Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Резюме

Это исследование описывает биофизические, биохимические и молекулярные методы характеризуют шаперонную активность кишечной палочки HdeB в кислых условиях рН. Эти методы были успешно применены для других кислотно-защитных наставниками, таких как HdeA и может быть изменен, чтобы работать для других шаперонов и стрессовых условиях.

Аннотация

Бактерии часто подвергаются к изменениям окружающей среды, такие как изменения рН, температуры, окислительно-восстановительного состояния, освещенности или механической силы. Многие из этих условий вызывают разворачивания белка в клетке и оказывают вредное воздействие на выживание организма. Группа не связаны, стресс специфических молекулярных шаперонов было показано, играют существенную роль в выживании этих условиях стресса. В то время как полностью сложена и компаньонка-неактивным до того стресса, эти белки быстро разворачиваются и становятся шаперонная-активными при определенных условиях стресса. После активации эти условно неупорядоченные хапероны связываются с большим числом различных агрегатных склонными белков, предотвращают их агрегацию и прямо или косвенно способствовать белок рефолдинга после возвращения в условиях без стресса. Основной подход для получения более детального понимания о механизме их активации и распознавания клиента включает в себя очистку и subsequenт характеристика этих белков с использованием в пробирке шаперонов анализов. Последующие действия в естественных условиях стресс - анализов абсолютно необходимы , чтобы подтвердить , независимо друг от друга полученный в пробирке результатов.

Этот протокол описывает в пробирке и в естественных условиях методы , чтобы охарактеризовать шаперонную активность Е. HdeB палочка, кислотно-активированный компаньонка. Измерения рассеяние света были использованы в качестве удобного чтения-аута для емкости HdeB для предотвращения кислотно-индуцированной агрегации установленного белка модель клиента, МДГ, в пробирке. Аналитические эксперименты ультрацентрифугирования были применены для выявления образования комплекса между HdeB и его белка клиент СДГ, чтобы пролить свет на судьбу клиента белков после их возвращения в условиях без стресса. Были проведены ферментные анализы активности клиента белков контролировать эффекты HdeB на рН-индуцированной инактивации и реактивации клиента. И, наконец, исследования выживаемости были использованы для Monitoг влияние функции шаперонного HdeB в естественных условиях.

Введение

Распространенной природная среда , в которой микробные патогены опыт кислотно-индуцированного протеина условия разворачивание желудка млекопитающих (диапазон рН 1-4), чей кислый рН служит эффективным барьером против пищевых патогенов ^1. Разворачивания белка и агрегации, которая вызывается боковой цепи аминокислоты протонирования, влияет на биологические процессы, повреждения оборудования клеточные структуры , и в конечном итоге приводит к гибели клеток в ^1,2 раза . Поскольку рН бактериальной периплазмы уравновешивает практически мгновенно при рН среды за счет свободной диффузии протонов через пористую внешнюю мембрану, периплазматические и внутренние мембранные белки грамотрицательных бактерий являются наиболее уязвимые клеточные компоненты в условиях кислотно-стресс - ^3. Для того, чтобы защитить их периплазматической протеом от быстрого повреждения кислотой опосредовано, грамотрицательные бактерии используют кислотно-активированный периплазмической шаперонов HdeA и HdeB. HdeA является условно неупорядоченных шаперонная ^{4,5: при нейтральном рН, HdeA присутствует в виде сложенной, шаперонного-неактивный димер. При сдвиге рН ниже рН 3, функция шаперонная HdeA в быстро активируется 6,7. Активация HdeA требует глубоких структурных изменений, в том числе его диссоциации на мономеры, а также частичное разворачивание мономеров 6-8. После активации HdeA связывается с белками, которые разворачиваются в кислых условиях. Это эффективно предотвращает их агрегацию и во время инкубации при низком рН, а также при рН нейтрализации. При возврате до рН 7,0, HdeA облегчает рефолдинга своих клиентов белков в АТФ-независимым образом , и преобразует его обратно в димерной, шаперон-неактивной конформации 9. Точно так же, гомологичные шаперонная HdeB также шаперон-неактивными при рН 7,0. В отличие от HdeA, однако, шаперонная активность HdeB достигает своего максимума при кажущейся рН 4,0, условия , при которых HdeB до сих пор в значительной степени сложена и димерных 10. Кроме того, дальнейшее понижение рН CAUSэс инактивация HdeB. Эти результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на обширные гомологии, HdeA и HdeB различаются по способу их функциональной активации позволяет им охватывать широкий диапазон рН с их защитной функции шаперона. Еще один шаперонная , который вовлечен в кислотной резистентности E. палочка является цитоплазматическим Hsp31, который , как представляется , стабилизировать развернутые клиентские белки , пока нейтральные условия не будут восстановлены. Точный механизм действия Hsp31, однако, остается загадочным 12. Учитывая , что другие Энтеропатогенная бактерии , такие как Salmonella , отсутствие оперон hdeAB, весьма вероятно , что другие еще неизвестные периплазматические шапероны могут существовать, которые участвуют в кислотной резистентности этих бактерий 11.}

