のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

要約

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。

要約

細菌は、しばしば、このようなpHの変化、温度、酸化還元状態、露光又は機械力などの環境の変化にさらされています。これらの条件の多くは、細胞内のタンパク質のアンフォールディングを引き起こし、生物の生存に有害な影響を与えます。無関係な、ストレス特異的分子シャペロンのグループは、これらのストレス条件の生存に不可欠な役割を果たすことが示されています。完全に折り畳まれてシャペロン非アクティブなストレスの前にしながら、これらのタンパク質は急速に展開し、特定のストレス条件下でシャペロン活性になります。一度これらの条件付きで無秩序シャペロンは異なる凝集しやすい多数のタンパク質に結合し、活性化し、その凝集を防止し、直接または間接的に非ストレス状態への復帰時にリフォールディングタンパク質を容易にします。それらの活性化とクライアントの認識のメカニズムについてのより詳細な理解を得るための第一のアプローチは、精製およびsubsequenを伴いますインビトロシャペロンアッセイを使用して、これらのタンパク質のTの特徴付け。 生体内ストレスアッセイにおけるフォローアップ独立インビトロの結果で得られたことを確認することが不可欠です。

このプロトコルは、Eのシャペロン活性を特徴づけるために、in vitroおよびin vivoの方法で説明し大腸菌 HdeB、酸活性化シャペロン。光散乱測定は、インビトロで 、確立されたモデルのクライアントタンパク質、MDHの酸誘発性の凝集を防止するHdeBの能力のための便利な読み出しとして使用しました。分析超遠心分離実験は、非ストレス状態への復帰時のクライアントタンパク質の運命に光を当てるために、HdeBとそのクライアントタンパク質のLDHとの間の複合体形成を明らかにするために適用しました。クライアントタンパク質の酵素活性アッセイは、pHによって誘発されるクライアントの不活性化および再活性化にHdeBの効果をモニターするために行きました。最後に、生存研究はmonitoするために使用されましたin vivoでの HdeBのシャペロン機能の影響をrを。

概要

微生物病原体は、酸誘発タンパク質アンフォールディング状態を経験する一般的な自然環境は、その酸性pH食品媒介病原体¹に対する有効な障壁として機能する哺乳動物の胃（pH範囲1-4）、です。アミノ酸側鎖のプロトン化に起因するタンパク質のアンフォールディング及び凝集は、生物学的プロセス、損傷細胞構造に影響を与え、最終的に細胞死^1,2を引き起こします。細菌のペリプラズムのpHは多孔性の外膜を通過するプロトンの自由拡散にほぼ瞬時に環境pHと平衡するので、グラム陰性細菌のペリプラズムと内側の膜タンパク質は、酸ストレス条件³の下で最も脆弱な細胞成分です。急速な酸の仲介による損傷に対する彼らのペリプラズムプロテオームを保護するために、グラム陰性菌は、酸活性化ペリプラズムシャペロンHdeAとHdeBを利用します。 HdeAは条件付きで無秩序シャペロンであります ^{4,5：中性pHでは、HdeAは折り畳まれ、シャペロン不活性な二量体として存在します。 pHが3以下のpHシフトの際に、HdeAのシャペロン機能は、6,7を速やかに活性化されます。 HdeAの活性化は、その単量体への解離、およびモノマー6-8の展開部分を含む深刻な構造変化を、必要とします。一旦活性化されると、HdeAは酸性条件下で展開するタンパク質に特異的に結合します。これは、効果的に低pHでのインキュベーションの間だけでなく、pHを中和時に両方の彼らの凝集を防ぐことができます。 pHを7.0に復帰する、HdeAはATP非依存的にそのクライアントタンパク質のリフォールディングを促進し、その二量体、シャペロン不活性なコンフォメーション9に戻って変換されます。同様に、相同的シャペロンHdeBもシャペロン不活性をpH7.0です。 HdeAとは異なり、HdeBのシャペロン活性は、pH4.0のHdeBが依然として大きく折り畳ま10ダイマーされる条件を、その見かけの最大値に達します。また、さらにpHがコーを下げますHdeBの不活化エス。これらの結果は、それらの広範な相同性にもかかわらず、HdeAとHdeBが彼らの保護シャペロン機能を有する広いpH範囲をカバーすることを可能にする機能的活性化のそれらのモードで異なることを示唆しています。 E.の耐酸性に関与している一つの他のシャペロン大腸菌は中立状態が復元されるまで、折り畳まれていないクライアントタンパク質を安定化させるために表示される、細胞質Hsp31です。 Hsp31の正確な作用モードは、しかし、12謎のままです。このようなサルモネラなどの他の腸内細菌がhdeABオペロンを欠いていることを考えると、他のまだ正体不明のペリプラズムのシャペロンはこれらの細菌11の耐酸性に関与していることが存在するかもしれない可能性が非常に高いです。}

