Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Resumo

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Resumo

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Introdução

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protocolo

1. diluindo Antígenos e gerando Antigen Microarrays

1. Diluir antigénios em PBS para uma concentração final de 0,2 mg / ml. Imprimir até 162 antígenos únicos em duplicado com uma configuração microarrayer com 9 pinos. Incluem antigénios de IgG e IgM na biblioteca antigénio como controlos positivos. Incluem apenas PBS como controlo negativo.
2. Adicionar 20 ul de cada antigénio para a placa de fonte de 384 poços. Adicionar antígenos para a placa de fonte em grupos que espelham a configuração da cabeça de impressão (por exemplo, organizar antígenos em grupos de 9, quando 9 pinos são utilizados para impressão).
3. placa fonte Cubra com papel alumínio e congelar a -80 ° C até que esteja pronto para imprimir arrays.
4. Limpar os pinos microarrayer sólidos, incubando-as num banho de ultra-sons com água desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pinos no rack para secar e em seguida, organizar pinos no cabeçote microarray. Para 9 pinos, use uma configuração de 3 x 3.
5. microarrayer Programa de impressão gerido pela definição do número de pinos na cabeça de impressão,número de lâminas de imprimir, o número de pastilhas em cada lâmina, e o número de pontos em replicado para cada antigénio. Normalmente, utilize 9 pinos, 70 slides, 2 almofadas / slides, e 2 pontos em replicado para cada antigénio. microarrayer programa para sonicate pinos na água entre diferentes grupos de antígenos.
6. placa fonte descongelar e placa, em seguida, centrifuga-se durante 1 min a 100 x g. Coloque placa de fonte no local designado na microarrayer. Retirar a parte da folha que está cobrindo o primeiro grupo de antigénios a ser impresso.
7. Organizar os slides não impressos na superfície arrayer e executar o programa de impressão. lâminas de impressão em temperatura ambiente com umidade definida no arrayer a 55 - 60% com a construção em umidificador da máquina matriz.
8. Depois de cada grupo de antígenos é impresso em todos os slides, pause o microarrayer. Cobrir os antigénios que foram impressas apenas com uma folha (para evitar a evaporação) e descobrir o próximo grupo de antigénios a ser impresso. Continue programa de impressão.
9. Depois de todos os antígenos foram impressas, fonte de cobertura de plcomeu com novo pedaço de papel alumínio e congelar a -80 ° C. Coloque slides impressos na caixa slide e selo de vácuo. As lâminas podem ser usados ​​no dia seguinte ou até um mês mais tarde.

2. Sondagem Antigen Microarrays com soro diluído

1. Coloque slides em quadros usando câmaras de incubação. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio (2,5% [vol / vol] de soro de vitelo fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 em PBS) a cada superfície de matriz.
2. Coloque película adesiva sobre o quadro e coloque em um recipiente fechado, com um pedaço de tecido molhado. Incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo.
3. Diluir as amostras de soro de 1: 100 em tampão de bloqueio. Aspirar solução a partir de matrizes de bloqueio e adicionar 500 ul de amostra diluída a cada superfície de matriz.
4. Cubra com filme adesivo e incubar durante 1 hora a 4 ° C com agitação.
5. Diluir anticorpos secundários em tampão de bloqueio. Para os estudos humanos, dilui-se um anticorpo de IgG de cabra Cy3 anti-humano marcado para 0,33 ug / ml e marcado com Cy5 de um anticorpo de cabra anti-humaN anticorpo IgM para 0,25 ug / ml. Para os estudos de rato, dilui-se uma cabra marcado com Cy3 de anticorpo IgG anti-rato a 0,38 ug / mL e um anticorpo marcado com Cy5 anti-murganho de cabra IgM para 0,7 ug / ml.
6. Aspirar as amostras a partir de matrizes e lavar superfícies de matriz 4 vezes com tampão de lavagem (0,1% de Tween 20 em PBS). Pour tampão para a slides e agite rapidamente.
7. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio para lavar cada superfície de matriz e incubar 10 min à TA com agitação. etapa de lavagem Repita mais duas vezes.
8. Adicionar 500 uL de anticorpo secundário diluído a cada superfície de deslizamento e cobrir com película adesiva. Incubar 45 min a 4 ° C com agitação.
9. Aspirar mistura de anticorpo secundário a partir de lâminas e lavar 4 vezes como acima. Lave as lâminas 3 vezes com 700 ul de tampão de bloqueio / diluição como acima.
10. Retirar as lâminas de quadros e coloque em porta-lâminas de metal que está imerso em PBS. Incubar 20 min a RT com agitação orbital. Coloque no novo recipiente de PBS e incubar mais 20 mcom agitação.
11. Lugar porta-lâminas no recipiente de água deionizada 15 seg. Coloque em rack em um novo recipiente de água e incubar mais 15 seg.
12. Para lâminas secas, lugar porta-lâminas em um adaptador de placa de ELISA em centrífuga e girar a 220 xg por 5 min a RT.
13. Colocar as lâminas na caixa à prova de luz até que esteja pronto para a digitalização.

