的pH依赖性活性的检测<em&gt;大肠杆菌</em&gt;陪护HdeB<em&gt;体外</em&gt;和<em&gt;在体内</em

摘要

这项研究说明生物物理，生物化学和分子生物学技术的酸性pH条件下表征大肠杆菌 HdeB的伴侣活性。这些方法已被成功地用于其它酸保护伴侣分子如HdeA蛋白，并且可以进行修改，以用于其它分子伴侣和应力的条件下工作。

摘要

细菌经常暴露于环境的变化，如在pH值改变，温度，氧化还原状态，光照射或机械力。许多的这些条件导致蛋白质在细胞中解折叠和对生物体的存活有害影响。 A组无关，特定的应力 - 分子伴侣已被证明在这些胁迫条件存活中发挥重要作用。虽然完全折叠和分子伴侣不活动的压力之前，这些蛋白质迅速展开和具体的胁迫下成为伴侣活性。一旦被激活，这些条件无序伴侣结合到大量不同的聚集倾向的蛋白质，防止其聚集和直接或间接地促进蛋白在返回到非胁迫条件重折叠。对于获得关于它们的激活和客户识别的机理的更详细的了解主方法涉及纯化和subsequen使用体外实验伴侣这些蛋白质的牛逼表征。后续体内应激试验是绝对必要的独立证实体外结果所获得的。

这个协议描述的体外 和体内方法来表征E的伴侣活性大肠杆菌 HdeB，酸活化的蛋白伴侣。光散射测量被用来作为一种方便读出为HdeB的能力，以防止已建立的模型客户蛋白，MDH的酸诱导的聚集， 在体外 。分析超速离心实验应用于揭示HdeB及其客户蛋白LDH之间形成复合物，轻脱落到客户蛋白在返回非重压条件下的命运。的客户蛋白的酶促活性测定法进行监测HdeB的pH值引起的客户端的失活和活化的影响。最后，存活研究被用来monito中的R 体内 HdeB的陪伴分子功能的影响。

引言

其中微生物病原体经历酸诱导蛋白展开条件常见的自然环境是哺乳动物的胃（pH范围1-4），其酸性pH值作为对食源性致病菌¹的有效屏障。蛋白质解折叠和聚集，这是由氨基酸侧链质子化引起的，会影响生物过程，损害的细胞结构，并最终导致细胞死亡^1,2。因为细菌周质的pH值达到平衡几乎瞬间与环境pH值由于通过多孔外膜质子的自由扩散，革兰氏阴性细菌的周质和内膜蛋白是酸胁迫条件³下的最脆弱的细胞成分。以保护其免于快速酸介导的损伤的周质蛋白质，革兰氏阴性细菌利用酸活化周质蛋白伴侣HdeA蛋白和HdeB。 HdeA蛋白是一种有条件的无序伴侣 ^{4,5:在中性pH值，HdeA蛋白是作为折叠，分子伴侣惰性二聚体。当pH值低于转变pH值为3，HdeA蛋白的分子伴侣功能被快速激活6,7。 HdeA蛋白激活需要深刻的结构变化，包括其解离成单体，和部分解折叠的单体6-8。一旦被激活，HdeA蛋白结合到酸性条件下展开的蛋白质。它有效地防止了两者在pH中和过程中在低pH孵育以及它们的聚集。在返回至pH7.0，HdeA蛋白有利于在ATP无关的方式其客户蛋白质复性和转换回它的二聚体，分子伴侣活性构象9。同样地，同源伴侣HdeB也伴侣惰性在pH 7.0。不像HdeA蛋白，然而，HdeB的分子伴侣活性在pH值4.0达到其最大表观，其下HdeB在很大程度上仍然折叠和二聚体10的条件。而且，进一步降低pH CAUSES HdeB的失活。这些结果表明，尽管其广泛的同源性，HdeA蛋白和HdeB在它们的功能的激活允许它们以覆盖一个宽的pH范围内与它们的保护陪伴分子功能的方式有所不同。已经在大肠杆菌中的耐酸性牵连一种其它分子伴侣大肠杆菌是胞质Hsp31，这似乎直到恢复中性条件下稳定折叠客户蛋白。 Hsp31的行动的确切模式，但是，一直保持神秘的12。鉴于其他致肠病细菌如沙门氏菌缺乏hdeAB操纵子，它很可能是其他尚未鉴定的周质蛋白伴侣可能存在是参与这些细菌11的耐酸性。}

