Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Resumo

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Resumo

As bactérias são freqüentemente expostos a mudanças ambientais, tais como alterações no pH, temperatura, estado redox, a exposição à luz ou força mecânica. Muitas destas condições causar proteína se desdobrar na célula e ter um impacto negativo sobre a sobrevivência do organismo. Um grupo de chaperonas moleculares independentes, específicos de stress têm sido mostrados para desempenhar papéis essenciais na sobrevivência destas condições de stress. Enquanto totalmente dobrado e acompanhante-inativo antes de stress, estas proteínas se desdobram rapidamente e se tornar acompanhante-ativa sob condições de estresse específicos. Uma vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenados se ligam a um grande número de proteínas de agregação propensas diferentes, impedir a sua agregação e facilitar, quer directamente ou indirectamente, a proteína de redobragem após o regresso a condições não-tensão. A abordagem principal para ganhar uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo da sua activação e cliente reconhecimento envolve a purificação e subsequent caracterização dessas proteínas chaperonas utilizando ensaios in vitro. Follow-up em ensaios de estresse in vivo são absolutamente essenciais para confirmar independentemente o obtido resultados in vitro.

Este protocolo descreve in vitro e in vivo em métodos para caracterizar a actividade de chaperona E. coli HdeB, uma chaperona activadas por ácido. Medições de dispersão de luz foram utilizados como uma leitura conveniente limite para a capacidade de HdeB para prevenir a agregação induzida por ácido de uma proteína modelo estabelecido cliente, MDH, in vitro. experimentos ultracentrifugação analítica foram aplicados para revelar formação de complexos entre HdeB e sua LDH proteína cliente, para lançar luz sobre o destino de proteínas clientes após o seu regresso a condições não-estresse. ensaios de actividade enzimática das proteínas de cliente foram conduzidos para monitorizar os efeitos da inactivação HdeB no cliente induzida pelo pH e reactivação. Finalmente, os estudos de sobrevivência foram usadas para monitor a influência da função da chaperona HdeB in vivo.

Introdução

Um ambiente natural comum em que agentes patogénicos microbianos experimentar condições de desdobramento da proteína induzida por ácido do estômago de mamífero é (gama de pH 1-4), cujo pH ácido serve como uma barreira eficaz contra agentes patogénicos de origem alimentar ^1. Proteína se desdobrar e agregação, que é causada por protonação cadeia lateral de aminoácido, afecta os processos biológicos, danifica as estruturas celulares e, eventualmente, ^1,2 provoca a morte celular. Uma vez que o pH do periplasma bacteriano equilibra-se quase instantaneamente com o pH do ambiente devido à livre difusão de protões através da membrana exterior porosa, proteínas da membrana periplasmática e interiores das bactérias Gram-negativas são os componentes celulares mais vulneráveis em condições ácidas com o stress ^3. Para proteger sua proteoma periplasmático contra danos mediada pelo ácido rápida, bactérias Gram-negativas utilizar os chaperones peripl�micos ativada por ácido HdeA e HdeB. HdeA é um acompanhante condicionalmente desordenada ^{4,5: A um pH neutro, HdeA está presente como um dímero dobrado, a chaperona inactivo. Era uma mudança de pH abaixo de pH 3, função de acompanhante de HdeA é rapidamente activado 6,7. Ativação de HdeA requer profundas mudanças estruturais, incluindo a sua dissociação em monómeros, e a parcial desdobramento dos monômeros 6-8. Uma vez activado, HdeA liga-se a proteínas que se desdobram em condições ácidas. Ele evita eficazmente a sua agregação, tanto durante a incubação a pH baixo, bem como mediante a neutralização do pH. Ao retornar para pH 7,0, HdeA facilita a re-enrolamento de suas proteínas clientes de forma ATP-independente e converte de volta em seu dimérica, conformação acompanhá-inativa 9. Da mesma forma, o HdeB chaperona homóloga também é chaperona inactiva a um pH de 7,0. Ao contrário HdeA, no entanto, a atividade acompanhante de HdeB atinge o seu máximo aparente em pH 4,0, as condições sob as quais HdeB é ainda largamente postas e diméricas 10. Além disso, reduzindo ainda mais os caus pHes a inativação de HdeB. Estes resultados sugerem que apesar da sua extensa homologia, e HdeA HdeB diferem no seu modo de activação funcional que lhes permite cobrir uma ampla gama de pH com a sua função acompanhante de protecção. Um outro chaperona que tem sido implicado na resistência aos ácidos dos E. coli é o Hsp31 citoplasmática, que aparece para estabilizar proteínas desdobradas cliente até que as condições neutras são restaurados. O modo de acção exacto de Hsp31, no entanto, manteve-se enigmática 12. Tendo em conta que outras bactérias enteropatogénicas tais como Salmonella falta o operão hdeAB, é muito provável que outros acompanhantes periplásmicos ainda não identificadas podem existir que estão envolvidos na resistência ao ácido destas bactérias 11.}