3. A digitalização Antigen Microarrays e exportação de dados

1. Digitalizar slides usando um scanner de microarray que podem detectar sinais fluorescentes Cy3 e Cy5. A fim de ajustar os níveis de tubo fotomultiplicador (PMT) do scanner, pré-digitalizar um slide que só foi sondado com anticorpos secundários.
   Nota: Esta corrediça deve ter a biblioteca antigénio completo impresso nele incluindo positivo (IgG e IgM), bem como controlos negativos (PBS). A pré-digitalização é uma digitalização de baixa resolução que permite que o usuário rapidamente para encontrar as configurações ideais PMT.
2. Defina os valores de PMT de modo que os recursos humanos IgG (no canal Cy3) e o zumbidouma características IgM (no canal Cy5) têm um semelhante mediana intensidade de fluorescência menos de fundo (MFI-B) (tipicamente 40.000). Os níveis PMT são definidos pressionando o botão "hardware". Uma vez definido, manter essas configurações PMT constante.
3. Digitalizar os slides experimentais sobre os dois canais, premindo o botão "Scan". Salve as imagens de slides (ambos os canais) após cada digitalização.
4. Coloque o slide a ser analisados ​​no software microarray usando o botão "file".
5. Carregar o arquivo de lista de matriz gene (GAL) utilizando o botão "file". O arquivo GAL tem o layout da matriz com as identidades das características da matriz.
6. Coloque o modelo de matriz sobre a imagem digitalizada para que as matrizes características corresponder ao modelo, tanto quanto possível.
7. Alinhar recursos em todos os blocos com o modelo premindo o botão "align". O programa vai encontrar geralmente o contorno das características circulares, mas alguns ajustes manuais podem ser necessárias. Estes ajustes podem ser feitos através da introdução do modo de recurso. O software terá, então, calcular um MFI-B para cada um dos antigénios.
8. Use o botão "Arquivo" para exportar estes resultados como um arquivo de texto.

4. Analisando dados matriz com análise da significância dos microarrays (SAM)

1. Carregar arquivos de texto individuais em excel e identificar as colunas que têm MFI-B para os canais Cy3 e Cy5.
2. Calcule a média dos recursos duplicados.
3. Para qualquer negativo MFI-B, substitua o número negativo com 10. Transformar dados dividindo-primas MFI-B por 100 e, em seguida, calculando log de base 2.
4. Analisar log de ​​dados transformados com análise da significância dos microarrays (SAM), como descrito anteriormente ^7.
5. Para um estudo com dois grupos (por exemplo, controles saudáveis ​​versus pacientes), etiqueta um grupo "1" e o grupo "2." Use uma de duas classes, a análise não emparelhado na SAM para identificar os antígenos reacções que são significantly diferente entre os dois grupos (valor q <0,05).
6. Use um software de clustering e de geração de calor mapa para fazer imagens para a apresentação ^8.

Resultados

Os antigénios são dispostos em uma placa de 384 poços e impresso em lâminas por um microarrayer robótico como mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra as lâminas colocados num quadro com câmaras de incubação e uma corrediça digitalizada após o processamento. A Figura 3 mostra as lâminas de controlo positivas e negativas. O slide negativo apenas deve ser sondado com anticorpos secundários, ea lâmina de controlo positivo é so...

Discussão

O protocolo aqui descrito permite a quantificação de auto-anticorpos, utilizando a técnica de microarray antigénio. microarrays Antigen oferecem várias vantagens sobre ELISA convencional na pesquisa de auto-anticorpos. Primeiro de tudo, uma variedade de antigénios, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, e os lisados ​​celulares podem ser dispostas sobre as lâminas revestidas com nitrocelulose, permitindo, assim, para o rastreio multiplexado de auto-anticorpos. Além disso, apenas microgramas de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)