דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

Summary

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Abstract

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Introduction

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protocol

אנטיגנים מדללים 1. יצירת Microarrays Antigen

1. לדלל אנטיגנים ב PBS לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. הדפס עד 162 אנטיגנים ייחודיים כפולים עם תצורת microarrayer עם 9 פינים. כלול אנטיגנים IgG ו IgM בספריית אנטיגן בקרות חיוביות כמו. כלול PBS רק כביקורת שלילית.
2. הוסף 20 μl של כל אנטיגן 384 צלחת המקור הטובה. להוסיף אנטיגנים לצלחת מקור בקבוצות המשקפות את ההתקנה של ראש ההדפסה (למשל, לארגן אנטיגנים בקבוצות של 9 כאשר 9 פינים משמשים להדפסה).
3. צלחת מקור מכסים בנייר כסף ולהקפיא ב -80 ° C עד מוכן להדפיס מערכים.
4. נקה סיכות microarrayer מוצקות על ידי דוגר אותם באמבט sonicating עם מים ללא יונים עבור דק '3 x 1. סיכות מקום על המדף להתייבש ואז לארגן סיכות ראש ההדפסה microarray. במשך 9 סיכות, להשתמש בתצורת 3 x 3.
5. תכנית microarrayer לדפוס מנוהלת על ידי הגדרת סיכות מספר על ראש הדפסה,מספר השקופיות להדפיס, מספר כריות על כל שקופית, ואת מספר הנקודות לשכפל לכל אנטיגן. בדרך כלל, השתמש 9 פינים, 70 מגלשות, 2 רפידות / שקופיות, ו -2 נקודות לשכפל לכל אנטיגן. microarrayer תוכנית כדי sonicate סיכות במים בין קבוצות שונות של אנטיגנים.
6. צלחת מקור להפשיר ואז צלחת צנטריפוגות במשך 1 דקות ב 100 x ז. מניחים מקור צלחת במקום המיועד microarrayer. הסר את החלק של רדיד שמכסה קבוצת אנטיגנים הראשונה שיודפס.
7. מסדרים שקופיות שלא הודפסו על משטח arrayer ותוכנית הדפסה לרוץ. הדפס שקופיות ב RT עם לחות להגדיר על arrayer ב 55 - 60% עם הגרסה ב- אדים של מכונה המערך.
8. אחרי כל קבוצה של אנטיגנים מודפסת על כל השקופיות, להשהות את microarrayer. מכסה את אנטיגנים כי הודפסו רק בנייר כסף (כדי למנוע אידוי) ולחשוף את קבוצת אנטיגנים הבאה להדפסה. המשך תכנית להדפיס.
9. אחרי הכל אנטיגנים הודפסו, מקור כיסוי plאכול עם חתיכת נייר ולהקפיא חדש ב -80 מעלות צלזיוס. מניח שקופיות מודפסות תיבת שקופיות חותמת ואקום. שקופיות ניתן להשתמש למחרת או עד חודש לאחר מכן.

2. גשוש Microarrays Antigen עם מדולל סר

1. מניח שקופיות לתוך מסגרות באמצעות תאי דגירה. הוסף 700 μl של חיץ חסימה (2.5% [כרך / כרך] נסיוב עגל העוברי (FCS), [כרך / כרך] 0.1% Tween 20 ב PBS) לכל משטח מערך.
2. מניח סרט דבק מעל המסגרת ומניח במכל אטום עם פיסת הרקמה רטובה. דגירה O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה.
3. לדלל דגימות סרום 1: 100 בחסימת המאגר. לשאוב פתרון לחסימת מערכים ולהוסיף 500 μl של מדגם בדילול לכל משטח המערך.
4. מכסים עם סרט דבק דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C עם נדנדה.
5. מדולל נוגדנים משני בחסימת המאגר. עבור מחקרים בבני אדם, לדלל נוגדן IgG Cy3 שכותרתו עז נגד אדם כדי 0.33 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו Cy5 שכותרתו עז נגד הומאn IgM נוגדנים 0.25 מיקרוגרם / מ"ל. עבור מחקרים העכבר, לדלל Cy3 שכותרתו עז נגד העכבר נוגדן IgG 0.38 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו Cy5 שכותרתו עז נגד העכבר נוגדן IgM 0.7 מיקרוגרם / מ"ל.
6. לשאוב דגימות מערכים ולשטוף משטחי מערך 4 פעמים עם חיץ לשטוף (0.1% Tween 20 ב PBS). יוצקים חיץ על מנת מגלשות מכבה במהירות.
7. הוסף 700 μl של חיץ חסימת לשטוף כל משטח מערך דגירה 10 דקות ב RT עם נדנדה. צעד חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
8. הוסף 500 μl של נוגדנים משני מדוללים לכל משטח שקופית ומכסה סרט דבק. דגירה 45 דקות ב 4 ° C עם נדנדה.
9. לשאוב תערובת נוגדנים משני מן השקופיות ולשטוף 4 פעמים כנ"ל. לשטוף מחליק 3 פעמים עם 700 μl של חסימה / דילול חיץ כנ"ל.
10. סר שקופיות ממסגרות ומניחים מתלים מתכת שקופית כי הוא שקוע PBS. דגירה 20 דקות ב RT עם רעד מסלולית. מניחים במיכל החדש של PBS ו דגירה עוד 20 מ 'ב עם רעד.
11. מקום מתל שקופיות במכל של סעיף 15 מים ללא יונים. מניח מתל במכל מים חדש דגירה עוד 15 שניות.
12. לשקופיות יבשות, מתל שקופית מקום על מתאם צלחת ELISA בצנטריפוגה ספין ב 220 XG במשך 5 דקות ב RT.
13. מניח שקופיות בתיבת אור חזקה עד מוכן לסריקה.