Os protocolos aqui apresentados permitem monitorizar a actividade de chaperona dependente do pH de HdeB in vitro e in vivo ¹⁰ e pode ser aplicado na investigação de outras chaperonastais como Hsp31. Em alternativa, a rede complexa de factores de transcrição que controlam a expressão de hdeAB pode potencialmente ser investigadas pelo ensaio de stress in vivo. Para caracterizar a função de acompanhante de proteínas in vivo, diferentes configurações experimentais podem ser aplicadas. Um caminho é aplicar condições de estresse desdobramento de proteínas e fenotipicamente caracterizar cepas mutantes que ou sobre-expressam o gene de interesse ou carregam uma deleção do gene. Proteomic estudos podem ser conduzidos para identificar quais as proteínas não agregadas sob condições de stress, quando a chaperona está presente, ou a influência de uma chaperona em uma enzima específica pode ser determinada durante condições de stress, utilizando ensaios enzimáticos ^14-16. Neste estudo, optou-se sobre-expressar HdeB em uma cepa rpoH exclusão, que não tem o fator sigma de choque térmico 32. rpoH controla a expressão de todos os principais E. chaperones coli e sua eliminação é conhecido por aumentar sensitivity a condições de stress ambientais que causam a proteína se desdobrar ^15. A actividade in vivo de chaperona em HdeB foi determinada através da monitorização da sua capacidade para suprimir a sensibilidade da estirpe Δ rpoH pH. Ao todo, os protocolos aqui apresentados fornecem uma abordagem rápida e directa para caracterizar a actividade de uma chaperona activada por ácido in vitro, assim como no contexto in vivo.

Protocolo

1. Expressão e purificação de periplásmico HdeB

NOTA: HdeB foi expressa em E. células de E. coli que albergam o plasmídeo pTrc- hdeB ^10, e purificado a partir do periplasma de lise mediante polimixina.