这里介绍的协议允许监测体外和体内 ¹⁰ HdeB的pH依赖性伴侣活性和可应用于研究其他分子伴侣如Hsp31。或者，控制hdeAB的表达转录因子的复杂网络可以潜在地通过在体内应力测定法研究。为了表征体内蛋白的分子伴侣功能，不同的实验设置可以被应用。一路线是应用蛋白质折叠应激条件和表型表征突变菌株，无论是过表达感兴趣的基因或者携带缺失的基因。蛋白质组学研究可以进行到聚合识别哪些蛋白不再胁迫条件下时，分子伴侣存在时，或者可以在使用酶测定^14-16应力条件来确定一个伴侣上的特定的酶的影响。在这项研究中，我们选择了过度HdeB在rpoH缺失株，它缺乏热休克σ因子32 RpoH控制所有主要E.表达大肠杆菌伴侣及其缺失是已知会增加SENSitivity到导致蛋白质折叠¹⁵环境胁迫条件。 HdeB 的体内伴侣活性通过监测其抑制ΔrpoH应变的pH敏感性的能力来确定。总之，这里介绍的协议提供了快速并简单的方法来表征体外以及在体内上下文酸活化的分子伴侣的活性。

研究方案

1.表达和周质HdeB纯化

注:HdeB在大肠杆菌表达大肠杆菌细胞携带从在多粘菌素裂解周质质粒pTrc- hdeB ^10，并纯化。

1. 制备大肠杆菌的过夜培养大肠杆菌细胞携带质粒pTrc- hdeB ¹⁰在30毫升的LB含有200微克/ ml氨苄青霉素（LB _安培 ）。接种LB _安培四个1L的培养物，并在37℃下生长他们和200rpm下，直至达到0.7的OD _600nm处 。然后，添加300微米的IPTG以诱导HdeB的表达和降低生长温度至30℃。
2. 在30℃下5小时的表达后，在8000 xg离心收获细胞离心5分钟，在4℃。
3. 洗细胞沉淀用100mL在8000 xg离心再次将细胞缓冲液A（50毫摩尔Tris /盐酸，50 mM氯化钠，pH值7.5）和离心机在4℃5分钟。
4. 随后，悬浮在80中的细胞沉淀毫升缓冲液A，含有1mg / ml的多粘菌素硫酸盐。为外膜的有效破坏，轻轻搅动在4℃下的悬浮液1小时。
5. 以除去细胞质部分和细胞碎片，离心悬浮液20分钟，在4℃下15000 xg离心。这导致〜含有可溶性HdeB60毫升上清液。
6. 透析含周质提取物过夜针对使用具有6 kDa的MW透析膜缓冲液B（20毫摩尔Tris /盐酸，0.5毫摩尔EDTA，pH 8.0）中的150倍体积上清液切断。浓缩蛋白质使用离心过滤器单元3 kDa的分子量截断毗邻15毫升过滤用0.2μm细孔过滤蛋白质溶液。
7. 应用该蛋白上已经用2.5毫升/分钟的流速平衡用5柱体积的缓冲液B中的阴离子交换层析柱（柱体积5毫升）中。一旦蛋白被加载到柱上，洗涤用缓冲液B的柱在10分钟2.5毫升/分钟的流速。洗脱HdeB从0至0.5M NaCl的超过50分钟为2.5毫升/分钟⁶的流速的时间段的线性梯度于缓冲液B。
8. 确定用15％SDS-PAGE含HdeB分数。混合5微升5倍的还原SDS上样缓冲液20微升样品。负载10微升到凝胶，并在Tris-甘氨酸缓冲液（14.4克/升的甘氨酸，2.9克/升的Tris，1g / L的十二烷基硫酸钠，pH值8.3）中运行。在150V运行凝胶，直至溴酚频带已迁移接近凝胶（〜45分钟）的底部。
9. 池中的所有含HdeB级分，在4℃下透析过夜针对4升HdeB存储缓冲液（50mM的Tris /盐酸，200mM的氯化钠，pH值8.0），并使用具有分子量离心过滤装置的蛋白浓缩至大约300微米截止3千道尔顿。使用消光系数_ε280nm处 = 15,595中号确定HdeB的浓度在280nm ^{-1 -1。}准备100微升等分和免费闪存泽在液氮中等分试样。
   注:HdeB可以储存在-70℃至少6个月。

