Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Resumen

Este estudio describe las técnicas biofísicas, bioquímicas y moleculares para caracterizar la actividad chaperona de Escherichia coli HdeB en condiciones de pH ácido. Estos métodos se han aplicado con éxito para otros chaperones ácido-protectores tales como HdeA y puede ser modificado para trabajar para otros chaperones y condiciones de estrés.

Resumen

Las bacterias están expuestos con frecuencia a los cambios ambientales, tales como alteraciones en el pH, la temperatura, el estado redox, exposición a la luz o fuerza mecánica. Muchas de estas condiciones causar desplegamiento de la proteína en la célula y tienen un impacto perjudicial sobre la supervivencia del organismo. Un grupo de las chaperonas moleculares no relacionadas, estrés específica se ha demostrado que desempeñan papeles esenciales en la supervivencia de estas condiciones de estrés. Mientras totalmente plegada y chaperona-inactivo antes de estrés, estas proteínas se despliegan rápidamente y se convierten en chaperona-activa bajo condiciones de estrés específicos. Una vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenadas se unen a un gran número de diferentes proteínas de agregación propensos, prevenir su agregación y facilitar directa o indirectamente la proteína de replegamiento a su regreso a condiciones de no estrés. El enfoque principal para obtener una comprensión más detallada sobre el mecanismo de activación de su reconocimiento y el cliente implica la purificación y subsequent caracterización de estas proteínas utilizando en ensayos in vitro de chaperona. El seguimiento en los ensayos in vivo de estrés son absolutamente esenciales para confirmar de manera independiente la obtenida en los resultados in vitro.

Este protocolo describe en vitro y en métodos in vivo para caracterizar la actividad chaperona de E. coli HdeB, una chaperona-ácido activado. Mediciones de dispersión de luz se utilizaron como un cómodo lectura de salida para la capacidad de HdeB para evitar la agregación inducida por ácido de una proteína cliente modelo establecido, MDH, in vitro. ultracentrifugación analítica experimentos se aplicaron a revelar la formación de complejos entre HdeB y su proteína LDH cliente, para arrojar luz sobre la suerte de proteínas cliente a su regreso a condiciones de no estrés. Se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática de las proteínas cliente de monitorizar los efectos de HdeB en la inactivación cliente pH inducida y la reactivación. Por último, se utilizaron estudios de supervivencia al monitor la influencia de la función chaperona de HdeB in vivo.

Introducción

Un entorno natural común en el que los patógenos microbianos experimentan condiciones que se desarrollan de proteínas inducidas por ácido es el estómago de mamíferos (intervalo de pH 1-4), cuyo pH ácido sirve como una barrera efectiva contra los patógenos transmitidos por los alimentos ^1. Desplegamiento de la proteína y la agregación, que es causada por la protonación de la cadena lateral de aminoácido, afecta a los procesos biológicos, estructuras celulares daños y eventualmente causa la muerte celular ^1,2. Dado que el pH de la periplasma bacteriano se equilibra de forma casi instantánea con el pH del medio ambiente debido a la difusión libre de protones a través de la membrana externa porosa, proteínas de la membrana periplásmicas e interior de las bacterias Gram-negativas son los componentes celulares más vulnerables en condiciones ácidas-estrés ^3. Para proteger su proteoma periplásmico contra el daño mediado por ácido rápida, las bacterias Gram-negativas utilizan las chaperonas periplásmicas ácido activado HdeA y HdeB. HdeA es una chaperona condicionalmente desordenado ^{4,5: A pH neutro, HdeA está presente como un doblado, dímero chaperona-inactivo. Tras un cambio de pH por debajo de pH 3, la función chaperona de HdeA se activa rápidamente 6,7. La activación de HdeA requiere profundos cambios estructurales, incluyendo su disociación en monómeros, y el que se desarrollan parcial de los monómeros 6-8. Una vez activado, HdeA une a las proteínas que se desarrollan en condiciones ácidas. Se evita con eficacia su agregación, tanto durante la incubación a pH bajo, así como la neutralización del pH. A su regreso a pH 7,0, HdeA facilita el repliegue de sus proteínas cliente de una manera independiente de ATP y la convierte de nuevo en su dimérica, la conformación inactiva chaperón-9. Del mismo modo, la HdeB chaperona homóloga también se chaperona inactiva a pH 7,0. A diferencia de HdeA, sin embargo, la actividad chaperona de HdeB alcanza su máximo aparente a pH 4,0, condiciones en las que se HdeB todavía en gran parte doblada y diméricas 10. Por otra parte, reduciendo aún más las caus pHes la inactivación de HdeB. Estos resultados sugieren que a pesar de su extensa homología, HdeA y HdeB difieren en su modo de activación funcional que les permite cubrir un amplio rango de pH con su función protectora chaperona. Una otra chaperona que se ha implicado en la resistencia a los ácidos de E. coli es el citoplasmática Hsp31, que aparece para estabilizar proteínas cliente desplegadas hasta que se restablecen las condiciones neutrales. El modo preciso de acción de Hsp31, sin embargo, se ha mantenido enigmática 12. Teniendo en cuenta que otras bacterias enteropatógenas tales como Salmonella carecen del operón hdeAB, es muy probable que puedan existir otras chaperonas periplásmicas aún no identificados que están involucrados en la resistencia de estas bacterias ácido 11.}