1. Prepara-se uma cultura durante a noite de E. células de E. coli que albergam o plasmídeo pTrc- hdeB ¹⁰ em 30 ml de LB contendo 200 ug / ml de ampicilina (LB _AMP). Inocular quatro culturas 1 L de LB _Amp e crescê-las a 37 ° C e 200 rpm até OD _600nm de 0,7 seja alcançado. Em seguida, adicionam-se 300 ^ M de IPTG para induzir a expressão de HdeB e diminuir a temperatura de crescimento para 30 ° C.
2. Após 5 h de expressão de proteína a 30 ° C, a colheita das células por centrifugação a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C.
3. Lava-se a pelete de células com 100 ml de tampão A (Tris / HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e centrifuga-se novamente as células a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Subsequentemente, ressuspendero sedimento celular em 80 ml de tampão A, contendo 1 mg / ml de sulfato de polimixina. Para perturbações eficiente da membrana externa, agita-se suavemente a suspensão durante 1 hora a 4 ° C.
5. Para remover a fracção citoplasmática e os detritos celulares, Centrifugar a suspensão durante 20 min a 15000 xg, a 4 ° C. Isto resulta em ~ 60 ml de sobrenadante contendo o HdeB solúvel.
6. Dialisar o sobrenadante contendo o extracto periplasmático durante a noite contra o volume 150 vezes de tampão B (Tris 20 mM / HCl, EDTA 0,5 mM, pH 8,0) utilizando uma membrana de diálise com 6 kDa de PM de. Concentram-se as proteínas para 15 mL utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de exclusão de 3 kDa. Filtra-se a solução de proteína através de um filtro de 0,2 um de poro.
7. Aplicar a proteína numa coluna de cromatografia de permuta aniónica (volume de coluna de 5 ml) que tinha sido equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão B com um caudal de 2,5 ml / min. Uma vez que a proteína é carregada sobre a coluna, lava-se a coluna com tampão B durante 10 min aum caudal de 2,5 ml / min. Eluir HdeB com um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,5 M em tampão B ao longo de um período de tempo de 50 min com um caudal de 2,5 ml / min ^6.
8. Identificar fracções contendo HdeB usando um 15% de SDS-PAGE. Misture 20 mL da amostra com 5 mL de 5x reduzida tampão de carga SDS. Carga de 10 ul sobre o gel e executar em tampão de Tris-glicina (14,4 g / l de glicina, 2,9 g / L de Tris, 1 g / L de sulfato de dodecilo de sódio, pH 8,3). Submeter o gel a 150 V até que a banda tenha migrado bromofenol perto do fundo do gel (~ 45 min).
9. Piscina todas as fracções HdeB contendo, diálise a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão de armazenamento HdeB (50 mM Tris / HCl, 200 mM de NaCl, pH 8,0), e concentra-se a proteína a aproximadamente 300 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 3 kDa. Determinar a concentração de HdeB a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção ε _{280 nm} = 15595 M ^-1 cm ^-1. Prepare 100 mL alíquotas e sem flashze as alíquotas em nitrogênio líquido.
   NOTA: HdeB pode ser armazenado a -70 ° C durante pelo menos 6 meses.

2. Chaperone Atividade ensaio utilizando termicamente Unfolding malato desidrogenase (MDH)

NOTA: A influência da HdeB purificado sobre a agregação de desdobrar termicamente porcino malato desidrogenase mitocondrial (MDH) a diferentes valores de pH foi monitorizado tal como descrito abaixo. Todas as concentrações de proteína listadas referem-se a concentração de monómero.

1. Para preparar MDH, dialisar MDH a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão C (fosfato de potássio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e concentra-se a proteína a aproximadamente 100 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 30 kDa.
   NOTA: diálise cuidadosa de MDH é necessária como MDH é entregue como solução de sulfato de amónio.
2. Para remover os agregados, centrifugar a proteína durante 20 minutos a 20000 xg, a 4 ° C. Determinar a concentração MDH por absorvância a 280 nm (ε _{280 nm = 7950 M ^-1 cm ^-1). Prepare 50 mL alíquotas de MDH e flash-congelar as alíquotas para armazenamento.}
3. Coloque 1 ml cuvete de quartzo num espectrofotómetro de fluorescência equipado com suportes de amostras de temperatura controlada e agitador. Definir _ex λ _{/ em} até 350 nm.
4. Adicionar volumes adequados de pré-aquecido (43 ° C) de tampão D (fosfato de potássio 150 mM, NaCl 150 mM) com os valores desejados de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) para a cuvete e conjunto a temperatura no suporte da cuvete a 43 ° C. O volume total é de 1000 jil.
5. Adicionar 12,5? M HdeB (ou alternativamente o mesmo volume de tampão de armazenamento HdeB para o controlo tampão) para o tampão, seguido pela adição de 0,5 uM MDH. Começar a monitorar a dispersão da luz. Incubar a mistura reaccional durante 360 ​​segundos para permitir que suficiente desdobramento de MDH.
6. Elevar o pH para 7 pela adição de 0,16-0,34 volume de 2 M não tamponada K ₂ HPO ₄ e continuar regundo a dispersão de luz para a outra 440 seg.
7. Definir a extensão da agregação MDH que é gravado na ausência da chaperona em um ponto de tempo definido depois da neutralização (aqui depois de 500 segundos, quando foi observada dispersão da luz máxima de MDH) a 100%. Normalizar a actividade do HdeB ao sinal de dispersão da luz de MDH na ausência de HdeB a cada valor de pH indicado.

