Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Résumé

Cette étude décrit les techniques biophysiques, biochimiques et moléculaires permettant de caractériser l'activité de chaperon d'Escherichia coli HdeB dans des conditions de pH acides. Ces méthodes ont été appliquées avec succès pour d'autres chaperons acide de protection tels que HdeA et peuvent être modifiés pour travailler pour d'autres chaperons et des conditions de stress.

Résumé

Les bactéries sont fréquemment exposés à des changements environnementaux, tels que les modifications de pH, de la température, de l'état redox, exposition à la lumière ou de force mécanique. Beaucoup de ces conditions provoquer le dépliement des protéines dans la cellule et avoir un impact négatif sur la survie de l'organisme. Un groupe de, chaperons moléculaires spécifiques de stress non apparentés ont été montré à jouer un rôle essentiel dans la survie de ces conditions de stress. Bien que complètement plié et chaperon inactif avant stress, ces protéines se dérouler rapidement et devenir chaperon active dans des conditions de stress spécifiques. Une fois activé, ces chaperons conditionnellement désordonnés se lient à un grand nombre de protéines différentes de l'agrégation sujette, de prévenir leur agglomération et de faciliter, soit directement, soit indirectement repliement des protéines lors du retour à des conditions non stressantes. La principale méthode pour obtenir une compréhension plus détaillée sur le mécanisme de leur reconnaissance d'activation et le client implique la purification et subsequent caractérisation de ces protéines en utilisant dans des essais in vitro chaperons. Suivi in vivo des tests de stress sont absolument essentiels pour confirmer indépendamment l'obtenu dans les résultats in vitro.

Ce protocole décrit in vitro et in vivo des méthodes pour caractériser l'activité de chaperon de E. coli HdeB, un chaperon activé par un acide. Les mesures de diffusion de la lumière ont été utilisées comme une lecture commode pour la capacité de HdeB pour empêcher l' agrégation induite par l' acide d'une protéine cliente du modèle établi, MDH, in vitro. expériences d'ultracentrifugation analytique ont été appliquées pour révéler la formation complexe entre HdeB et son LDH de protéine de client, de faire la lumière sur le sort des protéines clientes à leur retour à des conditions non stressantes. des dosages d'activité enzymatique des protéines clientes ont été réalisées pour évaluer les effets de l'inactivation HdeB sur le client et la réactivation induite par le pH. Enfin, des études de survie ont été utilisés pour monitor l'influence de la fonction de chaperon de HdeB in vivo.

Introduction

Un environnement naturel commun dans lequel les agents pathogènes microbiens expérience protéines conditions qui se déroulent à l' acide induite est l'estomac des mammifères (plage de pH 1-4), dont le pH acide sert une barrière efficace contre les agents pathogènes d'origine alimentaire ^1. Dépliement des protéines et de l' agrégation, qui est causée par la protonation de la chaîne latérale d'acides aminés, affectent les processus biologiques, endommage les structures cellulaires et provoque finalement la mort cellulaire ^1,2. Etant donné que le pH du périplasme bactérien s'équilibre presque instantanément le pH de l' environnement due à la diffusion libre des protons à travers la membrane externe poreuse, les protéines de la membrane périplasmique et internes des bactéries Gram-négatives sont des composants cellulaires les plus vulnérables dans des conditions acides au stress ^3. Pour protéger leur protéome périplasmique contre les dommages induits par l'acide rapide, les bactéries Gram-négatives utilisent les chaperons périplasmiques activés par un acide et HdeA HdeB. HdeA est un chaperon conditionnellement désordonné ^{4,5: A pH neutre, HdeA est présente sous forme repliée, dimère de chaperon inactif. Après un changement de pH inférieur à pH 3, la fonction de chaperon de HdeA est rapidement activé 6,7. L' activation de HdeA nécessite de profonds changements structurels, y compris sa dissociation en monomères, et le dépliement partiel des monomères 6-8. Une fois activé, HdeA se lie aux protéines qui se déroulent dans des conditions acides. Il empêche efficacement leur agrégation à la fois au cours de l'incubation à faible pH, ainsi que sur la neutralisation du pH. Lors du retour à pH 7,0, HdeA facilite le repliement de ses protéines clientes de manière ATP-indépendante et reconvertit en son dimère, conformation chaperonner-inactive 9. De même, le chaperon HdeB homologue est également chaperon inactif à un pH de 7,0. Contrairement à HdeA, cependant, l'activité de chaperon de HdeB atteint son maximum apparent à pH 4,0, les conditions dans lesquelles HdeB est encore largement plié et dimères 10. De plus, abaissant encore les caus de pHes l'inactivation de HdeB. Ces résultats suggèrent que, malgré leur grande homologie, HdeA et HdeB diffèrent dans leur mode d'activation fonctionnelle qui leur permet de couvrir une large gamme de pH avec leur fonction protectrice de chaperon. Une autre protéine chaperon qui a été impliquée dans la résistance à l' acide de E. coli est la Hsp31 cytoplasmique, qui semble stabiliser les protéines clientes dépliés jusqu'à des conditions neutres soient rétablies. Le mode précis de l'action de Hsp31, cependant, est resté énigmatique 12. Étant donné que d' autres bactéries entéropathogènes telles que Salmonella manquent l'opéron hdeAB, il est très probable que d' autres chaperons périplasmiques non encore identifiés pourraient existent qui sont impliqués dans la résistance aux acides de ces bactéries 11.}