Los protocolos presentados aquí permiten controlar la actividad chaperona dependiente del pH de HdeB in vitro e in vivo ¹⁰ y se pueden aplicar para investigar otros chaperonestales como Hsp31. Alternativamente, la red compleja de factores de transcripción que controlan la expresión de hdeAB potencialmente puede ser investigada mediante el ensayo de estrés in vivo. Para caracterizar la función de chaperón de las proteínas in vivo, diferentes configuraciones experimentales se pueden aplicar. Una ruta es aplicar desplegamiento de la proteína condiciones de estrés y fenotípicamente caracterizar las cepas mutantes que sobreexpresan o bien el gen de interés o llevar una deleción del gen. Los estudios proteómicos pueden llevar a cabo para identificar las proteínas que ya no agregada en condiciones de estrés cuando la chaperona está presente, o la influencia de un acompañante en una enzima específica se pueden determinar durante condiciones de estrés utilizando métodos enzimáticos ^14-16. En este estudio, se optó por sobreexpresan HdeB en una cepa de deleción rpoH, que carece del factor sigma de choque térmico 32. RpoH controla la expresión de los principales E. chaperones coli y su eliminación se sabe que aumenta sensitivity a condiciones de estrés ambiental que causan desplegamiento de la proteína ^15. La actividad chaperona in vivo de HdeB se determinó mediante el control de su capacidad para suprimir la sensibilidad pH de la cepa Δ rpoH. En total, los protocolos presentados aquí proporcionan un enfoque rápido y directo para caracterizar la actividad de una chaperona-ácido activado in vitro, así como en el contexto in vivo.

Protocolo

1. Expresión y purificación de periplásmico HdeB

NOTA: HdeB se expresó en E. células de E. coli que albergan el plásmido pTrc- hdeB ^10, y se purificó a partir del periplasma tras la lisis polimixina.

