذ فائق (AUC)

ملاحظة: تم تنفيذ الترسيب التجارب سرعة HdeB وحدها أو في المجمع مع تتكشف حراريا نازعة اكتات (LDH) باستخدام نابذة التحليلية.

1. لإعداد LDH، dialyze LDH في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة C (50 ملي فوسفات البوتاسيوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 200 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 30 كيلو دالتون.
   ملاحظة: مطلوب غسيل الكلى الدقيق لرابطة حقوق الإنسان كما LDيتم تسليم H كما محلول كبريتات الأمونيوم.
2. لإزالة الركام، الطرد المركزي LDH لمدة 20 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز رابطة حقوق الإنسان من قبل الامتصاصية في 280 نانومتر _{(النانومتر} = ε ₂₈₀ 43680 م ^-1 سم ^-1). تجهيز 50 مكل من LDH وفلاش تجميد قسامات للتخزين.
3. احتضان 3 LDH ميكرومتر في حضور وغياب HdeB 30 ميكرومتر في المخزن D (درجة الحموضة 4 و 7، على التوالي) لمدة 15 دقيقة في 41 درجة مئوية.
   ملاحظة: الحضانة من رابطة حقوق الإنسان في أعلى نتائج درجات الحرارة في تجميع التام، وليس له تأثير كوصي من HdeB يمكن ملاحظتها.
4. السماح للعينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، وعينات من الحمل إلى الخلايا التي تحتوي على قطاع معيار شكل المركزية 2-قناة مع 1.2 سم طول المسار. تحميل الخلايا في نابذة وتتوازن إلى 22 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل الترسيب.
5. عينات تدور عند 22 درجة مئوية و 167000 x ج في الدوار منهما لمدة 12 ساعة، ورصد الحوار الاقتصادي الاستراتيجيimentation من البروتين بشكل مستمر عند 280 نانومتر. كما هو موضح سابقا، يتم تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء عندما يتم قياس شدة الضوء ينتقل من كل قناة بدلا من الامتصاصية. هذا أيضا يحسن نوعية تركيب البيانات لاحقا.
6. إجراء تحليل البيانات مع SEDFIT (الإصدار 15.01b، ديسمبر 2015)، وذلك باستخدام نموذج توزيع ج مستمرة (ق) ^17. وهناك أمثلة توضيحية تصف كيفية استخدام SEDFIT يمكن العثور في اشارة ^18.
   1. تعيين مستوى الثقة لتسوية ME (الحد الأقصى الانتروبيا) إلى 0.7.
7. حساب كثافة عازلة وكذلك اللزوجة باستخدام SEDNTERP ^19. لتقدير كمية البروتين العميل مجمعة، مقارنة تكاملات LDH الرسوبية في درجة الحموضة 4 إلى الرقم الهيدروجيني 7 كمرجع.
   ملاحظة: دمج المؤامرات توزيع الترسيب يمكن القيام به مباشرة في SEDFIT. برنامج بديل لتحليل البيانات سرعة الترسيب يمكن العثور عليها في استعراض حديث ^20.

4. رصد مليون درهم التعطيل وإعادة تنشيط في وجود HdeB

ملاحظة: تأثير HdeB تنقيته على refolding من درجة الحموضة تكشفت مليون درهم تم تحديدها من قبل رصد نشاط مليون درهم على التعادل.

1. احتضان 1 مليون درهم ميكرومتر في المخزن D في القيم المطلوبة درجة الحموضة (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0، ودرجة الحموضة 5.0) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في ظل غياب أو وجود 25 ميكرومتر HdeB. ثم، تحول درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: لم يلاحظ وجود refolding مليون درهم حتى في وجود HdeB عندما حضنت مليون درهم في درجات حرارة أعلى من 37 درجة مئوية.
2. لبدء refolding من حمض مليون درهم التشويه والتحريف، تحييد عينات لدرجة الحموضة 7 بإضافة 0،13-0،42 حجم 0.5 M فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0.
3. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 2 ساعة على 20 درجة مئوية، وتحديد النشاط مليون درهم من خلال رصد انخفاض NADH في 340 نانومتر ^9.
   ملاحظة: مليون درهم يحفز تخفيض تعتمد على NADH من أوكسالوآسيتات إلى L-مالات.
4. مزيج 50 ميكرولتر من رد فعل الحضانة مع 950 ميكرولتر من العازلة الفحص (50 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0، أوكسالوآسيتات 1 ملم، و 150 ميكرومتر NADH).
   ملاحظة: يجب أن يكون تركيز النهائي من مليون درهم في المخزن المؤقت فحص 44 نانومتر.
5. مراقبة التغير في الامتصاصية باستخدام مقياس الطيف الضوئي، ومجهزة كتلة بلتيير التحكم في درجة الحرارة المحددة إلى 20 درجة مئوية.
6. عن النشاط مليون درهم مقارنة 44 نانومتر الأصلي مليون درهم التي تم الاحتفاظ بها في درجة الحموضة 7.0.