Les protocoles présentés ici permettent de surveiller l'activité de chaperon dépendant du pH HdeB in vitro et in vivo , ¹⁰ et peuvent être appliqués pour étudier d' autres chaperonstelles que Hsp31. En variante, le réseau complexe de facteurs de transcription qui contrôlent l'expression des hdeAB peut potentiellement être étudiée par le test in vivo du stress. Afin de caractériser la fonction de chaperon de protéines in vivo, les différentes configurations expérimentales peuvent être appliquées. Une voie est d'appliquer la protéine dépliage des conditions de stress et de caractériser les souches mutantes phénotypique que soit surexpriment le gène d'intérêt ou de porter une délétion du gène. Des études protéomiques peuvent être menées pour identifier les protéines qui ne sont plus globale dans des conditions de stress lorsque le chaperon est présent, ou l'influence d'un chaperon sur une enzyme spécifique peut être déterminée dans des conditions de stress à l' aide de dosages enzymatiques ^14-16. Dans cette étude, nous avons choisi de surexprimer HdeB dans une souche rpoH de suppression, qui n'a pas le choc thermique facteur sigma 32. rpoH contrôle l'expression de tous les principaux E. chaperons coli et sa suppression est connu pour augmenter sensibilité à des conditions de stress environnementaux qui causent le dépliement des protéines ^15. L'activité in vivo dans le chaperon de HdeB a été déterminée en surveillant sa capacité à supprimer la sensibilité au pH de la souche Δ rpoH. Au total, les protocoles présentés ici fournissent une méthode rapide et simple pour caractériser l'activité d'un chaperon activé par un acide in vitro ainsi que dans le contexte in vivo.

Protocole

1. Expression et purification de périplasmique HdeB

REMARQUE: HdeB a été exprimée dans E. cellules de E. coli hébergeant le plasmide pTrc- hdeB ^10, et purifié à partir du périplasme lors de la lyse polymyxine.