1. Preparar un cultivo nocturno de E. coli células que albergan el plásmido pTrc- hdeB ¹⁰ en 30 ml de LB que contiene 200 mg / ml de ampicilina (LB _Amp). Inocular cuatro 1 culturas L de LB _Amp y crecer a 37 ° C y 200 rpm hasta que se alcanza OD _{600 nm} de 0,7. A continuación, añadir 300 mM IPTG para inducir la expresión de HdeB y disminuir la temperatura de crecimiento a 30 ° C.
2. Después de 5 h de expresión de la proteína a 30 ° C, recoger las células por centrifugación a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C.
3. Lavar el sedimento celular con 100 ml de tampón A (Tris 50 mM / HCl, NaCl 50 mM, pH 7,5) y centrifugar las células de nuevo a 8.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Posteriormente, resuspenderel sedimento celular en 80 ml de tampón A, que contiene 1 mg de sulfato de polimixina / ml. Para la interrupción eficaz de la membrana externa, agitar suavemente la suspensión durante 1 hora a 4 ° C.
5. Para eliminar la fracción citoplásmica y restos de células, centrifugar la suspensión durante 20 min a 15.000 xg a 4 ° C. Esto resulta en ~ 60 ml de sobrenadante que contiene el HdeB soluble.
6. Se dializa el sobrenadante que contiene el extracto periplásmico durante la noche frente volumen 150x de tampón B (Tris / HCl 20, EDTA 0,5 mM, pH 8,0) utilizando una membrana de diálisis con 6 kDa MW línea de corte. Se concentran las proteínas a 15 ml usando unidades de filtro centrífugo con un peso molecular de corte de 3 kDa. Se filtra la solución de proteína usando un filtro de 0,2 micras de poro.
7. Aplicar la proteína en una columna de cromatografía de intercambio de aniones (volumen de la columna 5 ml) que ha sido equilibrada con 5 volúmenes de columna de tampón B con un caudal de 2,5 ml / min. Una vez que la proteína se cargó en la columna, lavar la columna con tampón B durante 10 min auna velocidad de flujo de 2,5 ml / min. Eluir HdeB con un gradiente lineal de 0 a 0,5 M NaCl en tampón B durante un período de tiempo de 50 min con un caudal de 2,5 ml / min ^6.
8. Identificar las fracciones que contienen HdeB utilizando un 15% de SDS-PAGE. Mezclar 20 muestra l con 5 l de 5x tampón de carga SDS reducido. Carga de 10 l en el gel y ejecutar en tampón Tris-glicina (14,4 g / l de glicina, 2,9 g / L Tris, 1 g / l de sulfato de dodecilo de sodio, pH 8,3). Correr el gel a 150 V hasta que la banda de bromofenol migró cerca de la parte inferior del gel (~ 45 min).
9. Piscina todas las fracciones HdeB que contienen, diálisis a 4 ° C durante la noche frente a tampón de almacenamiento HdeB 4 L (50 mM Tris / HCl, NaCl 200 mM, pH 8,0), y concentrar la proteína a aproximadamente 300 mM utilizando unidades de filtración centrífuga con un peso molecular de corte de 3 kDa. Determinar la concentración de HdeB a 280 nm usando el coeficiente de extinción ε _{280 nm} = 15.595 M ^-1 cm ^-1. Preparar 100 ml de alícuotas y sin flash enze las alícuotas en nitrógeno líquido.
   NOTA: HdeB se puede almacenar a -70 ° C durante al menos 6 meses.

2. Ensayo de la actividad chaperona Usando térmicamente despliegue malato deshidrogenasa (MDH)

NOTA: La influencia de HdeB purificado en la agregación de despliegue térmicamente porcino malato deshidrogenasa mitocondrial (MDH) a diferentes valores de pH se monitorizó como se describe a continuación. Todas las concentraciones de proteína enumerados se refieren a la concentración de monómero.

1. Para preparar MDH, dializar MDH a 4 ° C durante la noche contra 4 L de tampón C (50 mM de fosfato de potasio, NaCl 50 mM, pH 7,5) y concentrar la proteína a aproximadamente 100 mM utilizando unidades de filtración centrífuga con un peso molecular de corte de 30 kDa.
   ATENCIÓN: se necesita diálisis cuidadosa de MDH como MDH se entrega como una solución de sulfato de amonio.
2. Para eliminar los agregados, centrifugar la proteína durante 20 minutos a 20.000 xga 4 ° C. Determinar la concentración de MDH por absorbancia a 280 nm (ε _{280 nm = 7,950 M ^-1 cm ^-1). Preparar 50 ml de alícuotas de MDH y flash-congelar las alícuotas para su almacenamiento.}
3. Colocar 1 ml cubeta de cuarzo en un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con soportes de muestra de temperatura controlada y agitador. Establecer _ex λ _{/ em} a 350 nm.
4. Añadir los volúmenes adecuados de pre-calentado (43 ° C) tampón D (150 mM de fosfato de potasio, NaCl 150 mM) a los valores deseados de pH (aquí: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, y pH 5,0) a la cubeta y conjunto la temperatura en el soporte de cubeta a 43 ° C. El volumen total es de 1.000 l.
5. Añadir 12,5 M HdeB (o, alternativamente, el mismo volumen de tampón de almacenamiento HdeB para el control de tampón) a la memoria intermedia, seguido de la adición de 0,5 M MDH. Comenzar a controlar la dispersión de luz. Se incuba la reacción durante 360 ​​segundos para permitir la suficiente despliegue de MDH.
6. Elevar el pH a 7 mediante la adición de 0,16-0,34 volumen de 2 M K sin búfer ₂ HPO ₄ y continuar reacuerdo dispersión de la luz para otro 440 seg.
7. Ajuste el grado de agregación MDH que se registra en la ausencia de la chaperona en un punto de tiempo definido después de la neutralización (aquí después de 500 seg, cuando se observó la máxima dispersión de la luz de MDH) a 100%. Normalizar la actividad de HdeB a la señal de dispersión de la luz de MDH en ausencia de HdeB en cada valor de pH indicado.