2.伴侣活性测定中使用热展开苹果酸脱氢酶（MDH）

注:纯化HdeB上的在不同pH值的热解折叠猪线粒体苹果酸脱氢酶（MDH）的聚集的影响如下所述进行监控。所有列出的蛋白质浓度是指单体浓度。

1. 为了制备MDH，在4℃下透析MDH过夜针对4升缓冲液C（50mM磷酸钾，50mM NaCl中，pH为7.5），并使用为30的分子量截止离心过滤单元的蛋白浓缩至约100μM的kDa的。
   注:由于MDH是作为硫酸铵溶液MDH仔细透析是必需的。
2. 要删除聚集，离心蛋白20分钟，在4℃，20000 XG。确定由吸光度MDH浓度在280nm（ε<子> 280毫微米= 7,950 M ^{-1 -1）。}准备MDH的50微升等分和闪光灯冻结等分进行存储。
3. 放置1毫升石英试管到装有温度控样品支架和搅拌器的荧光分光光度计。设置_{λEX / EM}到350纳米。
4. 到试管并集:在所需的pH值（pH为2.0，pH值为3.0，pH值4.0和pH值5.0这里）添加预热（43℃）缓冲液D（150 mM磷酸钾，150mM的NaCl）中的适当体积在试管架的温度至43℃。总体积为1,000微升。
5. 添加12.5μMHdeB（或者对于缓冲器控制相同体积HdeB存储缓冲器的）到缓冲器，接着加入0.5微米的MDH。开始监视光散射。孵育360秒的反应，以便有足够的MDH展开。
6. 通过添加2M的无缓冲_的 K ₂的0.16-0.34体积HPO ₄将pH提高到7，并继续再盘带另一个440秒的光散射。
7. 设置要在定义的时间点和后记录在不存在分子伴侣的MDH聚集程度（后这里500秒，当观察到的MDH最大光散射）至100％。正常化HdeB对在没有HdeB的MDH的光散射信号活动每一指明的pH值。

3.分析超速离心HdeB-LDH复合物的形成检测（AUC）

注意:使用分析超速离心机进行单独的或与热解折叠乳酸脱氢酶（LDH）络合物HdeB的沉降速度实验。

1. 为了制备LDH，在4℃下透析，LDH过夜针对4升缓冲液C（50mM磷酸钾，50mM NaCl中，pH为7.5），并使用为30的分子量截止离心过滤单元的蛋白浓缩至约200μM的kDa的。
   注:LDH仔细透析需要为LDH被交付硫酸铵溶液。
2. 要在20000 XG在4℃除去聚集，LDH离心20分钟。通过在280nm的吸光度确定LDH的浓度_{（ε280nm处} = 43680 ^{M-1 -1）。}准备LDH的50微升等分和闪光灯冻结等分进行存储。
3. 孵育在缓冲液D的存在和不存在30μM的HdeB的（分别为pH值为4和7，）搅拌15分钟3微米的LDH在41℃。
   注:在其完整的聚合温度较高导致LDH的孵化和HdeB没有伴侣效果进行观察。
4. 让样品冷却到室温。然后，负载样品到含有标准扇区小区形1.2 cm光程2通道中心焦点。加载细胞进入超速离心机和平衡至22℃，沉淀前至少1小时。
5. 在22℃下旋样品和167000 XG在各自的转子12小时，并监视sed的连续在280处的蛋白的imentation。正如以前证明，当每个通道的透射光强度的测量，而不是吸光度信噪比得以改善。这也提高了随后的数据拟合的质量。
6. 进行数据分析与SEDFIT（版本15.01b，2015年12月），采用连续C（S）分布模型^17。介绍如何使用SEDFIT该教程可以参考¹⁸中找到。
   1. 设置为ME（最大熵）转正至0.7置信水平。
7. 计算使用SEDNTERP ¹⁹缓冲密度以及粘度。估算聚集客户蛋白质的量，作为参考在pH为4比较沉降的LDH的积分至pH7。
   注:沉淀分布图的整合可以直接在SEDFIT进行。分析沉降速度数据的替代软件可以在最近的一篇综述²⁰被发现。

4.监测MDH失活和再激活的HdeB的存在

注:纯净HdeB对pH值展开MDH复性的影响是通过对中和监视MDH活性。

1. 在不存在或25μMHdeB的存在下进行1小时，在37℃:孵育缓冲液D1μM的MDH在所需的pH值（pH为2.0，pH值为3.0，pH值4.0和pH值5.0这里）。然后，将温度转变为20℃下进行10分钟。
   注:观察到即使在HdeB存在无复性MDH MDH时，在温度高于37°C时保温。
2. 以引发酸变性的MDH复性，通过加入0.13-0.42体积的0.5M磷酸钠，pH 8.0的中和该样品至pH 7。
3. 在20℃温育2小时后，通过监控在340nm处⁹的NADH的减少确定MDH活性。
   注:MDH催化NADH依赖性降低草酰乙酸的为L-苹果酸。
4. 混合50微升950微升测定缓冲液（50mM磷酸钠，pH值8.0，1mM的草酰乙酸，和150μMNADH）孵育反应。
   注:MDH的在测定缓冲液中的最终浓度应44纳米。
5. 监测使用分光光度计吸光度变化，配备有设置为20℃的帕尔贴温度控制块。
6. 报告相对于44纳米原生MDH的MDH的活动，一直保持在pH为7.0。