1. Préparer une culture de nuit de E. cellules de E. coli hébergeant le plasmide pTrc- hdeB ¹⁰ dans 30 ml de LB contenant 200 ug / ml d' ampicilline (LB _Amp). Inoculer quatre cultures 1 L de LB _Amp et les cultiver à 37 ° C et 200 rpm jusqu'à OD _600nm de 0,7 soit atteint. Ensuite, ajouter 300 uM d'IPTG pour induire l'expression de HdeB et de diminuer la température de croissance à 30 ° C.
2. Au bout de 5 h d'expression de la protéine à 30 ° C, récolter les cellules par centrifugation à 8000 g pendant 5 min à 4 ° C.
3. Laver le culot cellulaire avec 100 ml de tampon A (Tris / HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) et centrifuger les cellules à nouveau à 8000 g pendant 5 min à 4 ° C.
4. Par la suite, resuspendrele culot cellulaire dans 80 ml de tampon A contenant 1 mg / ml de sulfate de polymyxine. Pour perturber l'efficacité de la membrane externe, remuez doucement la suspension pendant 1 heure à 4 ° C.
5. Pour enlever la fraction cytoplasmique et les débris cellulaires, centrifuger la suspension pendant 20 min à 15 000 xg à 4 ° C. Cela se traduit par ~ 60 ml de surnageant contenant le HdeB soluble.
6. Dialyser le surnageant contenant l'extrait périplasmique par rapport au volume pendant une nuit 150x de tampon B (Tris / HCl 20 mM, EDTA 0,5, pH 8,0) en utilisant une membrane de dialyse de 6 kDa MW de coupure. On concentre les protéines de 15 ml en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure de 3 kDa. Filtrer la solution de protéine en utilisant un filtre de 0,2 um pores.
7. Appliquer la protéine sur une colonne de chromatographie échangeuse d'anions (volume de colonne de 5 ml) qui a été équilibrée avec 5 volumes de colonne de tampon B avec un débit de 2,5 ml / min. Une fois que la protéine est chargée sur la colonne, laver la colonne avec du tampon B pendant 10 min àun débit de 2,5 ml / min. Éluer HdeB avec un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de NaCl dans le tampon B sur une période de temps de 50 min avec un débit de 2,5 ml / min ⁶ écoulement.
8. Identifier les fractions contenant HdeB en utilisant une SDS-PAGE à 15%. Mélanger 20 pi d'échantillon avec 5 pi de 5x tampon de chargement SDS réduite. Charge 10 pi sur le gel et fonctionner dans un tampon Tris-glycine (14,4 g / L de glycine, 2,9 g / L de Tris, 1 g / L de dodécyl sulfate de sodium, pH 8,3). Exécuter le gel à 150 V jusqu'à ce que la bande de bromophénol ait migré à proximité du fond du gel (~ 45 min).
9. Piscine all fractions HdeB contenant, on dialyse à 4 ° C pendant une nuit contre 4 litres de tampon de stockage de HdeB (50 mM de Tris / HCl, 200 mM de NaCl, pH 8,0) et on concentre la protéine à environ 300 um en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire coupure de 3 kDa. Déterminer la concentration de HdeB à 280 nm en utilisant le coefficient d' extinction ε _280nm = 15595 M ^-1 cm ^-1. Préparer des aliquotes de 100 pi et sans flashze aliquotes dans l'azote liquide.
   REMARQUE: HdeB peut être conservé à -70 ° C pendant au moins 6 mois.

2. Chaperone Essai d'activité utilisant Thermiquement dépliage Malate déshydrogénase (MDH)

NOTE: L'influence de HdeB purifiée sur l'agrégation de dépliage thermique porcine malate déshydrogénase mitochondriale (MDH) à différentes valeurs de pH a été contrôlé comme décrit ci-dessous. Toutes les concentrations de protéines citées, se référer à la concentration du monomère.

1. Pour préparer MDH dialyser MDH à 4 ° C pendant une nuit contre 4 litres de tampon C (mM de phosphate de potassium 50 mM, NaCl 50, pH 7,5) et on concentre la protéine à environ 100 uM en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure de 30 kDa.
   REMARQUE: la dialyse attentive de MDH est nécessaire que MDH est livré sous forme de solution de sulfate d'ammonium.
2. Pour éliminer les agrégats, centrifuger la protéine pendant 20 min à 20 000 xg à 4 ° C. Déterminer la concentration MDH par absorbance à 280 nm (ε _{280 nm = 7,950 M ^-1 cm ^-1). Préparer 50 aliquotes pi de MDH et flash-geler les aliquotes pour le stockage.}
3. Placer 1 ml cuvette de quartz dans un spectrophotomètre à fluorescence équipé avec porte et agitateur d'échantillons à température contrôlée. Définir _ex λ _{/ em} à 350 nm.
4. Ajouter des volumes appropriés de préchauffée (43 ° C) du tampon D (150 mM de phosphate de potassium, 150 mM de NaCl) aux valeurs souhaitées de pH (ici: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 et pH 5,0) à la cuve et fixé la température dans le support de cuvette à 43 ° C. Le volume total est de 1000 pi.
5. Ajouter 12,5 uM HdeB (ou en variante le même volume de tampon de stockage HdeB pour le contrôle du tampon) dans la mémoire tampon, suivi par l'addition de 0,5 uM MDH. Commencez la surveillance diffusion de la lumière. Incuber la réaction pendant 360 secondes pour permettre suffisante déploiement de MDH.
6. Soulever le pH à 7 en ajoutant 0,16 à 0,34 volume de 2 M unbuffered K ₂ HPO ₄ et continuer reCording diffusion de la lumière pour un autre 440 sec.
7. Réglez le degré d'agrégation MDH qui est enregistré en l'absence du chaperon à un point de temps défini après neutralisation (ici après 500 secondes, lorsque maximale diffusion de la lumière du MDH a été observée) à 100%. Normaliser l'activité de HdeB au signal de dispersion de la lumière de la MDH en l'absence de HdeB à chaque valeur de pH indiquée.