ここに提示プロトコルは、 インビトロおよびインビボ¹⁰ HdeBのpH依存シャペロン活性を監視することを可能にし、他のシャペロンを調査するために適用することができますHsp31など。あるいは、hdeABの発現を制御する転写因子の複雑なネットワークは、潜在的に、インビボでの応力アッセイにより調べることができます。 インビボでのタンパク質のシャペロン機能を特徴づけるために、異なる実験のセットアップを適用することができます。一つの経路は、タンパク質アンフォールディングストレス条件を適用して表現型のいずれかは、対象の遺伝子を過剰発現または遺伝子の欠失を担持する変異株を特徴付けることです。プロテオミクス研究はシャペロンが存在する場合、ストレス条件下で凝集体はもはやそのタンパク質を同定しないように実施することができる、または特定の酵素に対するシャペロンの影響は、酵素アッセイ^14〜16を用いてストレス状態の間に決定することができます。本研究では、すべての主要なEの発現を制御するRpoH熱ショックシグマ因子32を欠いているrpoH欠失株でHdeBを過剰発現することを選びました大腸菌のシャペロンとその削除はSENSを増加することが知られています^15のタンパク質のアンフォールディングを引き起こす環境ストレス条件にitivity。 HdeBのインビボシャペロン活性をΔrpoH株のpH感受性を抑制する能力をモニターすることによって決定しました。要するに、ここで紹介するプロトコルは、in vitroならびに in vivoでのコンテキストで酸活性化シャペロンの活性を特徴づけるための迅速かつ簡単な方法を提供します。

プロトコル

ペリプラズムHdeBの1発現および精製

注：HdeBはEに発現していました大腸菌細胞はプラスミドpTrc- hdeB ^10、およびポリミキシン溶解時のペリプラズムから精製を保有。

1. E.の一晩培養物を準備します200 / mlのアンピシリン（LB _{アンプ）を}含有_する 30ミリリットルのLB中でプラスミドpTrc- hdeB ^10を保有^する 大腸菌細胞。 LB _アンプ 4つの1リットル培養物を接種し、0.7のOD _{600nmまでに}達するまで37℃、200rpmでそれらを成長させます。そして、HdeBの発現を誘導し、30℃の成長温度を低下させるために300μMのIPTGを加えます。
2. 30℃でのタンパク質の発現の5時間後、4℃で5分間、8,000×gでの遠心分離によって細胞を回収。
3. 100で細胞ペレットを4℃で5分間、8,000×gで再び細胞を（50 mMトリス/塩酸、50mMのNaCl、pH7.5）で遠心バッファmlの洗浄。
4. その後、再懸濁80で細胞ペレットは、ML 1mg / mlのポリミキシン硫酸塩を含む、緩衝液。外膜の効率的な破壊のために、穏やかに4°Cで1時間サスペンションをかき混ぜます。
5. 細胞質画分と細胞破片を除去し、4℃で15,000×gで20分間、懸濁液を遠心します。これは、可溶性HdeBを含む〜60ミリリットルの上清になります。
6. 6 kDaのMWを持つ透析膜を用いて緩衝液B（20mMトリス/塩酸、0.5mMのEDTA、pH8.0）を150倍体積に対して一晩ペリプラズム抽出物を含む上清を透析カットオフ。 3キロダルトンの分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して、15 mlのタンパク質を濃縮します。 0.2μmの細孔フィルターを使用して、タンパク質溶液をフィルタリングします。
7. 2.5ml /分の流速で5カラム容量の緩衝液Bで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（カラム体積5ml）中にタンパク質を適用します。タンパク質をカラムにロードされると、10分のための緩衝液Bでカラムを洗浄します2.5ml /分の流速。 2.5ml /分⁶の流量で50分の期間にわたって緩衝液B中の0.5 M NaClの0からの直線勾配で溶出HdeB。
8. 15％SDS-PAGEを使用してHdeBを含む画分を特定します。 5μlの5倍還元SDSローディング緩衝液と20μlのサンプルを混ぜます。負荷10μlのゲル上及びトリス - グリシン緩衝液（14.4グラム/ Lグリシン2.9グラム/ LのTris、を1g / Lのドデシル硫酸ナトリウム、pHが8.3）で実行します。ブロモフェノールバンドがゲル（〜45分）の底に近い移動するまで、150Vでゲルを実行します。
9. プールのすべてのHdeB含有画分、4 L HdeB貯蔵緩衝液に対して4℃で一晩透析（50mMトリス/塩酸、200mMのNaCl、pH8.0）に、および分子量遠心分離フィルターユニットを用いて、約300μMにタンパク質を集中3キロダルトンのカットオフ。吸光係数εの_280nmの = 15595 Mを使用して280nmでHdeBの濃度を決定^-1 cm ^{-1 で} 。 100μlのアリコートとフラッシュフリーの準備液体窒素でアリコートをZE。
   注：HdeBは、少なくとも6ヶ月間-70℃で保存することができます。