3. Detección de HdeB-LDH Formación de complejos por ultracentrifugación analítica (AUC)

NOTA: los experimentos de velocidad de sedimentación de HdeB sola o en complejo con despliegue térmicamente lactato deshidrogenasa (LDH) se realizaron utilizando una ultracentrífuga analítica.

1. Para preparar LDH, dializar LDH a 4 ° C durante la noche contra 4 L de tampón C (50 mM de fosfato de potasio, NaCl 50 mM, pH 7,5) y concentrar la proteína a aproximadamente 200 mM utilizando unidades de filtración centrífuga con un peso molecular de corte de 30 kDa.
   NOTA: Se requiere diálisis cuidadosa de LDH como LDH se suministra como solución de sulfato de amonio.
2. Para eliminar los agregados, centrífuga de LDH durante 20 minutos a 20.000 xga 4 ° C. Determinar la concentración de LDH por absorbancia a 280 nm (ε = _{280 nm} 43.680 M ^-1 cm ^-1). Preparar 50 ml de alícuotas de LDH y flash-congelar las alícuotas para su almacenamiento.
3. Incubar 3 LDH mu M en presencia y ausencia de HdeB 30 mM en tampón D (pH 4 y 7, respectivamente) durante 15 min a 41 ° C.
   NOTA: La incubación de LDH a temperaturas más altas resultados en su completa agregación, y ningún efecto chaperona de HdeB se pueden observar.
4. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. A continuación, las muestras de carga en las células que contienen sector de la norma en forma de piezas centrales de 2 canales con 1.2 cm de espesor. Cargar las células en la ultracentrífuga y equilibrar a 22 ° C durante al menos 1 hora antes de la sedimentación.
5. muestras de giro a 22 ° C y 167.000 xg en el rotor respectivo durante 12 horas, y supervisar la sedimentation de la proteína de forma continua a 280 nm. Como se ha demostrado anteriormente, la relación señal a ruido se mejora cuando la intensidad de la luz transmitida de cada canal se mide en lugar de absorbancia. Esto también mejora la calidad de la subsiguiente ajuste de datos.
6. Llevar a cabo el análisis de datos con SEDFIT (versión 15.01b, Diciembre de 2015), utilizando el modelo de distribución continua c (s) ^17. Un tutorial que describe cómo utilizar SEDFIT se puede encontrar en la referencia ^18.
   1. Ajuste el nivel de confianza para la regularización ME (máxima entropía) a 0,7.
7. Calcular la densidad de tampón, así como la viscosidad usando SEDNTERP ^19. Para estimar la cantidad de proteína agregada cliente, comparar las integrales de LDH sedimentado en pH 4 a pH 7 como referencia.
   NOTA: La integración de las gráficas de distribución de sedimentación se puede hacer directamente en SEDFIT. Alternativa software para analizar los datos de velocidad de sedimentación se puede encontrar en una reciente revisión ^20.

4. Seguimiento MDH inactivación y reactivación en la Presencia de HdeB

NOTA: La influencia de HdeB purificado en el replegamiento de pH-desplegada MDH se determinó mediante el control de la actividad de MDH la neutralización.

1. Incubar 1 MDH mu M en tampón D en los valores deseados de pH (aquí: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, y pH 5,0) durante 1 hora a 37 ° C en la ausencia o presencia de 25 HdeB M. A continuación, cambiar la temperatura a 20 ° C durante 10 min.
   NOTA: No replegamiento MDH se observó incluso en presencia de HdeB cuando MDH se incubó a temperaturas superiores a 37 ° C.
2. Para iniciar el replegamiento de ácido MDH desnaturalizado, neutralizar las muestras a pH 7 mediante la adición de 0,13 hasta 0,42 volumen de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0.
3. Después de la incubación durante 2 horas a 20 ° C, determinar la actividad de MDH mediante el control de la disminución de NADH a 340 nm ^9.
   NOTA: MDH cataliza la reducción dependiente de NADH de oxaloacetato en L-malato.
   1. Mezclar 50 l de la reacción de incubación con 950 l de tampón de ensayo (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, 1 mM oxaloacetato, y 150 mM de NADH).
      NOTA: La concentración final de MDH en el tampón de ensayo debería ser 44 nM.
   2. Monitorear el cambio en la absorbancia utilizando un espectrofotómetro, equipado con un bloque de control de temperatura Peltier se establece en 20 ° C.
   3. Informar de la actividad de MDH en relación con 44 nM MDH nativa que se ha mantenido a un pH de 7,0.

