جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

Summary

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Abstract

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Introduction

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protocol

1. تمييع المستضدات وتوليد مستضد ميكروأرس

1. تمييع المستضدات في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل. طباعة ما يصل إلى 162 مستضدات فريدة من نوعها في مكررة مع تكوين microarrayer مع 9 دبابيس. تشمل مفتش والغلوبولين المناعي المستضدات في المكتبة مستضد الضوابط الإيجابية. يشمل برنامج تلفزيوني فقط كوسيلة لمراقبة سلبية.
2. إضافة 20 ميكرولتر من كل مستضد لوحة مصدر جيدا 384. إضافة مستضدات لوحة مصدر في الجماعات التي تعكس الإعداد لرأس الطباعة (على سبيل المثال، وترتيب المستضدات في مجموعات من 9 عندما تستخدم 9 دبابيس للطباعة).
3. لوحة الغلاف مصدر احباط وتجميد في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للطباعة المصفوفات.
4. تنظيف دبابيس microarrayer الصلبة التي يحتضنها منهم في حمام sonicating مع الماء منزوع الأيونات لمدة 3 × 1 دقيقة. دبابيس مكان في الرف حتى يجف ثم ترتيب الدبابيس في رأس الطباعة ميكروأري. ل9 دبابيس، استخدام تكوين 3 × 3.
5. microarrayer برنامج للطباعة تديرها وضع دبابيس الرقم على رأس الطباعة،عدد من الشرائح لطباعة، وعدد من منصات على كل شريحة، وعدد من البقع تكرار لكل مستضد. عادة، استخدم 9 دبابيس، 70 الشرائح، 2 منصات / الشرائح، و 2 البقع تكرار لكل مستضد. microarrayer برنامج ليصوتن المسامير في المياه بين مجموعات مختلفة من المستضدات.
6. لوحة مصدر ذوبان الجليد ولوحة ثم الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 100 × ز. وضع لوحة مصدر في بقعة معينة في microarrayer. إزالة قسم من رقائق أن تغطي المجموعة الأولى من مولدات المضادات التي سيتم طباعتها.
7. ترتيب الشرائح غير مطبوع على سطح arrayer وبرنامج تشغيل الطباعة. طباعة الشرائح في RT مع الرطوبة وضعت على arrayer في 55-60٪ مع البناء في المرطب للآلة مجموعة.
8. بعد طباعة كل مجموعة من المستضدات على كافة الشرائح، وقفة microarrayer. تغطية مولدات المضادات التي طبعت فقط مع رقائق (لمنع التبخر) وكشف المجموعة التالية من مولدات المضادات التي سيتم طباعتها. يواصل برنامج الطباعة.
9. بعد وقد طبعت جميع مولدات المضادات، مصدر غطاء ررأكل مع قطعة جديدة من احباط وتجميد في -80 درجة مئوية. وضع الشرائح المطبوعة في مربع الشريحة وختم فراغ. ويمكن استخدام الشرائح في اليوم التالي أو بعد شهر واحد.

2. جس مستضد ميكروأرس مع المخفف سيرا

1. وضع الشرائح في الإطارات باستخدام غرف الحضانة. إضافة 700 ميكرولتر من عرقلة العازلة (2.5٪ [المجلد / المجلد] الجنين مصل العجل (FCS)، 0.1٪ [المجلد / المجلد] توين 20 في برنامج تلفزيوني) على كل سطح صفيف.
2. وضع فيلم لاصقة أكثر من إطار وضعها في حاوية مغلقة مع قطعة من النسيج الرطب. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز.
3. تمييع عينات مصل 1: 100 في عرقلة العازلة. نضح عرقلة الحل من المصفوفات وإضافة 500 ميكرولتر من العينة المخففة على كل سطح صفيف.
4. مع تغطية فيلم لاصق واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع هزاز.
5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة العازلة. للدراسات الإنسانية، وتمييع الأجسام المضادة مفتش و Cy3 المسمى الماعز مكافحة الإنسان إلى 0.33 ميكروغرام / مل وCy5 المسمى الماعز المضادة للهومان الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة إلى 0.25 ميكروغرام / مل. للدراسات الماوس، وتمييع لو Cy3 المسمى الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد إلى 0.38 ميكروغرام / مل وCy5 المسمى الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة إلى 0.7 ميكروغرام / مل.
6. عينات نضح من المصفوفات وشطف السطوح مجموعة 4 مرات مع العازلة شطف (0.1٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني). صب العازلة على الشرائح ونفض الغبار قبالة بسرعة.
7. إضافة 700 ميكرولتر من عرقلة العازلة لغسل كل سطح مجموعة واحتضان 10 دقيقة في RT مع هزاز. كرر غسل خطوتين أكثر من مرة.
8. إضافة 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف على كل سطح الشريحة، وتغطي مع فيلم لاصق. احتضان 45 دقيقة على 4 درجات مئوية مع هزاز.
9. نضح مزيج الأجسام المضادة الثانوية من الشرائح وشطف 4 مرات على النحو الوارد أعلاه. غسل الشرائح 3 مرات مع 700 ميكرولتر من عرقلة العازلة / التخفيف على النحو الوارد أعلاه.
10. إزالة الشرائح من الإطارات وضعها في معدن الرف الشريحة التي هي مغمورة في برنامج تلفزيوني. احتضان 20 دقيقة في RT مع الهز المداري. وضع في حاوية جديدة من برنامج تلفزيوني واحتضان 20 م آخرفي مع اهتزاز.
11. مكان رف الشريحة في حاوية من الماء منزوع الأيونات 15 ثانية. وضع رف في حاوية جديدة للمياه واحتضان 15 ثانية أخرى.
12. على الشرائح الجافة، مكان الرف الشريحة على محول لوحة ELISA في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 220 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
13. وضع الشرائح في ضوء مربع محكم حتى على استعداد للمسح الضوئي.