2.シャペロン活性アッセイリンゴ酸脱水素をアンフォールディング熱の使用（MDH）

注：下記のように熱的に異なるpH値でのブタのミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素（MDH）のアンフォールディングの凝集で精製HdeBの影響をモニターしました。リストされたすべてのタンパク質濃度は、モノマー濃度を参照してください。

1. 、MDHを準備4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩MDHを透析し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約100μMにタンパク質を濃縮しますkDaの。
   注：MDHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されるようMDHの慎重な透析が必要となります。
2. 凝集物を除去するために、4℃、20,000×gで20分間、タンパク質を遠心します。 ε（280nmでの吸光度によってMDH濃度を決定します<サブ> 280ナノメートル= 7,950 M ^-1 cm ^-1で）。 50μlのMDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。
3. 温度制御サンプルホルダー、撹拌機を備えた蛍光分光光度計に1ミリリットルの石英キュベットを置きます。 350 nmの_{λEX /全角を}設定_します 。
4. キュベットとセットに：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値で予め温めた（43℃）緩衝液D（150 mMリン酸カリウム、150mMのNaCl）の適切なボリュームを追加します。 43℃にキュベットホルダーの温度。総容量1000μlです。
5. 0.5μMMDHを添加し、バッファ12.5μMHdeB（またはバッファ制御用HdeB記憶バッファの代わりに同量）を加えます。光散乱の監視を開始。 MDHの展開十分可能にするために360秒間の反応をインキュベートします。
6. 2 MバッファなしのK ₂ HPO ₄の0.16から0.34容量を追加することによって、pHを7に上げ、再続けます別の440秒間光散乱をコーディング。
7. 中和後に定義された時点におけるシャペロンの非存在下で記録されたMDH凝集の程度を設定し、100％の（ここではMDHの最大光散乱が観察された500秒後）。各示されたpH値でHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号にHdeBの活動を正常化します。

分析超遠心（AUC）によるHdeB-LDH複合体形成の3検出

注：HdeB単独で又は熱的に乳酸脱水素酵素（LDH）の展開との複合体の沈降速度実験は、分析用超遠心を用いて行きました。

1. 4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩LDHを透析、LDHを調製し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約200μmでタンパク質を濃縮しますkDaの。
   注：LDHの慎重な透析をLDとして必要とされていますHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されます。
2. 骨材、4℃20,000×gで20分間遠心分離LDHを削除します。 280nmでの吸光度によってLDH濃度を測定_{（ε280nmで} = 43680 M ^-1 cm ^{-1 で} ）。 50μlのLDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。
3. 41℃で15分間（それぞれpHは4と7、）バッファーDで30μMHdeBの存在下および非存在下で3μMのLDHをインキュベートします。
   注：その完全な凝集のより高い温度の結果でLDHのインキュベーション、およびHdeBの無シャペロン効果を観察することができます。
4. サンプルは室温まで冷却してみましょう。次に、標準的なセクターを含む細胞への負荷サンプルを1.2センチ路長と2チャンネルのセンターピースを形。超遠心分離機に細胞をロードし、前の沈降に少なくとも1時間、22℃に平衡化。
5. 22°Cと12時間それぞれのローター中で167,000×gでスピンサンプル、SEDを監視連続して280 nmでのタンパク質のimentation。以前に実証されているように、各チャネルの透過光強度はなく吸光度より測定した場合、信号対雑音比が改善されます。これはまた、後続のデータフィッティングの品質を向上させます。
6. 連続C（s）は分布モデル^17を使用して、SEDFIT（バージョン15.01b、2015年12月）でのデータ分析を行います。 SEDFITを使用する方法を記述したチュートリアルでは、参照¹⁸で見つけることができます。
   1. 0.7 ME（最大エントロピー）正則の信頼レベルを設定します。
7. SEDNTERP ^19を使用して、バッファ密度だけでなく、粘度を計算します。凝集したクライアントタンパク質の量を推定するために、参照としてpH7にpHを4に沈降LDHの積分を比較します。
   注：沈降分布プロットの統合はSEDFITで直接行うことができます。沈降速度データを分析するための代替ソフトウェアは、最近のレビュー²⁰に記載されています。