5. Efecto de la sobreexpresión en E. HdeB coli supervivencia bajo estrés ácido

NOTA: E. ADN genómico MG1655 coli se aisló usando un protocolo publicado ^21.

1. Amplificar hdeB de E. coli MG1655 mediante PCR utilizando cebadores hdeB - BamHI-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT ATT CGG CAA GTC y hdeB - EcoRI-FW GGT CGC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT TCA TCA TCT CTC C.
2. Configurar la reacción de PCR en 50 l de la siguiente manera: 10 l de 5x tampón de la polimerasa, 200 mM dNTPs, 0,5 M imprimación JUD2, 0,5 M imprimación JUD5, 150 ng MG1655 ADN genómico, 0,5 l de ADN polimerasa, añadir _ddH2O a 50 l.
3. Realizar la amplificación de hdeB como sigue: Paso 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; paso 2: 30 segundos a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C, 40 ciclos; Paso 3: 10 min a 72 ° C.
4. Clon resultante fragmento de PCR en los sitios EcoR I y BamH I del plásmido pBAD18 utilizando métodos estándar para la clonación de sitios de restricción. Se purificó el plásmido usando un kit de purificación de plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Verificar el plásmido resultante por secuenciación ^10.
5. Transformar el plásmido que expresa HdeB o los pBAD18 de control de vectores vacíos en BB7224 cepa (Δ rpoH) (genotipo: F ^-, λ ^-, e14 ^-, [araD139] _{B / r} [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 Arad ⁺ rpoH :: kan ^{+; 16)} utilizando células químicamente competentes.
   NOTA: Esta cepa es sensible a la temperatura.
6. Después de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C y antes de la galvanoplastia, las células se incuban a 30 ° C y 200 rpm. Realizar sola colonia racha de espera de los clones positivos y se incuba durante la noche a 30 ° C. Preparar un cultivo de una noche en 50 ml de LB _Amp y cultivar las células a 200 rpm y 30 ° C.
7. Diluir cultivos de una noche de 40 veces en 25 ml de LB _Amp y crecer las bacterias en presencia de 0,5% de arabinosa (Ara) a 30 ° C y 200 rpm a una OD _{600 nm} = 1,0 para inducir la expresión de la proteína HdeB.
8. Para los experimentos de desplazamiento de pH, utilizar LBAmp + Ara para diluir las células a _{600 nm} de 0,5 y se ajusta a los valores respectivos de pH (en este caso: pH 2,0, pH 3,0 y pH 4,0) mediante la adición de volúmenes apropiados de HCl 5M.
9. Después de que los puntos de tiempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutralizar los cultivos mediante la adición de los volúmenes apropiados de NaOH 5 M.
10. Monitorear el crecimiento de los cultivos neutralizados en cultivo líquido durante 12 horas a 30 ° C por medio de mediciones de DO.

Resultados

HdeA y HdeB son homólogas E. proteínas coli, conocidos para proteger proteínas periplásmicas contra condiciones de estrés ácido ^10. Nuestro trabajo reveló que al igual que HdeA, HdeB también funciona como un ácido activado chaperona molecular. Sin embargo, en contraste con funciones HdeA, HdeB a un pH que todavía es potencialmente bactericida, pero significativamente más alto que el pH óptimo de HdeA ^6,9,10,22. Para investigar el pH óp...

Discusión

Con el fin de estudiar el mecanismo de la activación y la función chaperona de HdeB, grandes cantidades de HdeB tienen que ser expresado y purificado. Un número de sistemas de vectores de expresión están disponibles para la producción de altos niveles de una proteína diana, incluyendo pTrc o pBAD vectores, ambos de los cuales se utilizaron en este estudio. Los promotores son fácilmente accesibles para E. coli RNA polimerasa y la expresión de este modo permiten fuertemente upregulated de HdeB en c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786