Протоколы , представленные здесь , позволяют контролировать рН-зависимой шаперонную активности HdeB в пробирке и в естественных условиях ¹⁰ и могут быть применены для исследования других шапероновтакие как Hsp31. С другой стороны , сложная сеть факторов транскрипции , которые контролируют экспрессию hdeAB потенциально могут быть исследованы с помощью естественных условиях стресс - теста в. Для того, чтобы охарактеризовать функцию шаперона белков в естественных условиях, различные экспериментальные установки могут быть применены. Один путь состоит в применении разворачивания белка стрессовые состояния и фенотипически характеризуют мутантные штаммы, которые либо сверхэкспрессии представляющего интерес гена или нести делеция гена. Протеомные исследования могут быть проведены, чтобы определить , какие белки больше не агрегированный в стрессовых условиях , когда шаперонная присутствует, или влияние компаньонкой на конкретного фермента может быть определена во время стрессовых условиях с использованием ферментативных анализов ^14-16. В данном исследовании мы выбрали гиперэкспрессией HdeB в штамм rpoH удаления, в которой отсутствует фактор сигмы теплового шока 32. RpoH контролирует экспрессию всех основных Е. палочки наставники и его исключение как известно, увеличивает Сенсitivity к условиям окружающей среды , которые вызывают стресс разворачивания белка ^15. В естественных условиях шаперонная активность HdeB определяли путем мониторинга его способностью подавлять чувствительность рН штамма Δ rpoH. В целом, протоколы , представленные здесь , обеспечивают быстрый и простой подход к характеризации активности кислой активированного шаперона в пробирке, а также в контексте в естественных условиях.

протокол

1. Экспрессия и очистка периплазмической HdeB

Примечание: HdeB было выражено в Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB ¹⁰ и очищают от периплазме при полимиксина лизиса.

