Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

Riepilogo

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Abstract

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Introduzione

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protocollo

1. Diluitori antigeni e la generazione di Antigen Microarrays

1. Diluire antigeni in PBS ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml. Stampa fino a 162 antigeni unici in duplice copia con una configurazione microarrayer a 9 pin. Includere antigeni IgG e IgM nella libreria antigene come controlli positivi. Include PBS solo come controllo negativo.
2. Aggiungere 20 ml di ciascun antigene alla piastra fonte ben 384. Aggiungere antigeni alla piastra di origine in gruppi che rispecchiano l'impostazione della testina di stampa (ad esempio, organizzare gli antigeni in gruppi di 9 quando 9 pin sono utilizzati per la stampa).
3. Piastra fonte di copertura con un foglio e congelamento a -80 ° C fino al momento di stampare array.
4. Pulire perni microarrayer solidi incubandoli in un bagno sonicating con acqua deionizzata per 3 x 1 min. Posizionare i perni in cremagliera a secco e poi organizzare perni in microarray testina di stampa. Per 9 pin, utilizzare una configurazione 3 x 3.
5. microarrayer Programma per la stampa gestito impostando perni numerici testina di stampa,numero di diapositive per la stampa, il numero di pastiglie su ogni diapositiva, e il numero di punti di repliche per ciascun antigene. In genere, utilizzare 9 pin, 70 scivoli, 2 pastiglie / scivolo, e 2 punti di repliche per ciascun antigene. microarrayer Programma per Sonicare perni in acqua tra i diversi gruppi di antigeni.
6. Piastra fonte disgelo e la piastra poi centrifugare per 1 min a 100 x g. Mettere piatto di origine nel punto indicato in microarrayer. Rimuovere la sezione di foglio che copre il primo gruppo di antigeni da stampare.
7. Disporre diapositive non stampati sulla superficie Arrayer e il programma di tiratura. scivoli di stampa a temperatura ambiente con umidità impostati sul Arrayer al 55 - 60% con la build umidificatore della macchina array.
8. Dopo ogni gruppo di antigeni è stampato su tutte le diapositive, mettere in pausa il microarrayer. Coprire gli antigeni che sono stati appena stampati con un foglio (per evitare l'evaporazione) e scoprire il successivo gruppo di antigeni da stampare. Continuare programma di stampa.
9. Dopo che tutti gli antigeni sono stati stampati, fonte di copertura plmangiato con nuovo pezzo di stagnola e congelare a -80 ° C. Mettere diapositive stampate in scatola di diapositive e tenuta di vuoto. I vetrini possono essere utilizzati il ​​giorno successivo o fino a un mese dopo.

2. Probing Antigen microarray con diluito Sera

1. Collocare i vetrini in frame utilizzando camere di incubazione. Aggiungere 700 ml di tampone bloccante (2,5% [vol / vol] siero fetale di vitello (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 in PBS) per ciascuna superficie matrice.
2. Mettere pellicola adesiva su telaio e posto in un contenitore sigillato con un pezzo di tessuto bagnato. Incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico.
3. Diluire i campioni di siero 1: 100 in tampone di bloccaggio. Aspirare soluzione bloccante da array e aggiungere 500 ml di campione diluito ad ogni superficie array.
4. Coprire con pellicola adesiva e incubare per 1 ora a 4 ° C con dondolo.
5. Diluire anticorpi secondari in tampone di bloccaggio. Per gli studi umani, diluire un anticorpi IgG di capra Cy3 marcato anti-umano a 0,33 mg / ml e una Cy5 etichettati capra anti-Human anticorpi IgM a 0,25 mg / ml. Per gli studi di topo, diluire un Cy3 marcato anticorpi di capra anti-topo IgG a 0,38 mg / ml e Cy5 etichettato capra anti-topo IgM anticorpi a 0,7 mg / ml.
6. Aspirare campioni di matrici e risciacquare le superfici di matrice 4 volte con tampone di lavaggio (0,1% di Tween 20 in PBS). Versare tampone su di diapositive e sfogliare rapidamente.
7. Aggiungere 700 ml di tampone di bloccaggio per lavare ogni superficie matrice e incubare 10 minuti a temperatura ambiente con dondolo. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
8. Aggiungere 500 ml di anticorpo secondario diluito ad ogni superficie di scorrimento e coprire con pellicola adesiva. Incubare 45 minuti a 4 ° C con dondolo.
9. Aspirare miscela anticorpo secondario da diapositive e risciacquare 4 volte come sopra. Lavare i vetrini 3 volte con 700 ml di tampone di bloccaggio / diluizione come sopra.
10. Estrarre i vetrini da cornici e posto in cremagliera scorrevole di metallo che è immerso in PBS. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente con agitazione orbitale. Mettere in nuovo contenitore di PBS e incubare un altro 20 mcon agitazione.
11. Cremagliera scorrevole in un contenitore di acqua deionizzata 15 sec. Inserire rack in un nuovo contenitore di acqua e incubare altri 15 sec.
12. Per diapositive a secco, la cremagliera di diapositive su un adattatore piastra ELISA in centrifuga e far girare a 220 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
13. Mettere in cassette a tenuta di luce fino pronto per la scansione.