HdeB过表达对E. 5.影响酸胁迫下生存的大肠杆菌

注:E。使用公开协议²¹ 大肠杆菌 MG1655的基因组DNA分离出来。

1. 从E.放大hdeB 大肠杆菌 MG1655采用PCR引物hdeB - 的BamHⅠ-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CAA CGG GTC ATT和hdeB - EcoRI位 I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. 成立于50微升如下PCR反应:10微升5倍聚合酶缓冲液，200μM的dNTP，0.5μM底漆JUD2，0.5μM底漆JUD5，150纳克基因组DNA MG1655，0.5微升DNA聚合酶，加DDH ₂ O的50微升。
3. 如下执行hdeB的扩增:步骤1:在95℃，1个循环5分钟;步骤2:30秒在95℃下，在55℃30秒，在72℃，40个循环30秒;步骤3:在72℃下10分钟。
4. 克隆得到的PCR片段插入到使用限制性位点克隆的标准方法质粒pBAD18的EcoR I和BamH I 位点。纯化使用根据制造商的说明的质粒纯化试剂盒的质粒。测序¹⁰验证得到的质粒。
5. 变换表达HdeB或空载体对照pBAD18到菌株BB7224（ΔrpoH）（基因型质粒:F ^- ，λ ^- ，E14 ^- ，[araD139] _{B / R} [6;（ARGF-LAC）169 flhD5301Δ（fruK-yeiR）725（fruA25）relA1 rpsL150（SM ^{R）rbsR22Δ（fimB-FIME）632（::} IS1）ptsF25 ZHF :: Tn的10（TC ^S）suhX401 deoC1 araD的 ⁺ rpoH ::根 ^{+ 16）}使用化学感受态细胞。
   注:此菌株是温度敏感。
6. 后45秒在42℃的电镀前热休克和，孵育在30℃和200rpm下的细胞。执行阳性克隆的单菌落条纹奏孵育过夜，在30℃。制备在50毫升的LB _安培的过夜培养，并培养所述细胞在200rpm和30℃。
7. 稀释过夜培养物40倍于25毫升LB培养基_放大器 ，并在30℃和200 rpm到的OD _600nm的 = 1.0生长细菌在0.5％的阿拉伯糖（阿糖胞苷）的存在下，以诱导HdeB蛋白的表达。
8. 对于pH变化的实验中，使用LBAMP +阿糖胞苷来稀释细胞以0.5的OD _600nm处并调整到各自的pH值（此处为:pH 2.0，pH值3.0和pH 4.0）通过加入5M的盐酸的适当体积。
9. 指定的时间点（; pH为3，2.5分钟; pH为2，1分钟pH为4，30分钟）后，通过加入5 M氢氧化钠的适当体积的中和培养物。
10. 监控中和培养物在液体培养基在30℃下使用的OD测量生长12小时。

结果

HdeA蛋白和HdeB同源E.大肠杆菌的蛋白质，称为保护周质蛋白对酸应激条件^10。我们的工作表明，类似于HdeA蛋白，HdeB还充当一种酸活化的分子伴侣。然而，在pH是仍然可能的杀菌力，但比HdeA蛋白^6,9,10,22的pH最适显著更高的对比度，以HdeA蛋白，HdeB功能。调查体外 HdeB的伴侣活性的最佳pH值，原生的MDH稀释到在HdeB的存在或不存在的指示pH值的预热（4...

讨论

为了研究活化和HdeB的伴侣功能的机制，大量HdeB的必须被表达和纯化。许多表达载体系统可用于生产高水平的靶蛋白，包括的pTrc或的pBAD载体，这两者在此研究中使用的。发起人是E.容易获得大肠杆菌 RNA聚合酶和在任何大肠杆菌 HdeB的从而允许强烈上调表达大肠杆菌菌株。这方面是用于酸应力的条件下，在这里被使用的rpoH缺损株下HdeB的体内表达研究尤?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786