3. Detecção de HdeB-LDH Formação do Complexo pela Analytical Ultracentrifugação (AUC)

NOTA: Sedimentação experiências de velocidade de HdeB isoladamente ou em complexo com termicamente desdobramento da lactato desidrogenase (LDH) foram realizadas usando uma ultracentrífuga analítica.

1. Para preparar a LDH, dialisar LDH a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão C (fosfato de potássio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e concentra-se a proteína a aproximadamente 200 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 30 kDa.
   NOTA: diálise cuidadosa da LDH é necessária como LDH é entregue como uma solução de sulfato de amónio.
2. Para remover os agregados, centrífuga de LDH durante 20 min a 20000 xg, a 4 ° C. Determinar a concentração de LDH por absorvância a 280 nm (ε _{280 nm} = 43680 M ^-1 cm ^-1). Prepare 50 mL alíquotas de LDH e flash-congelar as alíquotas para armazenamento.
3. Incubar 3 LDH uM na presença e ausência de 30 uM HdeB em tampão D (pH 4 e 7, respectivamente) durante 15 min a 41 ° C.
   NOTA: A incubação da LDH a temperaturas mais elevadas resulta em completa a sua agregação, e nenhum efeito de chaperona HdeB pode ser observada.
4. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras de carga em células contendo sector padrão em forma de peças centrais de 2 canais com comprimento de caminho 1,2 cm. Carregar as células na ultracentrífuga e equilibrar a 22 ° C durante pelo menos 1 h antes de sedimentação.
5. amostras de rotação a 22 ° C e 167.000 xg no respectivo rotor durante 12 h, e monitorar o sedimentation da proteína continuamente a 280 nm. Como demonstrado anteriormente, a relação sinal-ruído é melhorada quando a intensidade da luz transmitida de cada canal é medido em vez de absorvância. Isto também melhora a qualidade da subsequente ajuste de dados.
6. Realizar análise de dados com SEDFIT (versão 15.01b, dezembro de 2015), utilizando a contínua c (s) modelo de distribuição ^17. Um tutorial descreve como usar SEDFIT podem ser encontrados na referência ^18.
   1. Definir o nível de confiança para a regularização ME (Máxima Entropia) a 0,7.
7. Calcular a densidade de tampão, bem como a viscosidade usando SEDNTERP ^19. Para estimar a quantidade de proteína agregada cliente, comparar os integrais de LDH sedimentada em pH 4 a pH 7, como uma referência.
   NOTA: Integração das parcelas de distribuição de sedimentação pode ser feito diretamente no SEDFIT. Software alternativa para analisar dados de velocidade de sedimentação podem ser encontrados em uma revisão recente ^20.

4. Acompanhamento MDH Inactivação e Reativação na Presença de HdeB

NOTA: A influência da HdeB purificado sobre o re-enrolamento de pH-desdobrado MDH foi determinada pela monitorização da actividade MDH mediante neutralização.

1. Incubar 1 uM MDH em tampão D, com os valores desejados de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) durante 1 h a 37 ° C na ausência ou na presença de 25 uM HdeB. Em seguida, deslocar a temperatura a 20 ° C durante 10 min.
   NOTA: Não MDH redobragem foi observada mesmo na presença de HdeB quando MDH foi incubada a temperaturas superiores a 37 ° C.
2. Para iniciar o re-enrolamento de ácido MDH desnaturado, neutralizar as amostras a pH 7 pela adição de 0,13-0,42 volume de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,0.
3. Após incubação durante 2 horas a 20 ° C, determinar a actividade MDH através da monitorização da queda de NADH a 340 nm ^9.
   NOTA: MDH catalisa a redução dependente de NADH de oxaloacetato em L-malato.
   1. Misturar 50 uL da reacção de incubação com 950 ul de tampão de ensaio (fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, 1 mM de oxaloacetato, e 150 ^ M de NADH).
      NOTA: A concentração final de MDH no tampão de ensaio deve ser de 44 nM.
   2. Monitorar a variação de absorvância utilizando um espectrofotómetro, equipada com um bloco de controlo de temperatura de Peltier ajustado para 20 ° C.
   3. Relatar a atividade MDH relativa a 44 nM MDH nativa que foi mantida a pH 7.0.