3. La scansione Antigen microarray ed esportazione dei dati

1. Scansione di diapositive utilizzando uno scanner microarray in grado di rilevare i segnali fluorescenti Cy3 e Cy5. Al fine di regolare i livelli tubo fotomoltiplicatore (PMT) dallo scanner, pre-scansione di una diapositiva che è stato sondato soltanto con anticorpi secondari.
   Nota: Questa diapositiva dovrebbe avere la libreria antigene intero stampata su di esso compreso positivo (IgG e IgM) e controlli negativi (PBS). La pre-scansione è una scansione a bassa risoluzione che permette rapidamente all'utente di trovare le impostazioni ottimali PMT.
2. Impostare i valori di PMT in modo che le caratteristiche umane IgG (sul canale Cy3) e il ronziouna funzionalità IgM (sul canale Cy5) hanno una simile intensità di fluorescenza mediana meno sfondo (MFI-B) (in genere 40.000). I livelli di PMT vengono impostati premendo il tasto "hardware". Una volta impostato, mantenere queste impostazioni PMT costante.
3. Eseguire la scansione delle diapositive sperimentali sui due canali premendo il tasto "scan". Salvare le immagini delle diapositive (entrambi i canali) dopo ogni scansione.
4. Caricare il vetrino da analizzare nel software microarray utilizzando il tasto "file".
5. Caricare il file di elenco gene array (GAL) utilizzando il tasto "file". Il file GAL ha la disposizione della matrice con le identità delle caratteristiche della matrice.
6. Posizionare il modello di matrice sopra l'immagine digitalizzata in modo che gli array caratteristiche corrispondano il più possibile il modello come.
7. Allineare le caratteristiche di tutti i blocchi con il modello premendo il tasto "Allinea". Il programma generale, trovare il profilo delle caratteristiche circolari ma alcune regolazioni manuali può essere necessario. Queste regolazioni possono essere effettuate inserendo la modalità di funzione. Il software calcolerà un MFI-B per ciascuno degli antigeni.
8. Utilizzare il pulsante "file" per esportare i risultati come file di testo.

4. Analisi dei dati di matrice di significato analisi dei microarray (SAM)

1. Caricare file di testo singoli in Excel e identificare le colonne che hanno IFM-B per i canali Cy3 e Cy5.
2. Calcolare la media per le funzioni duplicate.
3. Per qualsiasi negazione IFM-B, sostituire il numero negativo con 10. trasformare i dati grezzi dividendo IFM-B per 100 e poi calcolando logaritmo in base 2.
4. Analizzare log dati trasformati con un significato analisi dei microarray (SAM), come descritto in precedenza ^7.
5. Per uno studio con due gruppi (ad esempio, controlli sani vs pazienti), un gruppo di etichette "1" e il gruppo "2." Utilizzare un due classi, analisi spaiato in SAM per identificare antigeni reattività che sono significantly differente tra i due gruppi (valore q <0.05).
6. Utilizzare il clustering e il calore-map generazione di software per rendere le immagini per la presentazione ^8.

Risultati

Gli antigeni sono disposti in una piastra ben 384 e stampati su vetrini da un microarrayer robotico come mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra i vetrini collocati in un telaio con camere di incubazione e uno scivolo scansionata dopo l'elaborazione. La Figura 3 mostra vetrini di controllo positivo e negativo. La slitta negativo è sondato soltanto con anticorpi secondari, ed il vetrino di controllo positivo viene sondato con siero ...

Discussione

Il protocollo qui descritto consente la quantificazione di anticorpi con la tecnica dell'antigene microarray. microarrays Antigen offrono diversi vantaggi rispetto ELISA convenzionale nello screening per autoanticorpi. Prima di tutto, una varietà di antigeni inclusi acidi nucleici, proteine, peptidi e lisati cellulari sono schierati sui vetrini nitrocellulosa rivestite, permettendo così lo screening multiplex di autoanticorpi. Inoltre, solo microgrammi di antigene sono necessari per generare le matrici dal nanolit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)