3. المسح مستضد ميكروأرس وبيانات المصدرة لل

1. الشرائح المسح الضوئي باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري التي يمكن الكشف عن و Cy3 Cy5 الإشارات الفلورسنت. من أجل ضبط أنبوب مضخم (PMT) مستويات الماسح الضوئي، قبل مسح الشريحة التي تم بحثها فقط مع الأجسام المضادة الثانوية.
   ملاحظة: يجب أن يكون هذا الانزلاق المكتبة مستضد كامل مطبوع عليها بما في ذلك إيجابيا (مفتش والغلوبولين المناعي)، وكذلك الضوابط سلبية (PBS). ما قبل الفحص الفحص منخفض القرار الذي يسمح للمستخدم بسرعة للعثور على إعدادات PMT المثلى.
2. تعيين القيم PMT بحيث ملامح الإنسان مفتش (على قناة و Cy3) وهمهمةوميزات الغلوبولين المناعي (على قناة Cy5) لديها مماثلة متوسط ​​كثافة مضان ناقص الخلفية (MFI-B) (عادة 40000). يتم تعيين مستويات PMT عن طريق الضغط على زر "الأجهزة". مجموعة مرة واحدة، والحفاظ على هذه الإعدادات PMT ثابت.
3. مسح الشرائح التجريبية على قناتين عن طريق الضغط على زر "مسح". حفظ الصور الشريحة (كل القنوات) بعد كل فحص.
4. تحميل الشرائح ليتم تحليلها في البرنامج ميكروأري باستخدام زر "ملف".
5. تحميل ملف قائمة مجموعة الجينات (GAL) باستخدام زر "ملف". الملف غال لديه تخطيط مجموعة مع هويات ميزات مجموعة.
6. وضع قالب مجموعة فوق الصورة الممسوحة ضوئيا بحيث صفائف ميزات تطابق قالب قدر الإمكان.
7. محاذاة الميزات في جميع الكتل مع القالب عن طريق الضغط على زر "محاذاة". هذا البرنامج سوف تجد عموما الخطوط العريضة لملامح الدائرية ولكن بعض التعديلات اليدوية التي قد تكون ضرورية. هذه التعديلات يمكن عن طريق إدخال وضع الميزة. يقوم البرنامج ثم حساب مؤسسات التمويل الأصغر-B لكل من المستضدات.
8. استخدم زر "ملف" لتصدير هذه النتائج كملف نصي.

4. تحليل البيانات صفيف مع تحليل أهمية ميكروأرس (SAM)

1. تحميل ملفات نصية الفردية في التفوق وتحديد الأعمدة التي لها مؤسسات التمويل الأصغر-B للقنوات و Cy3 Cy5.
2. حساب متوسط ​​للميزات مكررة.
3. للحصول على أي سلبي MFI-B، استبدل رقم سالب مع 10. تحويل البيانات من خلال تقسيم الخام MFI-B في 100 وبعد ذلك عن طريق حساب قاعدة سجل 2.
4. تحليل البيانات المحولة سجل مع تحليل أهمية ميكروأرس (SAM) كما هو موضح سابقا ^7.
5. لدراسة استخدام مجموعتين (على سبيل المثال، من الاصحاء مقابل المرضى)، والتسمية مجموعة واحدة "1" ومجموعة "2." استخدام من الدرجة الثانية، تحليل أونبايريد في SAM لتحديد المستضدات نشاطية أن لياليمختلفة ignificantly بين المجموعتين (قيمة ف <0.05).
6. استخدام تجميع وتوليد الحرارة خريطة البرامج لجعل الصور لعرضها ^8.

النتائج

يتم ترتيب المستضدات في لوحة جيدا 384 وطباعتها على الشرائح من قبل microarrayer الروبوتية كما هو مبين في الشكل رقم 1 يبين الشكل 2 شرائح توضع في الإطار مع غرف حضانة وشريحة فحصها بعد المعالجة. ويبين الشكل 3 الشرائح الموجبة والسالبة ال?...

Discussion

بروتوكول صفها هنا يسمح لتقدير حجم الأجسام المضادة باستخدام تقنية مستضد ميكروأري. ميكروأرس المستضد توفر العديد من المزايا ELISA التقليدية في الكشف عن الأجسام المضادة. أولا وقبل كل شيء، مجموعة متنوعة من مولدات المضادات بما في ذلك الأحماض النووية والبروتينات والببتيدات...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)