3. Microarrays Antigen סריקה וייצוא נתונים

1. שקופיות סריקה באמצעות סורק microarray שיכולים לזהות אותות ניאון Cy3 ו Cy5. על מנת להתאים את הצינור המכפיל (PMT) הרמות של הסורק, טרום לסרוק שקופיות אשר חקרו רק עם נוגדנים משני.
   הערה: שקופית זה צריכה לכלול את ספריית אנטיגן המלאה מודפסת עליו כולל חיובי (IgG ו IgM) כמו גם שלילי שולט (PBS). The-הסריקה מראש היא סריקה ברזולוציה נמוכה המאפשרת למשתמש לאתר במהירות את גדרות PMT האופטימליות.
2. הגדר את ערכי PMT כך תכונות IgG אדם (בערוץ Cy3) ואת הזמזוםיש תכונות IgM (בערוץ Cy5) א עוצמת הקרינה מינוס רקע החציוני דומה (MFI-B) (בדרך כלל 40,000). רמות PMT נקבעות על ידי לחיצה על כפתור "חומרה". לאחר ההגדרה, לשמור הגדרות PMT אלה קבוע.
3. סרוק את השקופיות הניסיוניות על שני הערוצים על ידי לחיצה על כפתור "סריקה". שמור את השקופיות (בשני הערוצים) לאחר כל סריקה.
4. טען את השקופיות להיות מנותח לתוך התוכנה microarray באמצעות כפתור "קובץ".
5. טען את רשימת מערך הגנים (GAL) הקובץ באמצעות כפתור "קובץ". קובץ GAL יש את הפריסה של המערך עם הזהויות של תכונות המערך.
6. מניחים את התבנית מערך מעל התמונה הסרוקה כך תכונות מערכים להתאים את התבנית ככל האפשר.
7. יישר תכונות בכל בלוקים עם התבנית על ידי לחיצה על הכפתור "align". התכנית תהיה בדרך כלל למצוא את קווי המתאר של התכונות העגולות אבל כמה התאמות ידניות ייתכן שתהיינה צורך. התאמות אלה יכולים להתבצע על ידי כניסה למצב תכונה. התוכנה אז תחשב MFI-B עבור כל אחד אנטיגנים.
8. השתמש בלחצן "קובץ" לייצא את התוצאות הללו כקובץ טקסט.

4. נתוני מערך ניתוח עם ניתוח המשמעות של Microarrays (SAM)

1. לטעון קבצי טקסט בודדים לתוך Excel ולזהות את העמודות שיש MFI-B עבור ערוצי Cy3 ו Cy5.
2. חישוב הממוצע עבור תכונות כפולות.
3. עבור כל MFI-B שלילי, להחליף את המספר השלילי עם 10. Transform נתונים על ידי חלוקת MFI-B גלם ב -100 ולאחר מכן על ידי חישוב יומן בסיס 2.
4. לנתח נתוני יומן הפך עם ניתוח המשמעות של Microarrays (SAM) כפי שתואר לעיל ^7.
5. עבור מחקר באמצעות שתי קבוצות (לדוג ', אמצעי לעומת מטופלים בריאים), התווית קבוצה אחת "1" לבין הקבוצה "2." השתמש ניתוח מזווג, השנייה בינוני SAM לזהות reactivities אנטיגנים כי הם יםignificantly שונה בין שתי הקבוצות (ערך q <0.05).
6. השתמש מניב אשכולות וחום-מפת תוכנה כדי להפוך את תמונות עבור מצגת ^8.

תוצאות

אנטיגנים מסודרים צלחת 384 היטב מודפסים על גבי שקופיות על ידי microarrayer רובוטית כפי שמוצג באיור 1. איור 2 מראה שקופיות להציב מסגרת עם תאי הדגירה שקופית סרק לאחר עיבוד. איור 3 מציג שקופיות בקרה חיובית ושלילית. השקופית השלילית חקר?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר כימות של נוגדנים עצמיים באמצעות טכניקת microarray אנטיגן. microarrays Antigen להציע מספר יתרונות על פני קונבנציונאלי ELISA ב בדיקות סקר לאיתור נוגדנים עצמיים. קודם כל, מגוון רחב של אנטיגנים כולל חומצות גרעין, חלבונים, פפטידים, ו lysates תא ניתן ערוך על השקופיו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)