איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Summary

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

Abstract

חיידקים נחשפים לעתים קרובות לשינויים סביבתיים, כגון שינויים ב- pH, טמפרטורה, מצב חיזור, חשיפה לאור או כוח מכני. הרבה מהמקרים האלה לגרום חלבון התגלגלות בתא ויש להם השפעה מזיקה על ההישרדות של האורגניזם. קבוצת מלווים שאינם קשורים, מולקולריים ספציפי לחץ הוכחה לשחק תפקידים חיוניים להישרדותה של תנאי הלחץ הללו. בעוד מקופל מלא מלווה-פעיל לפני לחץ, החלבונים האלה להתפתח במהירות ולהיות מלווה-פעיל בתנאי קיצון ספציפי. הופעל פעם אחת, מלווה סדר המותנה אלה נקלטות על ידי מספר רב של חלבוני צבירה נוטה שונים, למנוע הצבירה שלהם במישרין או בעקיפין להקל חלבון refolding עם שיבת תנאים שאינם מתח. הגישה העיקרית להשגת הבנה מפורטת יותר על המנגנון של הכרת הפעלת הלקוח שלהם כרוכה הטיהור subsequenאפיון t של חלבונים אלו באמצעות מבחני מלווה במבחנה. מעקב מבחני לחץ vivo חיוני לחלוטין כדי לאשר את שהושג באופן עצמאי בתוצאות חוץ גופייה.

פרוטוקול זה מתאר במבחנה שיטות vivo לאפיין את הפעילות המלווה של E. coli HdeB, גידול מלווה חומצה מופעלת. מדידות פיזור אור שמשו לקריאה מתוך נוח הקיבולת של HdeB למנוע צבירה הנגרמת חומצה של חלבון לקוח המודל הוקם, MDH, במבחנה. ניסויי ultracentrifugation אנליטית יושמו לחשוף היווצרות מורכבת בין HdeB ו LDH חלבון הלקוח שלה, כדי לשפוך אור לתוך גורל חלבוני לקוח עם שובי תנאים שאינם מתח. מבחני הפעילות האנזימטית של חלבוני הלקוח נערכו במטרה לפקח על תופעות של HdeB על איון הלקוח הנגרמת pH ו מחדש. לבסוף, מחקרים הישרדות שימשו Monitor השפעת פונקצית in vivo המלווה של HdeB.

Introduction

סביבה טבעית משותפת שבה פתוגנים חיידקים לחוות תנאי התגלגלות חלבון חומצה הנגרמת היא בבטן היונקת (טווח pH 1-4), אשר pH חומצי משמש מחסום יעיל נגד פתוגנים שמקורן במזון ^1. חלבון התגלגלות ומקבצים, אשר נגרם על ידי protonation שרשרת הצד של חומצות אמיניות, משפיעים תהליכים ביולוגיים, מבנים הסלולר ניזקים ולבסוף גורם מוות של תאי ^1,2. מאז ה- pH של periplasm חיידקי equilibrates כמעט מיידי עם pH הסביבתי עקב דיפוזיה החופשית של פרוטונים דרך הממברנה החיצונית הנקבובית, חלבונים בממברנה periplasmic והפנימיים של חיידקי גרם שליליים הם מרכיבים התאיים הפגיעים ביותר בתנאי חומצה-מתח ^3. כדי להגן proteome שלהם periplasmic מפני נזק חומצה בתיווך מהירה, חיידקים גראם שליליים לנצל את המלוות periplasmic המופעל חומצה HdeA ו HdeB. HdeA הוא מלווה מופרע על תנאים ^{4,5: ב- pH נייטרלי, HdeA קיים בתור דימר מקופל, המלווה-פעיל. עם שינוי pH מתחת pH 3, הפונקציה המלווה של HdeA מופעלת במהירות 6,7. הפעלת HdeA דורש שינויים מבניים עמוקים, כולל ניתוק שלה לתוך מונומרים, ואת חלקי התגלגלות של מונומרים 6-8. הופעל פעם אחת, HdeA נקשר לחלבונים הנפרשות בתנאים חומציים. זה מונע ביעילות הצבירה שלהם הוא במהלך הדגירה ב- pH הנמוך, כמו גם על נטרול pH. עם שובו ל- pH 7.0, HdeA מקל על refolding של חלבוני הלקוח שלו בצורה ATP-עצמאית וממיר בחזרה לתוך קונפורמציה שלה dimeric, בת הלוויה-פעיל 9. באופן דומה, HdeB המלווה ההומולוגי הוא גם לוויה-פעיל ב- pH 7.0. בניגוד HdeA, לעומת זאת, פעילות המלווה של HdeB מגיע המקסימלית שלה לכאורה ברמה של 4.0 pH, התנאים שבהם HdeB עדיין מקופלת ברובו dimeric 10. יתר על כן, עוד הורדת קאוס pHes איון של HdeB. תוצאות מראות כי למרות ההומולוגיה הנרחבת שלהם, HdeA ו HdeB שונים במצב שלהם הפעלה פונקציונלית ומאפשרת להם מכסי מגוון רחב pH עם פונקצית המלווה המגנה שלהם. מלווה אחר אחת כי היה מעורב התנגדות החומצה של E. coli הוא Hsp31 cytoplasmic, המופיע לייצב חלבוני הלקוח פרש עד משוחזרים תנאי נייטרלי. המצב המדויק של הפעולה של Hsp31, לעומת זאת, נותר 12 חידתי. בהתחשב בכך חיידקים וחיידק אחרים כגון סלמונלה חסרים את אופרון hdeAB, סביר מאוד כי מלוות periplasmic בלתי מזוהים אחרים אבל בכל זאת עלולים להתקיים כי הם מעורבים התנגדות חומצה של חיידקים אלה 11.}