5. تأثير HdeB Overexpression على E. القولونية البقاء على قيد الحياة تحت الإجهاد حمض

ملاحظة: E. تم عزل كولاي MG1655 الجينومية الحمض النووي باستخدام بروتوكول نشر ^21.

1. تضخيم hdeB من E. القولونية MG1655 بواسطة PCR باستخدام بادئات hdeB - BamH I-مراجعة GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG الجهاز المركزي للمحاسبات GTC ATT وhdeB - ECOR I-مهاجم GGT دول مجلس التعاون الخليجي غا عقاري AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA تكت لجنة مكافحة الإرهاب C.
2. إعداد تفاعل PCR في 50 ميكرولتر على النحو التالي: 10 ميكرولتر 5X العازلة البلمرة، و 200 ميكرومتر dNTPs، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي JUD2، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي JUD5، 150 نانوغرام الجيني MG1655 الحمض النووي، و 0.5 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي، إضافة ده ₂ O 50 ميكرولتر.
3. أداء التضخيم من hdeB على النحو التالي: الخطوة 1: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و1 دورة. خطوة 2: 30 ثانية في 95 درجة مئوية، و 30 ثانية في 55 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية، 40 دورة. خطوة 3: 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
4. استنساخ الناتجة PCR جزء في مواقع ECOR الأول وBamH أنا البلازميد pBAD18 باستخدام الطرق القياسية لاستنساخ الموقع قيود. تنقية البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحقق من البلازميد الناجم عن تسلسل ^10.
5. تحويل البلازميد معربا عن HdeB أو فارغة pBAD18 مكافحة ناقلات الأمراض في BB7224 سلالة (Δ rpoH) (النمط الجيني: F ^- λ ^-، E14 ^- [araD139] _{ب / ص} [6؛ (صندوق الفرعي لاك) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (ن خ ^ص) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: تينيسي 10 (ح ^S) suhX401 deoC1 اراد ⁺ rpoH :: اساسه ⁺ و ¹⁶⁾ باستخدام الخلايا المختصة كيميائيا.
   ملاحظة: هذه السلالة هي حساسة للحرارة.
6. بعد 45 ثانية الحرارة صدمة في 42 درجة مئوية، وقبل والطلاء، واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. أداء واحدة مستعمرة خط الرافضة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل LB _{الأمبير} وزراعة الخلايا في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
7. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها من 40 أضعاف إلى 25 مل LB _{الأمبير} وتنمو البكتيريا في وجود 0.5٪ الارابينوز (آرا) عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة _{لل 600Nm} OD = 1.0 للحث على التعبير البروتين HdeB.
8. لتجارب التحول درجة الحموضة، واستخدام LBأمبير + آرا لتمييع الخلايا _{لل 600Nm} OD من 0.5 والتكيف مع القيم الخاصة الرقم الهيدروجيني (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0) وذلك بإضافة كميات مناسبة من 5 M حمض الهيدروكلوريك.
9. بعد النقاط الزمنية المشار إليها (درجة الحموضة 2، 1 دقيقة، الرقم الهيدروجيني 3، 2.5 دقيقة، الرقم الهيدروجيني 4، 30 دقيقة)، تحييد الحضارات إضافة كميات مناسبة من 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
10. مراقبة نمو الثقافات تحييد في ثقافة السائل لمدة 12 ساعة على 30 درجة مئوية باستخدام القياسات OD.

النتائج

HdeA وHdeB هي مثلي E. البروتينات القولونية، والمعروف لحماية البروتينات محيط بالجبلة ضد ظروف الإجهاد الحمضية ^10. كشفت عملنا التي تشبه إلى HdeA، HdeB يعمل أيضا تنشيط حمض كوصي الجزيئية. ومع ذلك، وعلى النقيض من وظائف HdeA، HdeB في الرقم الهيدروجيني ال...

Discussion

من أجل دراسة آلية تفعيل وظيفة كوصي من HdeB، كميات كبيرة من HdeB يجب أن تكون أعرب وتنقيته. تتوفر لإنتاج مستويات عالية من بروتين الهدف، بما في ذلك pTrc أو pBAD ناقلات، وكلاهما المستخدمة في هذه الدراسة عدد من أنظمة ناقلات التعبير. المروجين يمكن الوصول إليها بسهولة لE. القول?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786