HdeBの存在下での4モニタリングMDH不活性化と再活性化

注記：pHを展開MDHのリフォールディングで精製HdeBの影響を中和時MDH活性をモニターすることによって決定しました。

1. 25μMHdeBの存在下または非存在下で37℃で1時間：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値でバッファDで1μMMDHをインキュベートします。その後、10分間、20℃まで温度をシフトします。
   注：MDHは37℃より高い温度でインキュベートしたときにMDHのリフォールディングをもHdeBの存在下では観察されませんでした。
2. 酸変性MDHのリフォールディングを開始するために、0.5 Mリン酸ナトリウム、pH8.0の0.13から0.42の体積の添加によってpH7に試料を中和します。
3. 20℃で2時間インキュベートした後、340nmの⁹におけるNADHの減少をモニターすることによってMDH活性を決定します。
   注：MDHはL-リンゴにオキサロ酢酸のNADH依存性還元を触媒します。
   1. アッセイ緩​​衝液950μL（50 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0、1mMのオキサロ酢酸、および150μMNADH）とのインキュベーション反応液50μlを混合します。
      注：アッセイ緩​​衝液中MDHの最終濃度は44 nMであるべきです。
   2. 20℃に設定し、ペルチェ温度制御ブロックを備えた分光光度計を用いて吸光度の変化を監視します。
   3. pHを7.0に維持してきた44 nMのネイティブMDHにMDH活性の相対を報告します。

E.上HdeB過剰発現の5効果酸ストレス下での大腸菌の生存

注：E.大腸菌 MG1655のゲノムDNAは、公表されたプロトコル^21を用いて単離しました。

1. E.からhdeBを増幅プライマーhdeBを用いたPCRによるコリ MG1655 - のBamH I-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATTとhdeB - のEcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. 次のように50μl中のPCR反応を設定します：10μlの5×ポリメラーゼバッファー、ゲノムDNA MG1655、0.5μlのDNAポリメラーゼngを、200μMのdNTP、0.5μMのプライマーJUD2、0.5μMプライマーJUD5、150は、50μlにのddH ₂ Oを追加します。
3. ステップ1：以下のようhdeBの増幅を行い、95℃、1サイクルで5分。ステップ2：95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃、40サイクルで30秒間。ステップ3：72℃で10分間。
4. 制限部位のクローニングのための標準的な方法を用いてプラスミドpBAD18のをEcoR IとのBamH I部位にPCR断片を得られたクローン。製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キットを用いてプラスミドを精製します。シークエンス¹⁰によって得られたプラスミドを確認します。
5. 、λ ^{- -} 、E14 ^- 、[araD139] _{B / R} [F：株BB7224（ΔrpoH）（遺伝子型にHdeBまたは空ベクター対照pBAD18を発現するプラスミドをトランスフォーム6;（ARGF-LAC）169 flhD5301Δ（fruK-yeiR）725（fruA25）relA1 rpsL150（SM ^{R）rbsR22Δ（fimB-FIME）632（::} IS1）ptsF25 zhf :: Tnの10（TC ^S）suhX401 deoC1 araDを ⁺ rpoH ::館 ^{+; 16）}化学的コンピテント細胞を用いました。
   注：この株は温度感受性です。
6. 45秒42℃で熱ショック前めっきした後、30℃、200 rpmで細胞を培養します。陽性クローンの単一コロニーストリークアウトを実行し、30℃で一晩インキュベートします。 50ミリリットルのLB _アンプで一晩培養を準備し、200rpmで、30℃で細胞を培養。
7. 一晩培養物を25 mlのLB _アンプに40倍に希釈し、HdeBタンパク質発現を誘導するために30℃、ODを_600nmで 200 RPM = 1.0で0.5％アラビノース（ARA）の存在下で細菌を増殖します。
8. pHシフトの実験のために、LBを使用アンプ+アラ0.5のOD _600nmまでに細胞を希釈し、（ここではpHは2.0、pHが3.0、およびpH 4.0）それぞれのpH値に調整して5 M HClを適切なボリュームを追加することによって。
9. 示された時点（; pHは3、2.5分; pHは2、1分pHは4、30分）した後、5 M NaOHを適切な容量の添加により培養液を中和します。
10. OD測定値を用いて30℃で12時間培養液中の中和培養物の増殖を監視します。

結果

HdeAとHdeBは、E相同であります酸ストレス条件¹⁰に対してペリプラズムタンパク質を保護することが知られている大腸菌タンパク質。私たちの仕事は、HdeAと同様に、HdeBはまた、分子シャペロンを活性化酸として機能することを明らかにしました。しかし、まだ潜在的に殺菌が、HdeA ^6,9,10,22の最適pHよりも有意に高いpHでHdeA、HdeB機能とは対?...

ディスカッション

活性化およびHdeBのシャペロン機能のメカニズムを研究するために、HdeB大量に発現させ、精製しなければなりません。発現ベクター系の数は、この研究で使用した両方ともたpTrcかのpBADベクターを含む、標的タンパク質の高レベルの産生のために利用可能です。プロモーターはE.のために容易にアクセス可能ですコリ RNAポリメラーゼ、したがって、任意のEにHdeBの強い?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786