הפרוטוקולים שהוצגו כאן מאפשרים לפקח על הפעילות המלווה תלוי pH של HdeB במבחנה ובחי ¹⁰ וניתן להחיל לחקור מלווים אחריםכגון Hsp31. לחלופין, הרשת המורכבת של גורמי שעתוק השולטות ביטוי hdeAB יכולה להיחקר באופן פוטנציאלי על ידי assay מתח vivo. כדי לאפיין את תפקודם של חלבונים המלווים in vivo, setups הניסיוני השונה ניתן ליישם. מסלול אחד הוא ליישם בתנאי עקה התגלגלות חלבון phenotypically לאפיין זנים מוטנטים כי גם ביטוי יתר של הגן של עניין או לבצע מחיקה של הגן. ניתן לבצע מחקרי proteomic לזהות אילו חלבונים כבר לא המצרפי בתנאי קיצון כאשר המלווה הוא הווה, או את ההשפעה של מלווה על אנזים מסוים יכולה להיקבע במהלך בתנאי עקה באמצעות מבחני האנזימטית ^14-16. במחקר זה, בחרנו overexpress HdeB ב זן מחיקת rpoH, אשר חסר את גורם סיגמא הלם חום 32. RpoH שולט הביטוי של כל א הגדולה מלווה coli והמחיקה שלו ידועה להגדיל sensitivity לתנאי עקה סביבתיים הגורמים חלבון התגלגלות ^15. פעילות המלווה vivo של HdeB נקבע על ידי ניטור יכולתה לדכא את רגישות ה- pH של זן Δ rpoH. בסך הכל, הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק גישה מהירה וישירה לאפיין את הפעילות של מלווה חומצה מופעלת במבחנה וכן בהקשר vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ביטוי טיהור 1. של periplasmic HdeB

הערה: HdeB התבטאה E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB ^10, וטיהר מן periplasm על תמוגה polymyxin.