3. Détection de HdeB-LDH Formation complexe par ultracentrifugation analytique (Auc)

NOTE: Sédimentation expériences de vitesse de HdeB seul ou en complexe avec dépliage thermique lactate déshydrogénase (LDH) ont été effectuées en utilisant une ultracentrifugation analytique.

1. Pour préparer la LDH dialyser LDH à 4 ° C pendant une nuit contre 4 litres de tampon C (mM de phosphate 50 de potassium, 50 mM de NaCl, pH 7,5) et on concentre la protéine à environ 200 um en utilisant des unités de filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure de 30 kDa.
   NOTE: la dialyse attentive de la LDH est nécessaire que LDH est fournie sous forme de solution de sulfate d'ammonium.
2. Pour éliminer les agrégats, centrifugeuse LDH pendant 20 min à 20 000 xg à 4 ° C. Déterminer la concentration de LDH par absorbance à 280 nm _{(280 nm} ε = 43680 M ^-1 cm ^-1). Préparer 50 aliquotes ul de LDH et flash-geler les aliquotes pour le stockage.
3. Incuber 3 uM de LDH en présence et en l'absence de 30 pM HdeB dans du tampon D (pH 4 et 7, respectivement) pendant 15 min à 41 ° C.
   NOTE: L'incubation de la LDH à des résultats plus élevés des températures dans son agrégation complète, et aucun effet chaperonne de HdeB peuvent être observées.
4. Laissez les échantillons refroidir à la température ambiante. Ensuite, des échantillons de charge dans des cellules contenant secteur norme en forme de centres de 2 canaux avec 1,2 cm de trajet. Charger les cellules dans le ultracentrifugation et équilibrer à 22 ° C pendant au moins 1 heure avant la sédimentation.
5. Des échantillons de Spin à 22 ° C et 167.000 xg dans le rotor respectif pendant 12 heures, et surveiller la sedimentation de la protéine en continu à 280 nm. Comme il est démontré précédemment, le rapport signal sur bruit est amélioré lorsque l'intensité lumineuse transmise de chaque canal est mesurée plutôt que l'absorbance. Ceci améliore également la qualité du montage ultérieur des données.
6. Procéder à l' analyse des données avec SEDFIT (version 15.01b, Décembre 2015), en utilisant le modèle c continu (s) de distribution ^17. Un tutoriel décrivant comment utiliser SEDFIT peut être trouvé dans la référence ^18.
   1. Réglez le niveau de confiance pour la régularisation ME (Maximum Entropy) à 0,7.
7. Calculer la densité du tampon ainsi que la viscosité en utilisant SEDNTERP ^19. Pour estimer la quantité de protéine client agrégée, comparez les intégrales de LDH sédimenté dans pH 4 à pH 7 comme une référence.
   NOTE: L'intégration des parcelles de distribution de sédimentation peut être fait directement dans SEDFIT. Logiciel alternatif pour analyser les données de vitesse de sédimentation peut être trouvée dans une étude récente ^20.

4. Suivi MDH Inactivation et Réactivation en présence de HdeB

NOTE: L'influence de HdeB purifiée sur le repliement de pH-déplié MDH a été déterminée en surveillant l'activité de MDH lors de la neutralisation.

1. Incuber 1 uM dans du tampon D MDH aux valeurs souhaitées de pH (ici: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 et pH 5,0) pendant 1 heure à 37 ° C en l'absence ou en présence de 25 pM HdeB. Ensuite, faire passer la température à 20 ° C pendant 10 min.
   NOTE: Aucune MDH repliement a été observée, même en présence de HdeB lorsque MDH a été incubée à des températures supérieures à 37 ° C.
2. Pour amorcer le repliage de l'acide dénaturé MDH, de neutraliser les échantillons à pH 7 par addition de 0,13 à 0,42 volume de phosphate de sodium 0,5 M, pH 8,0.
3. Après incubation pendant 2 heures à 20 ° C, de déterminer l' activité de la MDH en surveillant la diminution du NADH à 340 nm ^9.
   REMARQUE: MDH catalyse la réduction de la NADH-dépendante de l'oxaloacétate en L-malate.
   1. Mélanger 50 ul de la réaction d'incubation avec 950 ul de tampon de dosage (phosphate de sodium 50 mM, pH 8,0, 1 mM de l'oxaloacétate et de 150 uM de NADH).
      REMARQUE: La concentration finale de la MDH dans le tampon d'essai doit être de 44 nm.
   2. Surveiller le changement d'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre, équipé d'un bloc de contrôle de la température Peltier réglé à 20 ° C.
   3. Signaler l'activité MDH par rapport à 44 nM natif MDH qui a été maintenu à un pH de 7,0.