1. Подготовка ночной культуры Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB ¹⁰ в 30 мл LB , содержащей 200 мкг / мл ампициллина (LB _АМФ). Привить четыре 1 L культуры LB _Amp и вырастить их при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту до OD _600нм 0,7 не будет достигнута. Затем добавляют 300 мкМ IPTG, чтобы индуцировать экспрессию HdeB и уменьшить температуру роста до 30 ° С.
2. Через 5 часов экспрессии белка при 30 ° С, собирают клетки центрифугированием при 8000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
3. Промывают осадок клеток с помощью 100 мл буфера А (50 мМ Трис / HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и центрифугируют клетки снова при 8000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
4. Впоследствии, ресуспендируютосадок клеток в 80 мл буфера А, содержащего 1 мг / мл сульфата полимиксина. Для эффективного разрушения внешней мембраны, осторожно перемешать суспензии в течение 1 ч при температуре 4 ° С.
5. Для удаления цитоплазматической фракции и остатков клеток, центрифугирование суспензии в течение 20 мин при 15000 х г при 4 ° С. Это приводит к ~ 60 мл надосадочной жидкости, содержащей растворимый HdeB.
6. Диализировать супернатант, содержащий периплазматическому экстракт в течение ночи против 150x объема буфера В (20 мМ Трис / HCl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0) с использованием диализной мембраны с 6 кДа MW среза. Концентрат белков до 15 мл с помощью центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 3 кДа. Фильтр белкового раствора с использованием 0,2 мкм пор фильтра.
7. Нанесите белок на колонку анионообменной хроматографии (объем колонки 5 мл), который был уравновешен с 5 объемами колонки буфера В при скорости потока 2,5 мл / мин. После того, как белок наносили на колонку, колонку промывают буфером Б в течение 10 мин прискорость потока 2,5 мл / мин. Элюировать HdeB с линейным градиентом от 0 до 0,5 М NaCl в буфере В течение периода времени 50 мин со скоростью потока 2,5 мл / мин ^6.
8. Определение фракций, содержащих HdeB с использованием 15% SDS-PAGE. Смешайте 20 мкл образца с 5 мкл 5х восстановленного SDS буфера для загрузки. Нагрузка 10 мкл на гель и запустить в Трис-глицин-буфере (14,4 г / л глицина, 2,9 г / л Трис, 1 г / л додецилсульфата натрия, рН 8,3). Выполнить геля при 150 В до тех пор, пока бромфеноловый группа мигрировала близко к нижней части геля (~ 45 мин).
9. Бассейн всех HdeB-содержащие фракции, диализ при 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера хранения HdeB (50 мМ Трис / HCl, 200 мМ NaCl, рН 8,0), и концентрат белка приблизительно до 300 мкМ, с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 3 кДа. Определить концентрацию HdeB при 280 нм , используя коэффициент экстинкции е = _{280 нм} 15,595 М ^-1 см ^-1. Подготовьте 100 мкл аликвоты и флеш-бесплатноZe аликвоты в жидком азоте.
   Примечание: HdeB можно хранить при -70 ° С в течение не менее 6 месяцев.

2. Сопровождающий Анализ активности Использование Термически Разворачивание малатдегидрогеназу (МДГ)

Примечание: Влияние очищенного HdeB на агрегацию термически разворачивания свиную митохондриальную малатдегидрогеназу (MDH) при различных значениях рН контролировали, как описано ниже. Все перечисленные концентрации белка относятся к концентрации мономера.

1. Для подготовки МДГ, диализировать МДГ при температуре 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера С (50 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и концентрат белка приблизительно до 100 мкМ с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 30 кД.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное диализ МДГ требуется в качестве МДГ поставляется в виде раствора сульфата аммония.
2. Чтобы удалить агрегаты, центрифугировать белка в течение 20 мин при 20000 х г при 4 ° С. Определить концентрацию MDH по оптической плотности при длине волны 280 нм (ε <к югу от > 280 нм = 7950 М ^-1 см ^-1). Готовят 50 мкл аликвоты МДГ и флэш-замораживания аликвот для хранения.
3. Поместите 1 мл кварцевую кювету в флуоресцентном спектрофотометре, оборудованного с контролируемой температурой держатели для образцов и мешалкой. Установите λ _{ех / эм} до 350 нм.
4. Добавьте соответствующие объемы подогретого (43 ° C) буфера D (150 мМ фосфат калия, 150 мМ NaCl) при требуемых значениях рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0, рН 4,0 и рН 5,0) в кювету и множества температура в держатель кювет до 43 ° C. Общий объем составляет 1000 мкл.
5. Добавить 12,5 мкМ HdeB (или альтернативно один и тот же объем буфера для хранения HdeB для управления буфером) в буфер, а затем добавлением 0,5 мкМ МДГ. Начать мониторинг рассеяния света. Инкубируйте реакции в течение 360 сек, чтобы обеспечить достаточное раскрытие МДГ.
6. Повышения рН до 7 путем добавления 0.16-0.34 объема 2 М небуферизованном K ₂ HPO ₄ и продолжают повторнось рассеяния света на другой 440 сек.
7. Установить степень агрегации MDH, который записывается при отсутствии шаперона в определенной точке времени после нейтрализации (здесь после 500 сек, когда наблюдалось максимальное светорассеяние MDH) до 100%. Нормализовать активность HdeB по к сигналу рассеяния света от MDH в отсутствие HdeB при каждом указанном значении рН.