1. הכן תרבות לילה של E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB ¹⁰ ב 30 מ"ל LB המכיל 200 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין _(AMP LB). לחסן ארבעה 1 תרבויות L של LB _Amp לגדל אותם על 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד עד OD _600nm של 0.7 הוא הגיע. לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרומטר IPTG להשרות את הביטוי של HdeB ולהפחית את הטמפרטורה הצמיחה עד 30 מעלות צלזיוס.
2. אחרי 5 שעות של ביטוי חלבון ב 30 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
3. שטפו את תא גלולה עם 100 מ"ל חיץ (50 מ"מ טריס / HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5) ו צנטריפוגות שוב התאים ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C A.
4. בהמשך לכך, גלולהתא גלול ב 80 מיליליטר הצפה, המכילה 1 מ"ג / סולפט polymyxin מיליליטר. עבור שיבוש יעיל של הממברנה החיצונית, בעדינות מערבבים את ההשעיה עבור שעה 1 ב 4 ° C.
5. כדי להסיר את חלק cytoplasmic ופסולת תאית, צנטריפוגה ההשעיה עבור 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. התוצאה היא ~ 60 מיליליטר supernatant המכיל את HdeB המסיס.
6. Dialyze את supernatant המכיל את תמצית periplasmic לילה נגד נפח 150x של חיץ B (20 מ"מ טריס / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) באמצעות קרום דיאליזה עם 6 kDa MW חתוכים. לרכז את החלבונים עד 15 מ"ל באמצעות יחידות צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. סנן את פתרון החלבון באמצעות מסנן נקבובי 0.2 מיקרומטר.
7. החל את החלבון על טור כרומטוגרפיה אניוני (נפח עמודה 5 מ"ל) כי כבר equilibrated עם B חיץ 5 כרכים עמודה עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min. לאחר החלבון נטען על הטור, לשטוף את העמודה עם החיץ B במשך 10 דקות בשיעור תזרים של 2.5 מ"ל / דקה. Elute HdeB עם שיפוע ליניארי 0 כדי 0.5 M NaCl חיץ B על פני פרק זמן של 50 דקות עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min ^6.
8. לזהות שברים המכילים HdeB באמצעות SDS-PAGE 15%. מערבבים 20 מדגם μl עם 5 μl 5x חיץ טעינת מופחת SDS. טען 10 μl על ג'ל ולהפעיל חיץ טריס-גליצין (גליצין 14.4 גר '/ ל, 2.9 גר' / ל טריס, 1 גר '/ ל סולפט dodecyl נתרן, pH 8.3). הפעל את הג'ל על 150 V עד להקת bromophenol העבירה קרובה לתחתית הג'ל (~ 45 דקות).
9. בריכת כל שברים HdeB המכילים, דיאליזה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 למאגר אחסון L HdeB (50 מ"מ טריס / HCl, 200 מ"מ NaCl, pH 8.0), ולהתרכז החלבון לכ 300 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. קבע את הריכוז של HdeB ב 280 ננומטר באמצעות _280nm ε מקדם הכחדה = 15,595 M ^-1 cm ^-1. כן 100 aliquots μl ופלאש ללאZE את aliquots בחנקן נוזלי.
   הערה: HdeB ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.

2. Assay פעילות הורה מלווה שימוש תרמית התגלגלות dehydrogenase Malate (MDH)

הערה: השפעת HdeB מטוהר על צבירת תרמית התגלגלות dehydrogenase malate המיטוכונדריה החזירית (MDH) בערכי pH שונים הייתה פיקוח כמפורט להלן. כל ריכוזי חלבון המפורטים מתייחסים ריכוז מונומר.

1. כדי להכין MDH, dialyze MDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 C חיץ L (פוספט אשלגן 50 מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ 100 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa.
   הערה: דיאליזה זהירות של MDH נדרשת MDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט.
2. כדי להסיר אגרגטים, בצנטריפוגה חלבון במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז MDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ε _{280 ננומטר = 7,950 M ^-1 cm ^-1). הכן 50 aliquots μl של MDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון.}
3. מניחים קובט קוורץ 1 מ"ל לתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי מצויד מחזיקי מדגם מבוקר טמפרטורה בוחש. הגדר _לשעבר λ _{/ em} ל -350 ננומטר.
4. להוסיף כרכים המתאים של טרום התחמם (43 ° C) חיץ D (150 פוספט אשלגן מ"מ, 150 מ"מ NaCl) על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) כדי קובט וערכת הטמפרטורה של בעל קובט ל -43 מעלות צלזיוס. ההיקף הכולל הוא 1,000 μl.
5. להוסיף 12.5 מיקרומטר HdeB (או לחילופין באותו נפח של למאגר אחסון HdeB על בקרת חיץ) למאגר, ואחריו תוספת של MDH 0.5 מיקרומטר. מתחיל בבקרת פיזור אור. דגירת התגובה עבור 360 שניות כדי לאפשר מספיק התגלגלות של MDH.
6. הרם את pH עד 7 על ידי הוספת נפח 0.16-0.34 מ -2 K unbuffered M ₂ HPO ₄ ולהמשיך מחדשcording פיזור אור עבור 440 אחר שניות.
7. הגדר את מידת הצטברות MDH כי נרשמה בהעדר המלווה בנקודת זמן מוגדרת לאחר הנטרול (כאן אחרי 500 שניות, כאשר פיזור אור המקסימאלי של MDH נצפה) ל -100%. לנרמל פעילות HdeB לאות פיזור אור של MDH בהעדר HdeB בכל ערך pH מצוין.