5. Effet de HdeB surexpression sur E. coli Survie sous stress acide

NOTE: E. coli MG1655 ADN génomique a été isolé à l' aide d' un protocole publié ^21.

1. Amplifier hdeB de E. coli MG1655 par PCR en utilisant des amorces hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT et hdeB - EcoR I-fw GGT CCG GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. Mettre en place la réaction PCR dans 50 ul comme suit: 10 ul de 5 x tampon de polymerase, 200 uM de dNTP, 0,5 uM d' amorce JUD2, 0,5 pM d' amorce JUD5, 150 ng MG1655 d'ADN génomique, 0,5 ul d'ADN polymerase, ajouter ddH ₂ O à 50 ul.
3. Effectuer l' amplification de hdeB comme suit: Etape 1: 5 min à 95 ° C, 1 cycle; étape 2: 30 sec à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, 30 s à 72 ° C, 40 cycles; Étape 3: 10 min à 72 ° C.
4. Clone résultant fragment PCR dans les sites EcoR I et BamH I du plasmide pBAD18 en utilisant des méthodes standard pour site de restriction clonage. On purifie le plasmide en utilisant un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant. Vérifier le plasmide obtenu par séquençage ^10.
5. Transformer le plasmide exprimant HdeB ou la régulation vectorielle pBAD18 vides dans la souche BB7224 (Δ rpoH) (génotype: F ^-, λ ^-, e14 ^-, [araD139] _{B / r} [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 araD ⁺ rpoH :: kan ^{+; 16)} en utilisant des cellules chimiquement compétentes.
   NOTE: Cette souche est sensible à la température.
6. Au bout de 45 secondes de choc thermique à 42 ° C et avant le placage, incuber les cellules à 30 ° C et à 200 tours par minute. Effectuer colonie streak-outs individuels des clones positifs et incuber une nuit à 30 ° C. Préparer une culture de nuit dans 50 ml de LB _Amp et cultiver les cellules à 200 tpm et 30 ° C.
7. Diluer les cultures d'une nuit de 40 fois dans 25 ml de LB _Amp et cultiver les bactéries en présence de 0,5% d' arabinose (Ara) à 30 ° C et à 200 tours par minute à une DO _600nm = 1,0 pour induire l' expression des protéines HdeB.
8. Pour les expériences pH de décalage, utilisez LBAmp + Ara pour diluer les cellules à OD _600nm de 0,5 et ajuster aux valeurs respectives de pH (ici: pH 2,0, pH 3,0, et un pH de 4,0) en ajoutant des volumes appropriés de HCl 5 M.
9. Une fois les points temporels indiqués (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min, pH 4, 30 min), de neutraliser les cultures en ajoutant les volumes appropriés de NaOH 5M.
10. Surveiller la croissance des cultures neutralisées en culture liquide pendant 12 heures à 30 ° C en utilisant des mesures de densité optique.

Résultats

HdeA et HdeB sont homologues E. protéines coli, connus pour protéger les protéines périplasmiques contre les conditions de stress acide ^10. Notre travail a révélé que semblable à HdeA, HdeB fonctionne également comme un acide activé chaperon moléculaire. Cependant, contrairement aux fonctions HdeA, HdeB à un pH qui est toujours potentiellement bactéricide, mais nettement plus élevée que l'optimum de pH de HdeA ^6,9,10,22. Afin d&#...

Discussion

Afin d'étudier le mécanisme d'activation et la fonction de chaperon HdeB, de grandes quantités de HdeB doivent être exprimés et purifiés. Un certain nombre de systèmes de vecteurs d'expression sont disponibles pour la production de niveaux élevés d'une protéine cible, y compris les vecteurs pTrc ou pBAD, dont les deux ont été utilisés dans cette étude. Les promoteurs sont facilement accessibles pour E. coli ARN polymérase et d' expression permettent ainsi fortement régu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786