3. Обнаружение HdeB-СДГ комплексообразования Аналитической ультрацентрифугирования (ППК)

Примечание: Седиментационные эксперименты по скоростям по отдельности или в комплексе с термически разворачивания лактатдегидрогеназы (ЛДГ) HdeB были выполнены с использованием аналитической ультрацентрифуге.

1. Для подготовки ЛДГ, диализировать ЛДГ при температуре 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера С (50 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и концентрат белка приблизительно до 200 мкМ, с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 30 кД.
   Примечание: Тщательное диализного ЛДГ требуется, как LDН поставляется в виде раствора сульфата аммония.
2. Чтобы удалить агрегаты, центрифуга ЛДГ в течение 20 мин при 20000 х г при температуре 4 ° С. Определить концентрацию ЛДГ по оптической плотности при 280 нм (ε _{280 нм} = 43680 М ^-1 см ^-1). Готовят 50 мкл аликвоты ЛДГ и флэш-замораживания аликвот для хранения.
3. Выдержите 3 мкМ ЛДГ в присутствии и в отсутствие 30 мкМ HdeB в буфере D (рН 4 и 7, соответственно) в течение 15 мин при 41 ° C.
   Примечание: инкубация СДГ при более высоких температурах приводит к ее полной агрегации, и не шаперонная эффект HdeB можно наблюдать.
4. Пусть образцы охлаждают до комнатной температуры. Затем образцы загрузить в клетки, содержащие стандартную форму сектора 2-канальные с 1,2 центральные см длины пути. Загрузить клетки в ультрацентрифуге и уравновешивания до 22 ° С в течение не менее 1 ч до осаждения.
5. Образцы отжима при 22 ° С и 167000 XG в соответствующем роторе в течение 12 ч, а также следить за СЭДimentation из непрерывно при 280 нм белка. Как было показано ранее, соотношение сигнал-шум улучшается, когда передаваемая интенсивность света каждого канала измеряемое, а не оптической плотности. Это также улучшает качество последующей подгонки данных.
6. Провести анализ данных с SEDFIT (версия 15.01b, декабрь 2015), используя модель ¹⁷ распределения непрерывной C (S). Учебник , описывающий , как использовать SEDFIT можно найти в ссылке ^18.
   1. Установите уровень доверия для ME (Maximum Entropy) регуляризация до 0,7.
7. Вычислить плотность буфера, а также вязкость , используя SEDNTERP ^19. Для того, чтобы оценить количество агрегированного протеина клиента, сравнить интегралы осажденных ЛДГ в рН 4 до рН 7 в качестве эталона.
   Примечание: Интеграция графиков распределения оседания может быть сделано непосредственно в SEDFIT. Альтернативное программное обеспечение для анализа данных по скорости седиментации можно найти в недавнем обзоре ^20.

4. Мониторинг МДГ Инактивация и реактивации в присутствии HdeB

Примечание: Влияние очищенного HdeB на рефолдинга рН-разложенном МДГ определяли путем мониторинга активности MDH при нейтрализации.

1. Инкубируют 1 мкМ МДГ в буфере D в требуемых значениях рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0, рН 4,0 и рН 5,0) в течение 1 ч при 37 ° С в отсутствие или в присутствии 25 мкМ HdeB. Затем, сдвиг температуры до 20 ° С в течение 10 мин.
   Примечание: Ни один МДГ рефолдинга не наблюдалось даже в присутствии HdeB когда МДГ инкубировали при температуре выше 37 ° С.
2. Инициировать рефолдинга кислоты денатурированного МДГ, нейтрализуют пробы до рН 7 добавлением 0.13-0.42 объема 0,5 М фосфат натрия, рН 8,0.
3. После инкубации в течение 2 ч при температуре 20 ° С, определяют активность MDH путем мониторинга уменьшение НАДН при 340 нм ^9.
   Примечание: MDH катализирует NADH-зависимого снижения оксалоацетата в L-малат.
4. Смешайте 50 мкл реакционной смеси инкубации с 950 мкл буфера для анализа (50 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 1 мМ оксалоацетата и 150 мкМ NADH).
   Примечание: Конечная концентрация МДГ в буфере для анализа должен быть 44 нМ.
5. Контролировать изменение оптической плотности, используя спектрофотометр, оснащенный блоком контроля температуры Пельтье установлен на 20 ° C.
6. Отчет о MDH активность по сравнению с 44 нМ родной МДГ, которая была сохранена при рН 7,0.