3. איתור של גיבוש קומפלקס HdeB-LDH ידי אנליטית ultracentrifugation (AUC)

הערה: ניסויים מהירות שקיעה של HdeB לבד או בקומפלקס עם תרמית התגלגלות לקטט דהידרוגנאז (LDH) בוצעו באמצעות ultracentrifuge אנליטי.

1. כדי להכין LDH, dialyze LDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 L חיץ C (50 פוספט אשלגן מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ -200 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa.
   הערה: דיאליזה זהירות של LDH נדרשת LDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט.
2. כדי להסיר אגרגטים, LDH צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז LDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר _{(ננומטר} = ε ₂₈₀ 43,680 M ^-1 cm ^-1). הכן 50 aliquots μl של LDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון.
3. דגירה 3 LDH מיקרומטר בנוכחות והיעדר HdeB 30 מיקרומטר במאגר D (pH 4 ו -7, בהתאמה) במשך 15 דקות ב 41 מעלות צלזיוס.
   הערה: דגירה של LDH לתוצאות טמפרטורות גבוהות ב הצבירה המוחלטת שלה, ואין שפעה מלווה של HdeB ניתן לצפות.
4. תנו דגימות להתקרר לטמפרטורת החדר. ואז, דגימות עומס לתוך התאים המכילים במגזר סטנדרטי בצורת 2 ערוצים מסידורי עם 1.2 ס"מ אורך הדרך. טען את התאים לתוך ultracentrifuge לאזן ל -22 מעלות צלזיוס למשך לפני 1 שעה לפחות כדי שקיעה.
5. ספין דגימות ב 22 ° C ו- 167,000 XG ב הרוטור בהתאמה במשך 12 שעות, ולנטר את sedimentation של חלבון ברציפות ב 280 ננומטר. כפי שתואר קודם לכן, יחס האות לרעש הוא השתפר כאשר עוצמת האור המועברת של כל ערוץ נמדדת ולא ספיג. זה גם משפר את איכות הולם נתונים עקב.
6. לבצע ניתוח נתונים עם SEDFIT (15.01b גרסה, דצמבר 2015), באמצעות ג הרציף מודל ההפצה (הים) ^17. הדרכה המתאר כיצד להשתמש SEDFIT ניתן למצוא התייחסות ^18.
   1. הגדר את רמת הביטחון להסדרת ME (מקסימום אנטרופיה) 0.7.
7. חישוב צפיפות חיץ וכן צמיגות באמצעות SEDNTERP ^19. כדי לאמוד את כמות חלבון הלקוח מצטבר, השווה את אינטגרלים של LDH משקע ב pH 4 ל- pH 7 כהפניה.
   הערה: שילוב של מגרשי הפצת השקיעה יכול להיעשות ישירות SEDFIT. תוכנות חלופיות כדי לנתח נתונים מהירים שקיעה ניתן למצוא בביקורתם אחרונה ^20.

4. ניטור MDH איון והפעלה מחדש בנוכחות HdeB

הערה: השפעת HdeB מטוהר על refolding של pH-פרש MDH נקבעה על ידי ניטור פעילות MDH על הניטרול.

1. דגירה 1 MDH מיקרומטר במאגר D על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) במשך שעה 1 ב 37 ° C בהעדר או בנוכחות HdeB 25 מיקרומטר. לאחר מכן, להעביר את הטמפרטורה ל 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: אין refolding MDH נצפתה אפילו בנוכחות של HdeB כאשר MDH הודגר בטמפרטורות גבוהות מ -37 מעלות צלזיוס.
2. כדי ליזום refolding של MDH מפוגל חומצה, לנטרל את דגימות ה- pH 7 על ידי תוספת של נפח 0.13-0.42 של 0.5 M פוספט נתרן, pH 8.0.
3. לאחר דגירה עבור שעה 2 ב 20 מעלות צלזיוס, לקבוע פעילות MDH על ידי ניטור ירידה של NADH ב 340 ⁹ ננומטר.
   הערה: MDH מזרז את הירידה תלויה-NADH של oxaloacetate לתוך L-Malate.
   1. מערבבים 50 μl של התגובה הדגירה עם 950 μl של חיץ assay (פוספט נתרן 50 מ"מ, pH 8.0, 1 מ"מ oxaloacetate, ו -150 מיקרומטר NADH).
      הערה: הריכוז הסופי של MDH למאגר assay צריך להיות 44 ננומטר.
   2. לפקח על השינוי ספיג באמצעות ספקטרופוטומטר, מצויד בלוק בקרת טמפרטורת פלטייה מוגדר 20 ° C.
   3. דווח על יחסי פעילות MDH ל -44 ננומטר יליד MDH כי נשמר ב- pH 7.0.