5. Efeito de HdeB A sobre-expressão em E. coli Sobrevivência ao estresse por ácido

NOTA: E. coli MG1655 ADN genómico foi isolado utilizando um protocolo publicado a ^21.

1. Amplificar hdeB de E. MG1655 coli por PCR usando primers hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG ATT CAA GTC e hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT TCA TCA TCT CTC C.
2. Defina-se a reacção de PCR em 50 ul da seguinte forma: 10 L de 5x tampão de polimerase, 200 uM de dNTP, 0,5 uM de iniciadores JUD2, 0,5 uM de iniciadores JUD5, 150 ng MG1655 de DNA genómico, 0,5 de polimerase de ADN ul, adicionar _ddH2O a 50 ul.
3. Efectue a amplificação de hdeB como se segue: Passo 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; Etapa 2: 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C, 40 ciclos; Passo 3: 10 min a 72 ° C.
4. O clone resultante fragmento de PCR nos sítios EcoR I e BamH I do plasmídeo pBAD18 usando métodos padrão para o sítio de restrição de clonagem. Purifica-se o plasmídeo utilizando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Verifique se o plasmídeo resultante por sequenciamento ^10.
5. Transformar o plasmídeo expressando HdeB ou os pBAD18 de controle de vetores vazios em BB7224 tensão (Δ rpoH) (genótipo: F ^-, λ ^-, e14 ^-, [araD139] _{B / r} [6; (argFlac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (FIMB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 araD ⁺ rpoH :: kan ^{+; 16)} usando células quimicamente competentes.
   NOTA: Esta estirpe é sensível à temperatura.
6. Depois de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C e antes do plaqueamento, as células incubar a 30 ° C e 200 rpm. Realizar colónias raia-saídas individuais dos clones positivos e incubar durante a noite a 30 ° C. Prepara-se uma cultura durante a noite em 50 ml de LB _Amp e cultivar as células a 200 rpm e 30 ° C.
7. Dilui-se as culturas durante a noite de 40-vezes em 25 ml de LB _Amp e as bactérias crescem na presença de 0,5% de arabinose (Ara) a 30 ° C e 200 rpm para um OD _{600 nm} = 1,0 para induzir a expressão da proteína HdeB.
8. Para as experiências de deslocamento de pH, utilizar LBAmp Ara + para diluir as células a _{600 nm} de 0,5 OD e ajustar-se os respectivos valores de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0 e pH 4,0) por adição de quantidades apropriadas de HCl a 5 m.
9. Após os pontos de tempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min, pH 4, 30 min), neutralizar as culturas por adição das quantidades apropriadas de NaOH 5 M.
10. Monitorar o crescimento das culturas neutralizados em cultura líquida durante 12 horas a 30 ° C, utilizando medições de densidade óptica.

Resultados

HdeA HdeB e são homólogas de E. proteínas coli, conhecida para proteger proteínas peripl�micos contra condições de estresse ácido ^10. O nosso trabalho mostrou que semelhante ao HdeA, HdeB também funciona como um ácido activado de chaperona molecular. No entanto, em contraste com funções HdeA, HdeB a um pH que ainda é potencialmente bactericida, mas significativamente mais elevada do que o óptimo de pH HdeA ^6,9,10,22. Para investig...

Discussão

A fim de estudar o mecanismo de activação e função de chaperona de HdeB, grandes quantidades de HdeB tem que ser expresso e purificado. Um número de sistemas de vector de expressão estão disponíveis para a produção de níveis elevados de uma proteína alvo, incluindo vectores pTrc ou pBAD, ambos os quais foram utilizados neste estudo. Os promotores sejam facilmente acessíveis para E. coli RNA polimerase e expressão, assim, permitir fortemente regulada positivamente de HdeB em qualquer E. c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786