5. Влияние HdeB сверхэкспрессии на Е. Выживание палочка под кислотному стрессу

Примечание: E. палочка 1655 геномную ДНК выделяли с использованием опубликованного протокола ^21.

1. Amplify hdeB из Е. палочки 1655 с помощью ПЦР с использованием праймеров hdeB - BamHI - I-Rev GGT GGT CTG GGA ТСС ТТА ATT CGG CAA GTC ATT и hdeB - EcoR I-ФВ GGT GAA TTC НКУ AGG AGG CGC ATG ААТ ATT TCA TCT CTC C.
2. Настройка реакции ПЦР в 50 мкл следующим образом : 10 мкл 5х полимеразы буфера, 200 мкМ дНТФ, 0,5 мкМ праймера JUD2, 0,5 мкМ праймера JUD5, 150 нг геномной 1655 ДНК, 0,5 мкл ДНК - полимеразы, добавляют DDH ₂ O до 50 мкл.
3. Выполните амплификацию hdeB следующим образом : Шаг 1: 5 мин при 95 & deg ; С, 1 цикл; шаг 2: 30 сек при 95 ° С, 30 сек при 55 ° С, 30 сек при 72 ° С, 40 циклов; Шаг 3: 10 мин при 72 ° С.
4. Клонирование в результате ПЦР - фрагмента в сайты EcoR I и BamH I плазмиды pBAD18 с использованием стандартных методов клонирования сайтов рестрикции. Очищают плазмиды с использованием набора для очистки плазмидной в соответствии с инструкциями изготовителя. Проверьте полученную плазмиду с помощью секвенирования ^10.
5. Transform плазмиды , выражающую HdeB или пустые pBAD18 борьбы с переносчиками в штамм BB7224 (Δ rpoH) (генотип: F ^-, λ ^-, e14 ^-, [araD139] _{B / г} [6; (ФГДД-ЛАК) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 ARAD ⁺ rpoH :: кан ^{+; 16)} с использованием химически компетентных клеток.
   Примечание: Этот штамм чувствительным к температуре.
6. После того, как 45 сек теплового шока при 42 ° С и до посева, инкубировать клетки при 30 ° С и 200 оборотах в минуту. Выполнение одной колонии Штриховатост-аутов из положительных клонов и инкубировать в течение ночи при 30 ° C. Подготовка ночной культуры в 50 мл LB _Amp и культивирования клеток , при 200 оборотах в минуту и 30 ° C.
7. Развести в течение ночи культуры в 40 раз в 25 мл LB - _Amp и расти бактерии , в присутствии 0,5% арабинозы (ARA) при температуре 30 ° C и 200 оборотов в минуту до OD _{600 нм} = 1,0 , чтобы индуцировать экспрессию белка HdeB.
8. Для экспериментов с рН сдвига, используют LBAmp + Ара разбавить клетки OD _{600 нм} 0,5 и приспосабливаться к соответствующим значениям рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0 и рН 4,0) путем добавления соответствующих объемов 5 М HCl.
9. После того, как указанные моменты времени (рН 2, 1 мин; рН 3, 2,5 мин; рН 4, 30 мин), нейтрализуют культур путем добавления соответствующих объемов 5М NaOH.
10. Следить за ростом нейтрализованных культур в жидкой культуре в течение 12 ч при 30 ° С с использованием измерений оптической плотности.

Результаты

HdeA и HdeB гомологичны E. палочки белки, известные защитить периплазмической белки от кислых условиях стресса ^10. Наша работа показала, что похоже на HdeA, HdeB также функционирует как кислотный активированными молекул компаньонку. Тем не менее, в отличие от функций ...

Обсуждение

Для изучения механизма активации и шаперонного функции HdeB, большие количества HdeB должны быть экспрессирован и очищен. Ряд векторных систем экспрессии доступны для получения высоких уровней белка-мишени, в том числе PTRC или pBAD векторы, оба из которых были использованы в этом исследов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786