5. השפעת HdeB התבטאות יתר על E. coli הישרדות תחת מתח חומצה

הערה: E. coli MG1655 הדנ"א הגנומי היה מבודד באמצעות פרוטוקול שפורסם ^21.

1. להגביר hdeB מ E. MG1655 coli על ידי PCR באמצעות hdeB פריימרים - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT GTC CAA ATT CGG ו hdeB - Ecor I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC ג
2. הגדר את תגובת PCR ב 50 μl כדלקמן: 10 μl חיץ פולימראז 5x, 200 מיקרומטר dNTPs, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD2, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD5, 150 ng MG1655 הדנ"א הגנומי, 0.5 DNA פולימרז μl, להוסיף DDH ₂ O עד 50 μl.
3. בצע הגברה של hdeB כדלקמן: שלב 1: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 1 מחזור; צעד 2: 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים; שלב 3: 10 דק 'ב 72 מעלות צלזיוס.
4. Clone וכתוצאה מכך שבר PCR לתוך האתרים Ecor אני BamH לי של פלסמיד pBAD18 באמצעות שיטות סטנדרטיות עבור שיבוט אתר הגבלה. לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד פי הוראות היצרן. בדוק את הפלסמיד שהתקבל על ידי רצף ^10.
5. להפוך את הפלסמיד להביע HdeB או pBAD18 בקרת וקטור ריק לתוך BB7224 זן (Δ rpoH) (גנוטיפ: F ^-, λ ^-, E14 ^-, [araD139] _{B / [r}6; (argF-לאק) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 ארד ⁺ rpoH :: kan ^{+; 16)} באמצעות תאים מוסמכים כימי.
   הערה: זן זה הוא רגיש לטמפרטורה.
6. לאחר 45 שניות-הלם חום על 42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד. בצע פס-outs מושבה אחת של שיבוטים חיובי דגירה לילה בשעה 30 ° C. הכן תרבות הלילה ב 50 מ"ל LB _Amp ולטפח את התאים ב 200 סל"ד ו -30 מעלות צלזיוס.
7. לדלל תרבויות לילה פי 40 ל -25 מ"ל LB _Amp ולגדול החיידקים בנוכחות 0.5% arabinose (Ara) על 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד ל _600nm OD = 1.0 להשרות ביטוי חלבון HdeB.
8. עבור ניסויי משמרת pH, השתמש LBAmp + ערה לדלל את התאים OD _600nm של 0.5 ולהתאים לערכי pH בהתאמה (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0) על ידי הוספת כמויות מתאימות של 5 M HCl.
9. לאחר שהוחלט על נקודות זמן המצוינות (pH 2, 1 דקות; pH 3, 2.5 דקות, pH 4, 30 דק '), לנטרל את התרבויות על ידי תוספת של הכרכים המתאימים של 5 M NaOH.
10. לפקח על הצמיחה של התרבויות לנטרל בתרבות הנוזלית במשך 12 שעות ב 30 ° C באמצעות מדידות OD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

HdeA ו HdeB הם הומולוגיים E. חלבונים coli, ידוע להגן חלבונים periplasmic נגד בתנאי עקה חומצה ^10. העבודה שלנו גילתה כי בדומה HdeA, HdeB מתפקד גם בתור חומצה מופעלת מלווה מולקולרי. עם זאת, בניגוד HdeA, פונקציות HdeB ב- pH כי הוא עדיין פוטנציאל bactericidal, אך גבוה משמע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

על מנת ללמוד את המנגנון של הפעלה מלווה פונקציה של HdeB, כמויות גדולות של HdeB צריכים לבוא לידי ביטוי ו מטוהר. מספר מערכות וקטור ביטוי זמינים לייצור רמות גבוהות של חלבון המטרה, כולל וקטורים pTrc או pBAD, אשר שניהם שימשו במחקר זה. היזמים נגישים בקלות עבור E. RNA פולימראז c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786